본 자료는 미국 국립 과학 재단 (DEB 번호 1021559)에 의해 지원되는 환경 연구 조정 네트워크 연구에서 효소에 의해 투자되었다. 이 연구는 미국 국립 과학 재단 (DEB 번호 1,021,559), 과학의 에너지 사무실 (생물 환경 연구)의 미 교육부에 의해 지원되었다. 이 자료에 표현 된 의견, 연구 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며, 반드시 미국 NSF의 의견을 반영하지 않습니다.

1. 분석 셋업 <ol><li> 라벨 3 깊은 우물 플레이트 : &quot;샘플&quot;, &quot;MUB 표준&quot;및 &quot;MUC 표준&quot;. </li><li> 각 표준 (0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 μM의 MUB) 및 기판 별도의 청소, prelabeled 저수지에 (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) (행 지향)을 붓고 . </li><li> MUB 표준 플레이트 (표 1)의 해당 우물에 적절한 MUB 표준을 피펫. <ol><li> MUB 표준 플레이트 행에 0 μM의 MUB의 피펫 200 μL. </li><li> 피펫 (200) MUB 표준 플레이트의 행 B에 2.5 μM MUB ㎕의. </li><li> MUB 표준 플레이트의 행 C에 5 μM의 MUB의 피펫 200 μL. </li><li> MUB 표준 플레이트의 행 D에 10 μM의 MUB의 피펫 200 μL. </li><li> MUB 표준 플레이트의 행 E에 25 μM의 MUB의 피펫 200 μL. </li><li> MUB 표준 플레이트의 행 F에 50 μM의 MUB의 피펫 200 μL. </li><li> 100 μ의 피펫 200 μLMUB 표준 플레이트의 행 G에 M의 MUB. </li><li> MUC 표준 플레이트의 해당 우물에 MUC 표준에 대한 1.3.8 - 반복 1.3.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 각각의 토양 샘플에 대한 준비 토양 슬러리. <ol><li> 믹서기에 필드 습한 토양의 2.75 g의 무게. </li><li> 50 mM의 버퍼의 91 ML을 추가합니다. 1 분 동안 높은에 혼합. </li><li> 적어도 넓은 교반 막대와 8 채널 피펫으로 깨끗한 유리 그릇에 믹서 내용을 붓는다. </li><li> 저에 토양 슬러리를 혼합, 교반 접시에 놓습니다. </li><li> 피펫 샘플 플레이트 (표 2)의 첫 번째 열으로 토양 슬러리의 800 μL. </li><li> MUB 표준 및 MUC 표준 플레이트 (표 1)의 1 차 컬럼에 반복합니다. </li><li> DI H 2 O와 믹서, 볶음 접시와 교반 막대를 씻어 또는 토양 샘플 사이의 버퍼. </li><li> 이후의 각 토양 시료 (표 1과 다음 칼럼으로 이동, 각각의 샘플에 대해) 1.4.7와 -를 반복 1.4.1 단계2). </li></ol></li><li> 샘플 플레이트 (표 2)의 해당 우물에 (이 예에서는 200 μM 농도) 적절한 기판을 피펫. <ol><li> 샘플 판의 행에 BG 기판의 피펫 200 μL. </li><li> 피펫 샘플 판의 행 B에 CB 기판의 200 μL. </li><li> 샘플 판의 행 C에 NAG 기판의 피펫 200 μL. </li><li> 피펫 샘플 판의 행 D에 PHOS 기판의 200 μL. </li><li> 피펫 샘플 판의 행 E에 XYL 기판의 200 μL. </li><li> 샘플 판의 행 F에 AG 기판의 피펫 200 μL. </li><li> 샘플 판의 행 G에 LAP 기판의 피펫 200 μL. </li><li> 각 배양 온도 샘플 플레이트 1.5.7 - 반복 1.5.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li></ol> 2. 분석 플레이트의 배양 <ol><li> 깊은 - 웰 플레이트 ( &quot;샘플&quot;, &quot;MUB 표준&quot;및 &quot;MUC 표준을 밀봉4 ;) 플레이트 매트와. </li><li> 용액이 완전히 혼합 될 때까지 손으로 각 (밀봉) 판을 반전 (~ 10 배). </li><li> 필요한 배양 기간 (표 3)에 적합한 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 시간 0으로 초기 시간을 기록합니다. 당신은 인큐베이터 (표 3)에서 접시를 제거 할 때 알 수 있도록 또한 적절한 배양 시간을 기록합니다. </li><li> 각 인큐베이션 기간 동안, 원심 ~ 2900 개의 x g에서 3 분 동안 밀봉 판의 끝에. </li><li> 인증 후, (하나의 검은 판은 각 배양 깊은 우물 플레이트에 사용됩니다) 블랙 평면 바닥 96 - 웰 플레이트에 해당하는 우물에 배양 깊은 웰 플레이트의 각 웰에서 250 μl를 전송합니다. 그것은 검은 평면 바닥 96 - 웰 플레이트에서 같은 우물 (예 : A1 ... A12 등)로 배양 깊은 웰 플레이트에서 샘플을 전송하는 것이 중요하다 (표 1, 2). </li></ol> 3. 형광 측정에마이크로 플레이트 형광 계 <ol><li> 사용 된 형광 플레이트 리더에 대한 제조 업체의 지침, 450 nm의 365 nm의 발광 파장에 여기 파장을 설정 (또는 적절한 필터를 사용)를 다음과 같습니다. </li><li> 형광 분석기에 3 개의 판을 읽어보십시오. 중요 : 샘플 및 표준 플레이트 (즉 MUB 또는 MUC)는 같은 이득을 사용하여 읽을 수 있어야합니다. <ol><li> 자동 이득에 분광 광도계를 설정하고 MUC 및 MUB 표준 플레이트를 참조하십시오. </li><li> 설정 설명서에 이득, 최적의 다음으로 낮은 숫자로 값을 감소 각 표준 플레이트에 가장 가까운 다섯 반올림. 각각의 판에 배를 반복합니다. </li><li> 자동으로 게인을 설정하고 샘플 판을 실행합니다. 표준 플레이트 (즉 MUB 및 MUC) 각각에 대한 가장 높은 이득에 맞게 수동으로 샘플 판을 다시 실행하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> MUB에 대한 스프레드 시트로 표준 곡선 형광 데이터를 입력합니다 (표 4A) 및 MUC 표준 (표 4B) <ol><li> (μmol)을 (μM)의 농도 변환 (표 4a 및도 4b). </li></ol></li><li> 각 샘플의 표준 곡선 형광 데이터의 경우, 기울기, y 절편, 및 R MUB 및 MUC (μmol) 표준 농도에 2 값을 계산합니다. 사용 가능한 R 2 값은 각 샘플에 대한 0.98을 초과한다 (표 4a 및도 4b). 형광 종속 변수 (y 축) 및 표준 농도 (μmol) 독립 변수 (X 축) (그림 1)과 같이 플롯으로 플롯 읽기와 함께, 그것은 산점도 표준 곡선을 시각화하는 것이 유용 할 수 있습니다. </li><li> 당신은 잠재적 인 EEAs에 샘플 + 기판 원시 형광 데이터를 계산하는 MUB 및 MUC 표준 곡선의 기울기와 y 절편 값을 사용합니다. 먼저 새로운 스프레드 시트에 샘플 + 기판 원시 형광 데이터를 입력 (표 5A합니다 </strong&gt;). 또한 각 샘플에 대한 배양 시간 (h) 및 토양 건조 중량 (표 5B)를 입력해야합니다. 샘플은 25 ° C (표 3)에서 배양 되었기 때문에이 예에서 입력 한 시간 값이, 3 시간이며, 주. <ol><li> 해당 샘플의 형광 값의 표준 곡선의 절편 값을 빼기 후 해당 표준 곡선 (표 5C)의 경사에 의해 나눕니다. [Y = 샘플 형광 원시 읽기, MUB 또는 MUC 표준 곡선에서 B = 절편, m = MUB의 기울기 : X = (YB) / M,이 작업을 수행하기 위해 샘플 효소 농도 (X)을 해결하기 위하여 표준 라인 방정식을 재 배열 또는 MUC 표준 곡선]. </li><li> 91 ㎖ (토양 슬러리에 사용 된 버퍼의 양) (표 5D)에 의해, 위의 단계 4.3.1에서, 샘플 μmol를 곱합니다. </li><li> [효소 AMT : 분할 값은 샘플 특정 배양 시간 및 건조 토양 질량 (표 5E)에 의해 단계 4.3.2에서 획득. (&amp; #956; 몰) ML X 1,000 × 0.8 91 ML의 X 보육 (시간이) 건조한 토양 (g) × X] 참고 : 0.8 ㎖를 각 웰에 사용되는 슬러리의 양이며, 1000 각 웰의 실제 토양 금액을 수정합니다. </li><li> 원하는 단위 (nmol의 활동 / g 건조 토양 / 시간) (표 5 층)을 얻기 위해 1,000에 의해 단계 4.3.3에서 얻은 값을 곱합니다. </li></ol></li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

잠재적 인 토양 EEAs의 실험실 기반의 측정은 생태계의 기능에 중요한 자신의 비 생물 적 환경에 대한 미생물의 반응에 대한 통찰력, 그 결과를 제공 할 수 있습니다. 이 예제 데이터 세트의 결과는 최소한의 차이가 기후 처리 플롯 사이 토양 효소의 활동이나 반응 속도에 존재하는 것이 좋습니다. 그러나, 플롯 사이에 역 추세는 토양 수분, 토양의 pH 또는 식물 성장 등의 미생물 EEAs의 생산에 영향을 미칠 수있는 공변량의 추가 조사를 바랍니다. 전반적으로, 토양 (1) 전체적인 EEA, (2) EEA 화학량 (3) 아 레니 우스 플롯 / 활성화 에너지, 및 (4) Q 10은 에코 레벨 프로세스를 나타낼 수있다 접근법의 넓은 스펙트럼을 제공의 측면에서 EEAs을 평가 견고 토양 생태계 기능 역학의 특성을있는. 높은 처리량의 형광 기반의 유럽 경제 분석은 널리 토양의 잠재적 EEAs을 검사하는 데 사용되는 유용한 도구다른 환경. 중요한 것은, 잠재적 인 활동은 효소 풀 크기를 반영하고, 스스로 효소 생산 매출 비율 46의 양을하지 않습니다. 기술은 비교적 간단하지만, 실험실 프로토콜 사이에 겉으로는 약간의 차이가 결과 (13)의 비교를 방해 할 수 있습니다. 불행하게도, 우리는 현재 EEAs에 적합한 표준화 된 양성 대조군이 없습니다. 화학 양론 비의 사용은 이러한 문제를 극복하기위한 하나의 접근 방법이다. 그렇지 않으면, 높은 처리량 기술의 출현은 환경 소재 효소의 연구를 진행했다. 이러한 분석법에 의해 생성 된 데이터의 신중한 해석 미생물 활성의 중요한 경향을 명료있다. 프로토콜의 안정성은 개별 샘플에 특정 조건을 선택할 수있는 능력에서 유래하지만,이 또한 제한 될 수 있습니다. 변형 시리즈 샘플이 정확하게 측정되도록해야 할 것이다<html> 개별 필드 사이트 : 완충기 당신이 선택하는 버퍼는 토양의 pH에​​ 따라 달라집니다. 버퍼링은 27,47 높은 산도 의존 형광 표준의 형광 강도를 안정화시킨다. 샘플의 pH 레벨 - 우리가 일반적으로 토양 슬러리를 만들기 위해 사용하는 pH 완충는 베스트 매치 토양 버퍼의 특정 산 해리 상수 (pKa가)에 대해 선택된다하는 50 mM 소듐 아세테이트 또는 트리스 완충액이다. 나트륨 아세테이트 4.76의 pKa를 가지며, 트리스 8.06의 pKa가 마련되어 있으므로 이들 두 버퍼의 양이 각각의 샘플에 대해 소망의 pKa에 도달하기 위해 변화 할 것이다. 인산 버퍼 (의 pKa ​​= 7.2) 중립 / 약간 기본 토양을 위해 제안되었다. 그러나, 우리는 높은 인산염 농도가 효소 활성을 방해 할 수 있으므로,이 버퍼를 사용하기 전에 예비 연구에서 분석 변동성을 테스트하기 위해주의. 형광 기판의 취급 및 저장 방법 jove_content &quot;&gt; 형광 분석은 빛에 노출되면 불순물 및 / 또는 여러 형광 화합물의 불안정성에 의한 간섭으로 고생 할 수 있으므로 형광 기판을 처리 할 때주의가 필요합니다. 우리는 강력하게 형광 기판과 MUB 및 MUC 기준을 표시 할 수있는 빛의 노출을 최소화하는 것이 좋습니다 . 호박색 유리 병을 사용하거나 형광 기판과 표준을 만들고 저장하는 데 사용되는 유리 용기를 커버하는 것이 좋습니다, 유리 및 용기 포장에 알루미늄 호일은 잘 작동 마찬가지로 효율적으로 번호판을 접종하고 어두운 창업 보육 센터에 전송하는 가장 좋은 방법은 우리가하는 것이 좋습니다.. (-20 ° C)에 대한 더 이상 2 개월 (빛으로부터 보호하면서) 기판과 표준을 저장하고, 해동 기판 (5 ° C) ~ 전에 효소 분석 (들)을 시작으로 24 ~ 48 시간. 디자인 및 복제 뿐만 아니라 샘플 변화에 negativ 구현하기위한 최선의 계정에전자 분석 컨트롤과는 분석 복제 (가능이있는 경우)을 추천합니다. 변이는 전형적으로 각 웰에있는 토양 입자의 양의 차이와 피펫 팅의 오차로 발생한다. 따라서, 강한 혼합과 좋은 피펫 팅 기술은 실질적으로 잘 변화에 잘 최소화 할 수 있습니다. 또한, 우리는 강력하게 시간이 지남에 따라 기판의 일관성을 모니터링하는 음의 분석 제어 (버퍼 + 기질 용액)을 구현하는 것이 좋습니다. (우리는 일반적으로 96 - 웰 플레이트 상에 마지막 열을 사용하여) 음성 대조군 웰과 비교하여 효소 플레이트를 읽을 때 이는 쉽게 모니터링 할 수있다. 네가티브 기판 컨트롤 따라서 확실히 검출 한계 이상 신호가 증가, 그것은 기판 및 / 또는 표준 용액의 보충을 필요로하는, 오염 또는 기판 불안정성 나타낸다 전형적 안정하다. 다른 프로토콜은 한 종류의를 수행하지만 처리량을 최대화하기 위해, 우리의 프로토콜은 하나의 깊은 우물 마이크로 플레이트에 몇 가지 잠재적 인 EEAs을 포함다른 EEAs 이후 판 (플레이트 당 즉, 하나의 기판) 당 분석은 서로 다른 속도로 발생합니다. 에 관계없이, 효소 최적화 방법 또는 단판 방식을 통해 높은이를 수행하기 전에 토양에서 수행해야합니다. 반응 속도는 배양 기간 내에 각 효소에 대해 상대적으로 일관성있는 경우 다중 기판은 단판에 사용될 수있다. ~ 1g 다른 프로토콜 (24)에 추천 동안 우리의 프로토콜은, ~ 슬러리 용액을 2.75 g의 토양을 권장합니다. 우리는 더 많은 토양 (가능한 경우)를 사용하여 내 샘플 효소 활성 수준의 토양 변화 잘 포착 할 수있는 효과적인 방법입니다하는 것이 좋습니다. 다른 사람은 기판의 50 μL와 토양 슬러리 200 μl를 배양하는 동안이 프로토콜에서는, 우리는 200 μL 기판과 토양 슬러리 800 μl를 품어. 이것은 단순히 궁극적으로 측정 활동을 변경하지 않는 것을 업 스케일링 기능입니다. 실제적인 장점도 있습니다큰 볼륨을 사용하십시오. 하나는, 그것은 형광 분석기에 강도를 촬영하기 전에 블랙 평면 바닥 96 - 웰 플레이트 대응에 피펫 팅하는 동안 토양 입자를 방지하는 것이 더 쉽습니다. 효소 관련 형광 강도를 기록하기 전에 형광 분석기에 검은 색 바닥이 평평한 96 - 웰 플레이트를 전송하는 동안 둘째, 추가 볼륨이 실수로 유출하는 경우에 유용합니다. 볼륨도 약간의 편차가 크게 우물 사이에서 형광을 감소합니다. 마지막으로,이 때문에 프로토콜의 높은 처리량 자연, 우리는 일반적으로 오히려 분석은 복제 수행하는 것보다 효소 활성 수준의 변화를 표현하기 위해 실험적인 복제에 의존 선출. 항상 분석은 복제를 포함하는 가장 좋은 방법이지만, 실제로, 우리는 우리의 프로토콜은 제한된 자원 주어진 분석 및 실험은 복제 사이의 균형 균형을 제공합니다 생각합니다. 마찬가지로, 우리의 접근 방식은 내재하는 분석 (25) 당 상대적으로 더 잘 균질화 토양 (2.75 g)을 사용하여ntly 내 토양의 변화 감소한다. 분석 복제물을 사용하는 결정은 신중하게 예비 연구 (48)에 분석 오차를 테스트하여 고려되어야한다. 그러나, 우리는 4 개 미만 치료 그룹은 복제와 실험적인 디자인이 강하게 분석을 복제 사용을 고려해야하는 것이 좋습니다. 토양, 버퍼 볼륨 및 기질 농도 최적화 토양 버퍼 : 기판 농도비는 효소 분석을 수행 할 때 강하게 형광 측정에 영향을 미치는 중요한 변수이다. 슬러리 중의 토양의 양을 검정 또는 기판의 농도는 토양 샘플에서 효소의 활성에 따라 조정해야 할 수도 덧붙였다. 이 예를 들어 선택한 금액이 그 기판의 가용성이 우리가 분석 조건 (V 최대)에서 최대 잠재력 속도를 측정 한 것을 비 제한적인 되었나요 보장하기 위해 이러한 토양의 이전의 테스트를 기반으로했다 44,45. 그러나, 효소의 높은 농도가 토양 샘플에 대해, 토양 기질 농도의 양이 증가되어야한다. 우리는 기질 농도가 증가 (및 그에 따라 표준 곡선을 조정하기) 곡선의 선형성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 발견 하였다. 따라서, 우리는 필요에 따라 볼륨을 버퍼링하는 토양의 양 및 / 또는 비례 조정을 줄이는 것이 좋습니다. 상관없이, 그것이 측정 EEAs 포화 및 서브 포화 기질 농도 (26) 사이의 큰 강도의 순서에 따라 다를 수 있기 때문에, 각 정량 토양 유형에 대한 기질 농도를 최적화하는 것이 중요하다. 따라서 실험먼트 (등) 간의 차이는 유형 II 통계 오류 및 하위 포화 조건에서 검출 될 가능성이 적습니다, 통계 오류 27,35에 감염 될 수 있습니다. 기질 농도를 최적화하기 위해, 예비 효소 분석법은 기질 농도의 넓은 범위를 사용하는 대표적인 토양 샘플에서 수행한다. 후형광을 기록하는 것은, 단순히 (마찬가지로 표준 곡선을 실시 예,도 1)의 데이터를 플롯 활성 (Y 축) 효소 대응 기질 농도 (x-축)를 식별하는 곳에 경사 레벨 오프 (~ 0). 마찬가지로, 경사 레벨 오프 (~ 0) 특정 토양에 대한 최적의 기질 농도의 좋은 지표 인 점에 대응하는 기질 농도. 이 분석은 궁극적 효소 - 중재 기판 해중합의 결과로서 기판으로부터 절단되고 형광 부분에 의해 생성 된 관련 시간에 따른 형광을 측정한다. 그 때문에, 5 단계 (기판 가산) 중요하며 기판 토양에 첨가 될 때 분석법이 인큐베이션 때 사이의 시간을 최소화하기 위해 가능한 효율적으로 수행되어야한다. 기판 샘플과 접촉하면 마찬가지로, 효소 반응이 발생하기 시작합니다. 우리는 멀티 채널을 사용하는 것이 좋습니다이러한 이유로 피펫. 그것은 강력하게 이전에 하루에 당신이 당신의 효소 분석을 수행하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 효율적으로하는 것이 좋습니다. 당신은 쉽게 피펫으로 96 - 웰 플레이트에 볼륨을 전송할 수있을 때까지이 작업을 수행하기 위해, 당신은 물을 피펫 팅을 연습 할 수 있습니다. 토양 담금질 담금질은 토양 슬러리 - 배양 26, 분진 및 / 또는 유기 물질에 의한 형광 강도의 감소를 의미한다. 버퍼 비율 25 : 소광 토양을 조정함으로써 영향을받을 수있다. 때문에 각각의 샘플에서 배경 형광, 그것은 배경 (담금질) 형광을 설명하는 샘플 표준을 실행하는 것이 중요합니다. 일부 프로토콜 신호가 선형 것을 테스트 한 후 하나의 농도를 사용하지만, 우리는 강력하게 냉각의 영향에 가장 컨트롤에 각각의 샘플에 대한 표준 담금질 제어를 구현하는 것이 좋습니다. 이렇게하지 ​​않으면 서 발생합니다샘플에 적용 할 수없는 ARD 곡선, 그리고 효소 활동의 잘못된 추정. 또 표준 샘플의 형광 배경에 영향을주지 않는 한 토양 슬러리에 표준의 추가는, 시간에 민감하지 않다. NaOH를 추가 NaOH를 첨가 합성 기질로부터 방출 형광 염료&gt; pH에서 9.0 26,49을 피크 형광을 나타내는 형광 때문에 효소 활성 측정을 최적화하기 위해 어떤 프로토콜이 사용된다. 이 제안을 고려할 때, 토양 슬러리의 pH (즉, pH를&gt; 15까지)에 필요한 수산화 나트륨의 농도는 특히 토양에 의존 될 것이다 pH 완충 26을 사용했다. 그러나, 다른 신호의 강도가 더 낮은 pH에서 일반적으로 매우 높고, 때문에 측정 오차의 추가 소스를 도입하기 때문에 수산화 나트륨이 필요하지 않을 수 있다고 주장한다. 예를 들어, 슬러리의 pH 따라서 MU​​B 또는 MUC fluore에서의 NaOH의 첨가 효과시간 25 내려와 변경. 최대 60 분 (26)에 형광을 감소 MUC 꾸준한 시연하면서, MUB 연결 기판 레벨은 테이퍼 전에 수산화 나트륨의 추가에 따라 20 분 동안 일관된 증가 형광을 설명하기 위해 표시되었습니다. 따라서, NaOH를 첨가하고 형광 측정의 시간을 표준화하는 것이 중요하다. 형광 수준의 NaOH를 첨가하지 않고 분석을 수행하는, 첨가하지 않고 충분히 검출되는 경우 또는, 동등하게 허용 가능한 대안 26로서 제시되었다. 온도 배양 온도를 결정할 때 온도 감도가 고려되어야한다. 주요 관심사는 도시 된 바와 같이 (결과 섹션에서) 아 레니 우스 플롯을 사용하여 세 개 이상의 온도를 사용하여, 효소 반응 속도론을 승낙하는 경우 강력한 방법이다. 샘플 사이트는 다음 영구 동토층의 토양, duratio 같은 특징적으로 저온이있는 경우배양 n은 추운 배양 온도에서 반응하는 효소를 허용하도록 확장해야 할 수도 있습니다. 기존의 효소 반응 속도는 온도의 증가는 증가 된 효소 활성 될 것을 제안하는 동안, 우리는 효소가 온도 감도 (50)의 측면에서 특정 사이트가 될 수 있다는 것을 발견했다. 따라서 부위 특이 적 효소 활성 전위를 이해하기 때문에 배양 온도 및 지속 시간은 필드 위치 값을 반영하도록 조정하는 것이 중요하다. 결론 EES는 토양에서 생지 화학 과정의 중요한 드라이버이며, 따라서 우리는 그들의 활동을 측정 할 수 있어야합니다. 간섭 억제 등의 토양에서 EEAs을 측정하는 많은 도전이 있습니다. 이러한 어려움에도 불구하고, (여기서 설명 된 것과 같은) 표준 프로토콜은 보편적 효소의 광범위한 EEAs을 측정하기 위해 적용될 수있다. 그것에서보기 이러한 프로토콜 다음의 품질 데이터를 생성하기 위해 매우 쉽지만생태 학적 맥락에서이 데이터의 terpretation는 이러한 분석을 실제로 측정하는 것을 신중하게 고려를 필요로하는 방법과 분석 조건에서 EEAs는 현장 조건에 따라 다를 수 있습니다.

토양 박테리아, 곰팡이 및 고세균에 의해 생산 세포 외 효소 (EES)는 수많은 생지 화학 과정에 참여하고, 처리, 안정화 및 육상 생태계 1 토양 유기물 및 영양 순환의 불안정의 중심에 있습니다됩니다. EES를 생산함으로써, 토양 미생물이 분해하여 식물과 미생물이 토양에서 제공 영양소를 동화 할 수 있습니다 이전에 결합 마이크로 및 다량 영양소를, 해방, 작은 수용성 분자에 고분자 유기 물질을 변환 할 수 있습니다. 직접 효소를 감지하고 정량화하는 것은 매우 어렵 기 때문에 스미스는 주로 실험실 분석 2-4에서 자신의 활동을 측정하여, 수십 년 동안 연구되어왔다. 세포 외 효소 활성 (EE​​A)을 가장 강하게 효소와 해당 기판의 농도에 의해 제어된다. 의 풍부한 다른 C-, N-및 토양에서 P-분해 효소는 여러 요인에 의해 제어되고 난미생물 바이오 매스, 지역 사회 조성, 기판 가용성, 미기후 및 화학 양 론적 요구 5,6 ncluding. 그러나 토양 환경 내의 동일계 EEAs도 크기, 기판 가용성의 관점에서, 온도가 7,8, 토양 점토 및 부식 성질이 효소의 결합, 그리고 궁극적 활성 효소 풀 조절 확산 제약 09 의해 영향 및 이직률 10-12. 다른 환경 사이트에서 토양 미생물의 기능을 해석하는 실험실 효소 분석을 사용하는 경우 따라서, 현장 토양 조건에서 인정하는 것은 중요합니다. EEA의 많은 다른 클래스 (자세한 내용은 &quot;시약 표 목록&quot;을 참조하십시오) 합성 다양한 기판을 사용하여 실험실 분석을 정량화 할 수있다. 일부 프로토콜은 w, 분광 광도계로 검출 할 수있는 비색 반응에 결합되어있는 기질 분석법을 이용우리는 형광 부분에 바인딩 된 기판을 사용, 여기에서 설명하는 프로토콜을 포함 hile 다른 사람. 형광 EE의 분석은 일반적으로 비색 분석보다 (크기 순서에 의해) 더 민감 (합성 기판과 연결된 발색 부분을 사용하는) 12-14. 하나는 그 화합물의 양에 관련이 검출 된 가장 낮은 검출 가능성이 효소 활성에 다른 관련 : EEA의 검출 감도는 두 가지 측면을 포함한다. 비색 P-니트로 페놀을위한 방법 (PNP) 기반의 분석은 과거에서 찾을 수는 (15, 16)를 작동합니다. 간단한, 토양에 최적의 또는 필드 관련 온도와 pH에서 배양된다 (일반적으로 &lt;2mm 공기 건조가로 체질). 방출 반응 생성물을 분광 광도계 (14)로 색도계 결정되는 비율. 형광 효소 분석법의 감도가 높을 SUBSTR과 관련된 형광 잔기 분리 민감한 검출에 부분적으로 기인특정 파장에서 특정 발색 부분의 분리 후 분해보다는 기록 흡광도를 먹었다. 이 가장 일반적으로 사용되는 합성 형광 지표 4 - 메틸 움 (MUB) (17) 및 7 - 아미노 -4 - 메틸 쿠마린 (MUC) 18,19이다. MUC-연결된 기판은 일반적으로 단백질 및 / 또는 아미노산 등 N 풍부한 합성 기판과 연결되어 있습니다. 형광 기법은 먼저 수생 샘플 (20, 21)에 대한 개발 및 토양에 자신의 응용 프로그램은 신호 냉각 및 간섭 (22, 23)에 대한 컨트롤을 필요로했다. 시험 법 중 하나를 수행 할 수 있습니다 대량의 전통 &quot;벤치 탑&quot;화학을 사용하여 수행 할 수 또는 처리량이 증가하지만, 가능성이 높은 측정 오류와 함​​께, 마이크로 기반 프로토콜에 사용할 수있다. 토양 24 EEAs의 형광 검출을위한 몇 가지 널리 인용 프로토콜이 있지만, 많은 실험실은 종종 실수 나 때문에 차에,이 프로토콜에 미묘한 변화를 고용실험실 장비 또는 시약에의. 프로토콜의 세부 사항에 겉으로는 작은 차이는 강하게 EEAs (25), (26)을 측정에 영향을 줄 수있는 표준화 된 효소의 부족은 다른 실험실 간의 분석을 보정하기에 도전합니다. 따라서, 유럽 경제 분석의 표준화를 장려하기 위해 상세한 프로토콜의 보급을위한 중요한 필요가있다. 우리의 프로토콜에서 토양 시료의 pH 버퍼와 토양 샘플을 결합하고 믹서로 균질화에 의해 준비가되어 있습니다. 슬러리는 다음의 형광 표지 비 제한적인 양의 접종 C-, N-또는 P-풍부한 기판, 관심있는 특정 연구 질문에 따라 선택. 효소 분석법에 토양 슬러리를 사용하여 기판 확산 제한을 최소화하기 위해 제어로서 기능한다. 형광 잔기는 이들이 각각의 기판에서 쪼개 질 때까지 급냉하고, 형광 염료가 기판 (B)로부터 방출 될 때, 따라서 효소 활성을 검출 할 수있다Y 효소 - 촉매 반응. 시간을 통해 증가하는 형광 강도는 효소 - 촉매 반응의 속도를 반영한​​다. 형광 효소 분석의 일반적인 개념은 형광 부분 (형광 염료)와 결합 합성 기판을, 토양 시료 27에 추가 된 것입니다. 효소 - 촉매 기질 분해 도중, 본드는 형광 염료와 기판 사이 나누기. 기판으로부터 해방 된 형광 염료는 결과적으로 효소 활성의 간접적 인 평가로 사용하고, 염료의 형광 강도를 검출하는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 정량화 될 수있다. 해방 된 염료가 다른 파장의 빛을 흡수 한 후 1 파장의 빛을 방출로 요약하면, 형광 정량을 수행 할 수 있습니다. 형광 강도의 여기 및 검출 가능한 양의 플레이트 판독기에 의해 기록된다. 효소 활동 이후에 알려진 형광 염료 conce을 기준으로 정량화 할 수있다분석 (즉, 4 - 메틸 움 (MUB) 또는 7 - 아미노에 사용되는 기판의 특정 형광 부분에 대한 형광 강도의 표준 희석 곡선을 참조와 함께 기판 (합성 기판의, 즉 공지 된 양이 토양 시료에 첨가)의 ntrations -4 - 메틸 쿠마린 (MUC)). (효소 활성의 정량에 대한 세부 사항은 프로토콜 섹션을 참조하십시오). 실험실 토양 효소 분석은 미생물 군집의 기능을 평가하는 데 유용하지만, 사용자가 10을 인식해야 할 몇 가지 기술적 인 한계가있다. 형광 분석은 빛에 노출되면 불순물 및 / 또는 여러 형광 화합물의 불안정성에 의한 간섭으로 고생 할 수 있으므로 형광 기판 25을 취급 할 때주의가 필요합니다. 토양 슬러리의 토양 입자 및 / 또는 유기 물질은 또한 냉각 효과 26로 알려진 형광 강도, 방해 할 수 있습니다.또한, 실험실 효소 분석 실험은 실험실 조건에서 잠재적 EEAs을 평가한다. 체외 분석 기판의 확산과 풍요를 비 제한되는 상황에서 EEAs을 측정합니다. 따라서 이러한 분석에 의해 제공된 데이터는 동일계 토양 조건 하에서 10 EEAs위한 좋은 프록시 수 없습니다. 전반적으로, 효소 활성은 토양 유형이 유사하는 상대 비교에 매우 유용합니다. 물리적 또는 화학적 특성에 차이 토양 구비 활동과 비교하기 위해이 방법을 사용하는 경우에는주의가 사용되어야한다. 이것은 토양 유형 및 온도 차이가 비약적 시츄 효소 운동학에서의 상태를 변화시킬 수 있다는 사실 때문이다. 또 다른 한계는 상대적으로 적은 기판 (자연 환경에 비해) 상업적으로 사용할 수 있다는 것입니다. 또한, 효소 분석에 사용되는 합성 기판은 정확하게 현재 또는 이용하실 토양 기판을 표현하지 않을 수 있습니다 (쉽게 용해) 상대적으로 간단합니다현장에있는 전자. 고려해야 할 또 다른 요소는 토양 슬러리를 사용하여 현장 조건 2에서 활성화되지 않을 수도 있습니다 (즉, 유기물 또는 점토로 고정 된) 일부 안정화 효소의 활동을 통합하는 것입니다. 실험실 효소 분석은 토양 (효소 회전율) 또는 토양 효소를 생산하는 특정 미생물 종에 대한 정보에있는 효소의 지속성에 관한 정보를 제공하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents: &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &amp;alpha;-D-glucopyranoside (AG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9766</td><td>Sugar degradation</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &amp;beta;-D-glucopyranoside (BG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3633</td><td>Sugar degradation</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &amp;beta;-D-cellobioside (CB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6018</td><td>Cellulose degradation</td></tr><tr><td>L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (LAP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2145</td><td>Protein degradation</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl N-acetyl-&amp;beta;-D-glucosaminide (NAG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2133</td><td>Chitin degradation</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl phosphate (PHOS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8883</td><td>Phosphorus mineralization</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl-&amp;beta;-D-xylopyranoside (XYL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7008</td><td>Hemicellulose degradation</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone (MUB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>7-Amino-4-methylcoumarin (MUC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9891</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Sodium acetate anhydrous buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>acidic and neutral soils</td></tr><tr><td>50 mM Tris base buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>basic soils</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware disposable pipetting reservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-65</td><td>pipetting reservoir</td></tr><tr><td>Electronic; Eppendorf Xplorer; 8-channel</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-684-265</td><td>8-channel pipette, range: 50-1,200 &amp;mu;l</td></tr><tr><td>TipOne 101-1,250 &amp;mu;l extended length natural tips</td><td>USA Scientific</td><td>1112 - 1720</td><td>10 racks of 96 tips (960 tips)</td></tr><tr><td>Hotplate; heating surface: 10 in x 10 in.</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td>Lab disc magnetic stir plate</td></tr><tr><td>Waring blender</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-509-7P</td><td>Two-speed; 1 L (34 oz) stainless steel container</td></tr><tr><td>BRAND Dispensette III bottle-top dispensers</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-688-231</td><td>Dispenser; range: 5-50 ml</td></tr><tr><td>Wheaton Unispense &amp;mu;P peristaltic pumps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683-7</td><td>Optional dispenser</td></tr><tr><td>Fisherbrand magnetic stir bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>1451363SIX</td><td>Used to stirr soil slurry afer blending</td></tr><tr><td>Pyrex glass bowls</td><td>World Kitchen</td><td>5304218</td><td>Pyrex 10 oz rimmed custard cup</td></tr><tr><td>Costar 96-well black solid plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td>Used for plate reader step</td></tr><tr><td>Costar 96-well assay blocks</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-700</td><td>V-bottom; 2 ml; sterile</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 96-well cap mats</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-93</td><td>Sterile 96-well cap mat for square wells</td></tr><tr><td>Centrifuge equipped with holders for deep-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3121</td><td>Centra-GP8 (this model is no longer available)</td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 series multifunctional microplate reader</td><td>Tecan</td><td>30016058</td><td>Plate reader (this model is no longer available)</td></tr></tbody></table>

high-throughput fluorometric measurement of potential soil extracellular enzyme activities

토양과 다른 환경에있는 미생물은 에너지와 영양소 흡수 할 수 있도록 유기 고분자를 탈 중합 및 가수 분해하는 세포 효소를 생산하고 있습니다. 토양 미생물의 효소 활성을 측정하는 것은 토양 생태계 기능 역학을 이해하는데 매우 중요하다. 형광 효소 분석의 일반적인 개념은 합성 C-, N-, 또는 형광 염료와 결합 P 풍부한 기판을 토양 샘플에 추가 된 것입니다. 때 그대로 표시 기판은 형광을하지 않습니다. 효소 활성은 형광 염료가 그들을 형광을 할 수 있도록 자신의 기판에서 분해 될 때 형광의 증가로 측정된다. 효소 측정은 몰 농도 또는 활성의 단위로 표현 될 수있다. 이 분석을 수행하기 위하여, 토양 슬러리의 pH 완충액으로 토양을 결합하여 제조된다. pH 완충 (일반적으로 50 mM의 아세트산 나트륨, 50 mM 트리스 완충액)는, 제일 토양 SA 일치하도록 버퍼의 특정 산 해리 상수 (pKa를) 선택됩니다엠플 산도. 토양 슬러리의 찬란 (즉, C-, N-또는 P-리치) 기판 표시 비 제한적인 양의 접종. 분석에서 토양 슬러리를 사용하면 효소와 기질의 확산에 대한 제한을 최소화하는 역할을한다. 따라서, 기판 제한의 차이, 확산 속도 및 토양 pH 조건이 분석 컨트롤, 따라서 (샘플 당) 효소 농도의 차이의 함수로 잠재 효소 활성 속도를 검출. 형광 효소 분석은 일반적으로 분광 (즉, 색채) 분석보다 더 민감 하나, 불순물과 빛에 노출 많은 형광 화합물의 불안정성에 의한 간섭으로 고생 할 수 있습니다, 그래서 형광 기판을 처리 할 때주의가 필요합니다. 기판을 제한하지 않을 때 마찬가지로,이 방법은 실험실 조건 하에서 전위 효소 활성을 평가한다. 크로스를 나타내는 데이터를 해석 할 때주의 표기동일계 토양 유형 및 온도와 같은 상이한 온도 나 토양 유형과 현장 비교는 효소 동력학에 영향을 미칠 수있다.

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

토양 세포 외 효소 활성의 잠재적 인 속도를 측정하기 위해 형광 염료에 바인딩 된 합성 기판은 토양 샘플에 추가됩니다. 형광 염료는 높은 형광 이상의 기판을 나타내는 분해 효소 - 촉매 반응에 의해 기판으로부터 방출 될 때 효소 활성을 측정한다.

잠재적 인 토양 세포 외 효소 활동의 높은 처리량 형광 측정 측정

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

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Research

JoVE Journal

Environment

46.4K 조회수.  Colorado State University.  토양 세포 외 효소 활성의 잠재적 인 속도를 측정하기 위해 형광 염료에 바인딩 된 합성 기판은 토양 샘플에 추가됩니다. 형광 염료는 높은 형광 이상의 기판을 나타내는 분해 효소 - 촉매 반응에 의해 기판으로부터 방출 될 때 효소 활성을 측정한다. 

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

연구

환경과학

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

소설 불용성 발색 기질 분석 키트를 사용하여 탄수화물 분해 효소의 높은 처리량 검열

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

생화학

Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to characterize. However, to understand the thermodynamic and kinetic controls on greenhouse gas (carbon dioxide [CO2] and methane [CH4]) production resulting from the decomposition of NOM, a molecular-level characterization coupled with microbial proteome analyses is necessary. Further, climate and environmental changes are expected to perturb natural ecosystems, potentially upsetting complex interactions that influence both the supply of organic matter substrates and the microorganisms performing the transformations. A detailed molecular characterization of the organic matter, microbial proteomics, and the pathways and transformations by which organic matter is decomposed will be necessary to predict the direction and magnitude of the effects of environmental changes. This article describes a methodological throughput for comprehensive metabolite characterization in a single sample by direct injection Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS), gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and proteomics analysis. This approach results in a fully-paired dataset which improves statistical confidence for inferring pathways of organic matter decomposition, the resulting CO2 and CH4 production rates, and their responses to environmental perturbation. Herein we present results of applying this method to NOM samples collected from peatlands; however, the protocol is applicable to any NOM sample (e.g., peat, forested soils, marine sediments, etc.).

This protocol describes a single throughput for complementary analytical and omics techniques culminating in a fully-paired characterization of natural organic matter and microbial proteomics in different ecosystems. This approach permits robust comparisons for identifying metabolic pathways and transformations important for describing greenhouse gas production and predicting responses to environmental change.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

Natural organic matter (NOM) is composed of a highly complex mixture of thousands of organic compounds which, historically, proved difficult to ...

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.

토양의 2차원 시각화 및 래빌, 무기 식물 영양소 및 오염 물질의 정량화

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

생물학

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

멀티 효소 높은 처리량 유전자 효소 검사 시스템을 사용하여 상영

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Source: Hlozkova K. et al. <a href="https://www.jove.com/t/58426">Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

Source: Hlozkova K. et al. Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (2018).
This protocol provides a biochemical ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

암 연구학

Leukemia

In vitro techniques & assays

Chromogenic Polymer Hydrogel-Based Enzyme Screening Assay: A High Throughput Method to Screen the Carbohydrate-Active Enzymes Using Synthetic Substrates

Source: Sch&#252;ckel, J., et al. <a href="https://www.jove.com/v/54286">High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits.</a> J. Vis. Exp. (2016).
In this video, we demonstrate a high throughput assay for carbohydrate-active enzyme screening using insoluble chromogenic polymer hydrogel substrates. The enzyme degrades these substrates into a soluble colored product that can be quantified by measuring the color intensity of the product.

발색 고분자 하이드로겔 기반 효소 스크리닝 분석: 합성 기질을 사용하여 탄수화물 활성 효소를 스크리닝하는 고처리량 방법

Source: Sch&#252;ckel, J., et al. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. ...