המחברים מודים גילברט ירוק לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIAMS / NIH (R01-AR060484) ומשרד ההגנה אמריקאי (W81XWH-12-1-0,555) הוענק לSMY, ומ-NIH (CA92871 U24 וU54 CA151838) הוענקו לMGP

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בג&#39;ונס הופקינס. 1. אינפרא אדום קרוב (NIR) דימות פלואורסצנטי של שלד קולגן שיפוץ בvivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום והפעלה של ההזרקה לוריד CMP וזנב בכלוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 110 μl של פתרון CMP בכלוב לכל עכבר (במשקל 20-30 גרם עכבר): פתרון למינון 100 μl, עם כרית μl 10 נוספת עבור האובדן האפשרי במהלך העברה וזריקה. מערבבים 11 μl של IR680-AHX-NB פתרון 9 מניות (400 מיקרומטר) עם 11 μl של 100 ציסטאין מיקרומטר בפתרון PBS סטרילי (לע&quot;מ), ואז להביא את הנפח הכולל עד 110 μl עם חיץ 1x PBS. פתרון פפטיד הסופי מכיל 4 nmol של IR680-AHX-NB (לע&quot;מ) 9 ו1 nmol של ציסטאין בפתרון של 1x PBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט withdraw פתרון פפטיד לתוך מזרק אינסולין 0.5 מיליליטר עם חבית שקופה ומד קטן (28-30 G) מחט, ובזהירות להסיר את בועות האוויר. הדלק את מנורת UV כדי לאפשר למנורה להתחמם במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק המכיל פפטיד ישירות תחת מנורת UV (365 ננומטר,&gt; 25 mW / cm 2) במשך 5 דקות, כדי לאפשר צילום הפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, מקם את העכבר בעוצר מתחת לפנס מחומם; לתייג את העכבר עם סמן קבע על הזנב או שיטות זיהוי אחרות כגון תג אוזן או קעקוע הבוהן, ולחטא את הזנב עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הפעלת UV, להזריק של הופעל-UV IR680-AHX-NB (לע&quot;מ) 9 פתרון לוריד הזנב 100 μl, מעדיפים בחלק האחורי של הזנב. מניחים את העכבר חזרה לכלוב לאחר הזרקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דימות פלואורסצנטי ניר פעילות שיפוץ קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכהצלחת מחמם מיטת ההדמיה של תרמי דחף 37 מעלות צלזיוס באמצעות פרל אימפולס 2.0 תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בעירום או מגולח לתא האינדוקציה הרדמה המכיל 2% isoflurane בחמצן. ודא עומק של מטוס הרדמה על ידי חוסר תנועת עכבר במהלך טיפול ועל ידי ניטור תדירות הנשימה (~ 1/sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים, פתח את מגירת תרמי פרל, ולמקם את בעלי החיים על מיטת ההדמיה. להסיר במהירות את תקע חרטומו, והחלק את פרצופו של העכבר בתוך חרטומו כדי לשמור על העכבר תחת הרדמה (על ידי 2% isoflurane בחמצן מועבר ב2 ליטר / דקה בחרטומו) במהלך תהליך ההדמיה. ברגע שהעכבר נמצא במקום, לסגור את המגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המכשיר מצביע על &quot;מוכן&quot; בלוח תוכנת תמונה, לחץ על &quot;הערוץ 700&quot;, &quot;אור לבן&quot; ו &quot;85&quot; קופסות ואחריו &quot;מיקרון הכפתור לרכוש תמונה&quot;. ניר (עירור 685 ננומטר, פליטת 720 ננומטר)צילומי אור לבנים ד יובאו לאחר מכן באמצעות מיקוד וחשיפה אוטומטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההקלטה הושלמה, פתח את המגירה, להפוך את העכבר, ולרכוש תמונות מזווית אחרת. העכבר יכול להיות ממוקם בחזיתו (הגחון), גב (גב) או בצדדים מול המצלמה. רצועות צרות של סרט יכולות לשמש כמעצורים למתוח את איבריו כדי לקבל את התצוגה הטובה ביותר של האזור של עניין (לדוגמא: כלוב צלעות, קרסוליים ופרקי ידות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן נכון לקיים ספיגת שלד של IR680-CMP הוא בין 24-96 הודעה שעה הזרקה (HPI), המבוסס על המינון (~ 4 nmol / עכבר). לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהות, להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם בזמן תחת הרדמה עמוקה אחרי 72 HPI, להסיר את העור (ושיער) באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיות, ואת תמונתו על ידי הקרינה ניר כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תמונות הקרינה ניר הנרכשות. </li></ol></li></ol> 2. ויזואליזציה של collagens בEx vivoסעיפים רקמות; 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של 10% (w / v) פתרון BSA במי deionized. להפשיר 1 מיליליטר של סרום עז באמבט מים בטמפרטורת חדר. חותכים כמה חתיכות של Parafilm בגודל של כ -2 ס&quot;מ x 5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של חיץ חסימה על ידי ערבוב 500 μl של סרום עז, 1 מיליליטר של 10x PBS ו8.5 מיליליטר של מים deionized. הכן 5 מיליליטר של חיץ דילול CMP ידי דילול 50 μl של 10% (w / v) BSA עם 4.45 מיליליטר של מים deionized ו500 μl 10x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרונות מניות של CMP כותרת carboxyfluorescein בכלוב, CF NB (לע&quot;מ) 9 (480 מיקרומטר), עד 5 מיקרומטר באמצעות חיץ דילול CMP. ריכוז CMP אופטימלי משתנה 2.5-30 מיקרומטר, תלוי בסוג של רקמות ואת האופי של דגימות רקמה. נפח 100 μl מומלץ למכתים שקופיות קטע רקמה אחת. אחסן את solut CMP גובשיונים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות רקמת קרנית העכבר לאזן לטמפרטורת חדר. דגירה השקופיות בPBS חיץ 1x למשך 5 דקות. רקמות קרנית העכבר המשמשות בהפגנה זו כבר התחילית עם paraformaldehyde 4% בפתרון PBS עבור שעה 1, cryopreserved ברקמות-Tek אוקטובר בינוני, cryosectioned עד 8 עובי מיקרומטר, רכוב על שקופיות זכוכית טעונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת רקמות והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בתא humidified. לכל שקופית, להחיל 0.5 מיליליטר של פתרון חסימת דגירה השקופיות במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את פתרון החסימה ידי סופג את השקופיות על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל כ 100 μl של CF NB (לע&quot;מ) 9 פתרונות כדי לכסות את חלקי רקמות של כל שקופית. דגירה השקופיות במשך 2 דקות, כדי לאפשר פתרון CMP לחלחל רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדלק את מנורת UV. כאשר הנורה התחממה, לחשוף את רקמת CMP המכוסה sections לאור UV במשך 6 דקות (365 ננומטר, ~ 8 mW / 2 סנטימטר) לdeprotect CMPs בכלוב. לאחר חשיפה לקרינת UV, לכסות את חלקי רקמות של כל שקופית עם חתיכת Parafilm כדי למנוע התייבשות. מניחים את השקופיות בתא humidified דגירה אותם ב-C ° 4 לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:3,000 של פתרון DAPI ב 1x PBS. לאחר צביעת CMP, בעדינות להסיר את Parafilm עם מלקחיים, ולמחוק את השקופיות על מגבת נייר כדי להסיר את פתרון CMP עודף. החל כ 100 μl של פתרונות DAPI מדוללים לכל שקופית רקמות דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צביעה, לטבול את שקופיות PBS חיץ 1x בצנצנת מכתים למשך 5 דקות. חזור 3x זה בטרי 1x PBS כדי לשטוף את הסוכנים מכתים מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של מדיום גובר על קטע הרקמה ולכסות אותו עם להחליק את מכסה זכוכית, תוך הימנעות לכידת בועות אוויר. שים את השקופיות במגש שקופיות קרטון כדי להגן עליהם מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">תמונת גדילי קולגן (ערוץ FITC) וגרעין תא (ערוץ DAPI) בשקופיות הרקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

כפי שניתן לראות בפרוטוקול זה, המסירה של CMP היא פשוטה מאז UV-ההפעלה של CMPs בכלוב היא הצעד נוסף רק לפרוטוקולי הזרקה לוריד זנב הנפוץ 19. המפתח הוא להזריק את בדיקות פפטיד במדינה אחת הגדיל שברחה מכלוב וmetastable. קבוצת הכלוב מונעת CMP מהרכבה עצמית ומחייבת לcollagens (איור 2) עד להסרתו על ידי אור UV ובשלב CMP מתחיל לקפל לתוך סליל משולש. ניסוח ההזרקה מכיל ציסטאין, שיכול להגיב במהירות לקבוצת הכלוב ביקע במהלך קרינת UV כדי למזער את הרעילות. עכברים רבים עם זנים שונים (למשל SKH-1 ו-DR-1) נבדקו באמצעות ניסוח זה, ואנחנו לא מזהים כל ליקויי בריאות התנהגותיות או אחרים בעכברים אלו של עד שישה חודשים. אם הזריקה לא פעל מייד לאחר חשיפה לקרינת UV, CMPs יהיה לקפל לתוך סלילים משולשים homotrimeric, אשר אין להם יכולת הכלאה. איור 2C מציג מקרה קיצוני שבו לפני זריקת CMPs היו הורכב מחדש במלואו לתוך סלילים משולשים בזמן עיכוב (&gt; 2 ימים). כדי לעקוף בעיה זו, פתרון CMP צריך להיות מוכן בריכוז נמוך יחסית (למשל ~ 40 מיקרומטר), והזריק לעכברים מייד לאחר UV-decaging. בגלל קצב האיטי סליל משולש קיפול של CMPs בתנאים לדלל (מחצית זמן של קיפול מחדש:&gt; 50 דק &#39;) ואת החשיפה לקרינת UV הקצרה וזמן הזרקה (5 ~ 7 דקות בסך הכל), רוב CMPs להיכנס למחזור הדם ביחיד גדיל טופס כאשר פרוטוקול זה ואחריו. הזריק פעם אחת, CMPs צפוי להישאר כאחת גדילים, כפי הריכוז מופחת בפקטור של 20 בבריכת הדם, מה שמוביל לירידה דרמטית בשיעור הרכבת 18. אם ההזרקה מתעכבת (למשל עקב טיפול בבעלי חיים) וrefolding homotrimeric חשוד, ניתן מחדש פפטידים התאספו באופן חלקי על ידי חימום למעל 7076; C לנתק CMPs לחד גדילים, ואחריו קירור והזרקה מיידיים. אמנם פחות נוח, CMPs-ניתק חום כזה גם להראות את התוצאות צפויות של in vivo מיקוד (איור 2 ד). בהפגנה זו, עכברים בעירום שימשו לדימות פלואורסצנטי ניר כי עד 50% מאות ניר יכולים להיחסם על ידי שיער. כאשר עובד עם מודלים שיער עכבר (במיוחד את אלה עם שערות שחורות), אנו ממליצים על גילוח בעכבר באזור של עניין לפני ההדמיה באמצעות מכונת גילוח חשמלי או מסיר שיער. באיור 1, יש אותות חיוביים כוזבים מאזור הבטן של בעלי החיים, אשר נגרמת על ידי אוטומטי הקרינה של chlorophylls בתזונת בעלי החיים. אותות רקע מסוג זה יכול להיות הוריד באופן משמעותי על ידי מעבר העכבר כדי דיאטות מטוהרים כ -4 ימים לפני ההדמיה. כפי שניתן לראות באיורים 1 ו 2A, יש uptakes CMP החזק בספין הזנבדואר. לכן, כדי להימנע מחפצים הנובעים מזריקות וריד זנב לא מושלמות, אנו ממליצים הזרקה בחלק האחורי של הזנב, כך שאתר ההזרקה הוא לא נתפס בתמונה הקרינה. CMP שהכותרת מאפשר מיקוד והדמיה של מיקומים ספציפיים של שיפוץ קולגן in vivo שקשה לזהות בשיטות אחרות. לדוגמא, מבחני דם ושתן מבוססי ELISA רגישים לברי telopeptide קולגן ביקע, אבל השיטה לא יכולה למקם את המקור ממחזור קולגן, משום שהיא מתמקדת באנטיגנים מסיסים. המגבלות העיקריות של in vivo טכניקת ההדמיה באמצעות ניר שכותרת CMPs הן הנחתה ומרווה בעומק של חדירה של תאים אדומים הפרוקסימלי נקווה כמו המוגלובין הוא מרווה אנדוגני של 680/710 צבעי ניר ננומטר. יישומים עתידיים של CMP בתחום ההדמיה vivo כוללים SPECT או PET הדמיה באמצעות CMPs שכותרתו עם אטומים רדיואקטיביים פולטות גמא ישירים או עם פוזיטרונים EMItters, לאבחון של מחלות מדינות מעורבים שיפוץ קולגן (לדוגמא אוסטיאופורוזיס, דלקת פרקים, טרשת עורקים, ופיברוזיס). אנלוגים CMP כותרת רדיו אלו יבטל את המגבלות של אובדן אות בשל עומק ונוכחותם של תאים אדומים ונקווה רקמות, ויאפשר מדידות כמותיות של רקמות חולות. בנוסף, הזמן מאוחר יחסית הדמיה (למשל 48-96 HPI) כתוצאה מהפינוי מחייב ואיטי של CMPs יכול לעשות את זה קשה לעקוב אחרי שינויים מהירים בשיפוץ קולגן. הגבלה כזו ניתן להתגבר על ידי הנדסה נוספת של קינטיקה והזיקה של סוכני הדמיה CMP המחייבים. מאז CMP נקשר collagens מפוגל שיש מבנה קטן, ההדמיה מבוססת קולגן CMP היא משלימה למיקרוסקופיה דור השנייה הרמוני אשר יכול רק סיבי קולגן תמונה 5. כאשר מכתימים את חלקי רקמות עם CMPs fluorescently שכותרתו, מצאנו את זה מועיל כדי לדגורדגימות בפתרונות פפטיד הופעל-UV על 4 מעלות צלזיוס, כי הכלאת הסליל המשולשת היא הקל בטמפרטורה נמוכה 1,20. כמו כן, נמצא כי טבילת השקופיות בחיץ PBS טרי בצנצנת מכתים היא הדרך היעילה ביותר כדי לשטוף CMPs מאוגד, שעובד הרבה יותר טוב מאשר סתם pipetting מאגרי כביסה על הדגימות. הכלאת גדיל CMP-קולגן היא ספציפית מאוד וחזק, ולכן הפרוטוקול מכתים הפשוט שהוצג בסרטון הזה ניתן לשנות בקלות לcostaining סמנים ביולוגיים נוספים, ולזיהוי collagens המושפל בסעיפי רקמות מבולבל. זוהי אלטרנטיבה יעילה ונוחה לשימוש בנוגדנים נגד קולגן לאיתור collagens הסיבי בדגימות היסטולוגית שונות.

קולגן, החלבון הנפוץ ביותר ביונקים, משחק תפקיד קריטי בהתפתחות והתחדשות רקמות על ידי תמיכה בריבוי והתמיינות של תאים. בעוד collagens הסיבי (לדוגמא מהסוג I, II), ברקמות חיבור נותן חוזק מכאני לרקמות, קולגן כמו הרשת (סוג IV) בצורת פיגום בסיסי של הקרום במרתף שבו תאים לצרף וליצור רקמות מאורגנות. שיפוץ קולגן כרוך גם השפלה קולגן (על ידי פרוטאזות) וסינתזה (מקודם על ידי גורמי גדילה). למרות שיפוץ קולגן, למשל בעצמות, הוא חלק מהתהליך הנורמלי התחדשות רקמות, פעילות שיפוץ עודפת, או המופע שלה במקומות לא נורמלים, בדרך כלל מצביע על ריפוי פצע תגובה לפציעה או למצבים פתולוגיים כרוניים כגון סרטן, אוסטיאופורוזיס, דלקת פרקים, ו סיסטיק 1-4. היכולת ישירות collagens תמונה עובר שיפוץ in vivo יכולה להוביל להבנה של ההתקדמותיון של מחלות אלו, כמו גם כלי אבחון ותרופות חדשים. לדוגמא, הדמיה חיה יכולה לספק מידע על החומרה והמיקום של המחלות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את היעילות של סוכנים טיפוליים חדשים. מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton ודור שני הרמוני הוחלו collagens סיבי תמונה לניטור שיפוץ מטריצה ​​תאית בגידול בעכברים חיים 5. עם זאת, טכניקה זו דורשת בעלי חיים כדי להיות מותקנת עם תאי skinfold הגב שקופים, שהוא הליך פולשני. הדמיה ישירה ולא פולשנית של שיפוץ קולגן תיהנה מבדיקה שבמיוחד מטרות קולגן שעבר שיפוץ. בדיקה כזו היא קשה להכין מאז שהוא צריך להבחין collagens שיפוץ מcollagens שלם ובוגר, הנמצא בשפע ברקמות נורמליות 6. קולגן מורכב ממבנה הנדיר ביותר חלבון הנקרא סליל משולש, שהואביקע ידי פרוטאזות כגון metalloproteinases מטריקס (MMP) במהלך שיפוץ קולגן. ברי קולגן ביקע לאבד את מבנה הסליל המשולש שלהם ולהפוך לגדילי פרש (ג&#39;לטין), אשר מתעכלים נוספת על ידי פרוטאזות ספציפיות 1. הוא התגלה לאחרונה כי פפטיד קולגן כוזב (CMP) שבה יש הנטייה להתקפל למבנה סליל משולש במיוחד יכול למקד גדילי קולגן שהם ניתקו ממדינת הסליל המשולשת שלה או על ידי denaturation חום או על ידי פירוק אנזימטי 1,7. המחייב הוא מונע בעיקר על ידי הכלאה משולש סליל בין CMPs monomeric וגדילי קולגן מפוגלים. בגלל CMPs עצמי להרכיב לתוך סלילים משולשים homotrimeric בטמפרטורת חדר עם כוח מניע קטן לכלת קולגן, CMP בכלוב [(לע&quot;מ) 4 NB-GPO (לע&quot;מ) 4, המיועד כNB (לע&quot;מ) 9, O: hydroxyproline], פותח , אשר מכיל nitrobenzyl צילום cleavableקבוצה (NB) שצורף לגליצין של הפפטיד המרכזי. קבוצת כלוב NB sterically מונעת CMP ממתקפל לתוך סליל משולש, ובכל זאת, להסרת מקבוצת הכלוב על ידי קרינת UV מעוררת את קיפול הסליל המשולש וכלת קולגן 1 באופן מיידי. כאשר CMPs monomeric שכותרתו עם אינפרא אדום הקרוב fluorophores (NIR) מערכתי מועברים למודל עכברים, הם יכולים באופן ספציפי למקד ולאפשר בתחום ההדמיה vivo של collagens מפוגל ברקמות עוברות רגיל (למשל בעצמות וסחוס) ופתולוגיים (למשל בגידולים) שיפוץ 1 . גם CMPs שכותרתו fluorescently יכולה לשמש להדמית collagens בסעיפי רקמות היסטולוגית. במחקר היסטולוגית, רקמות שנקטפו לעתים קרובות נשמרו על ידי קיבוע כדי לשמור על המרכיבים התאיים ומורפולוגיה רקמה הכוללת מהידרדרות. נהלי תיקון, הכוללים חום, וטיפול בממסים אורגניים, ולינקין הצולב הכימיריאגנטים g (למשל paraformaldehyde), לפגל מבנה הסליל המשולש של הקולגן 8. denaturation זה יוצר אתרים עבור הכלאה CMP. הוכח שCMPs שכותרתו fluorescently במיוחד יכול להיקשר collagens בסעיפי רקמות קבועים (למשל עור, קרנית, ועצם) אפילו בצורה יעילה יותר מאשר נוגדנים נגד קולגן, אשר אפשרו זיהוי קליל של תנאים פתולוגיים ברקמות כבד fibrotic 9. CMP מטרות גדילי קולגן מפוגלים המכילים רצף חומצות אמינו של מוטיבים סליל משולשים, שהוא משותף לכל סוגי collagens. לכן יכול להיחשב CMP סוכן מכתים קולגן ספקטרום רחב. כאן, אנו מציגים הפרוצדורות מפורטות עבור i) הדמיה גדילים מפוגלים קולגן in vivo ו collagens ii) באופן חזותי בסעיפי רקמות vivo לשעבר באמצעות CMPs בכלוב שכותרתו fluorescently. תג ניר, IR680, היה מצומדת לCMP בכלוב עבור הדמיה חיה, whilcarboxyfluorescein דואר (CF) שימש בעבודת צביעת רקמות לתאימות שלה עם מיקרוסקופים הקרינה סטנדרטיים. פרוטוקול זה מתמקד ביישום ההדמיה של CMPs כקשור לשיפוץ קולגן. ניתן למצוא שיטות לסינתזת CMP בדוחות קודמים 1,7,9-15. בדו&quot;ח זה וידאו, הדמיה רקמות שלד בעכברים נורמלים וחתכים רקמה של קרנית עכבר נבחרו למטרה הפגנה, אולם השיטות שהוצגו כאן יכולות להיות מיושמות בקלות לפתולוגיות רבות ומודלים ביולוגיים מעורבים שיפוץ קולגן (למשל גידולים, ריפוי פצעים), כמו גם כמעט לכל דגימת רקמת התחילית המכילה collagens.

<table><tbody><tr><td>IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td><td>LI-COR</td><td>929-71050</td><td>Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>5(6)-Carboxyfluorescein</td><td>Sigma</td><td>21877-5G-F</td><td>Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Advanced Chemtech</td><td>YC2200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Veterinary Supply</td><td>4/4/5260</td><td></td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Sigma</td><td>G9023-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche Applied Science</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield mounting medium</td><td>Sigma</td><td>F6182-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>McMaster-Carr</td><td>1447T17</td><td></td></tr><tr><td>Pearl impulse imager</td><td>LI-COR</td><td>9400</td><td></td></tr><tr><td>Surgical forceps and scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyDip slide staining system</td><td>Light Labs</td><td>M900-12B</td><td></td></tr><tr><td>20-place cardboard microscope slide tray</td><td>Light Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses</td><td>Fisher</td><td>12-545-c</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000-E</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

קולגן הוא מרכיב מבני עיקרי של מטריקס תאי התומך בהקמה ובתחזוקת רקמות. למרות שיפוץ קולגן הוא חלק בלתי נפרד מהתחדשות רקמות נורמלית, כמות מוגזמת של פעילות שיפוץ עוסקת בגידולים, דלקת פרקים, ומצבים פתולוגיים רבים אחרים. במהלך שיפוץ קולגן, מבנה הסליל המשולש של מולקולות קולגן מופר על ידי פרוטאזות בסביבה תאית. בנוסף, collagens נוכח בהרבה דגימות רקמה היסטולוגית הם מפוגל באופן חלקי על ידי תהליכי הקיבוע ושימור. לכן, גדילי קולגן מפוגל אלה יכולים לשרת מטרות יעילות באותה מידה להדמיה ביולוגית. אנחנו פיתחנו בעבר פפטיד בכלוב כוזב קולגן (CMP) שיכול להיות ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים על ידי יצירת מבנה סליל משולש, אשר הוא ייחודי לcollagens-מופעל על תמונה. מטרות העל של הליך זה הם אני) לתמונת גדילי קולגן מפוגלים resulting מפעילות שיפוץ נורמלית in vivo, וii) כדי להמחיש collagens בסעיפי רקמות vivo לשעבר באמצעות CMPs בכלוב-מופעל על התמונה. כדי להשיג הכלאה ומוצלחת in vivo לשעבר vivo הדמיה אפקטיביות, CMPs בכלוב שכותרתו fluorescently הם או מייד לפני הזרקה תוך ורידית הופעל צילום, או מופעלים ישירות על חלקי רקמות. remolding קולגן שלד הנורמלי בעכברים בעירום וcollagens בסעיפי רקמת קרנית עכבר קידומת הם צילמו בהליך זה. שיטת ההדמיה המבוססת על טכנולוגית הכלאת CMP-קולגן המוצגת כאן עלולה להוביל להבנה עמוקה יותר של תהליך שיפוץ רקמות, כמו גם לאפשר פיתוח של כלי אבחון חדשים למחלות הקשורות לפעילות שיפוץ הגבוה קולגן.

איור 1 מציג תוצאה אופיינית של איך IR680-AHX-(לע&quot;מ), מופעל על תמונה 9 מפיצה בעכבר עירום SKH1 הנשי בריא לאחר הודעה 24-96 שעה הזרקה. זה מראה הצטברות CMP לכאורה בשלד לאחר 24 HPI, ובשלב זה רוב פפטידים מאוגדים כבר פינה במידה רבה. התהליך של CMP והכלאה עם גדילי קולגן שיפוץ נראה איטי יחסית, במיוחד בניגוד לבדיקות אחרות הדמיה פפטיד (למשל RGD 16). זה ככל הנראה בגלל שיעור הקיפול האיטי של הסליל המשולש קולגן 17,18. עם זאת, לאחר הכלאה, גדילי CMP הם קשורים מאוד לרקמות collagenous, כמו שרק הפחתת אות קלה נתפס לאחר 24 HPI (איור 1). ב96 HPI, תמונת הקרינה NIR של העכבר לאחר הסרת העור מדגימה בבירור את ספיגת השלד של IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 בעמוד השדרה וצלעות, כמו גם בתוך הברכיים, קרסוליים,פרקי ידיים, ולסתות התחתונות (איור 2 א). בvivo לשעבר צביעת רקמות, CMPs כלוב fluorescently שכותרת-מופעל על תמונה במיוחד להכליא גדילי קולגן מפוגלים בסעיפי רקמות. באיור 3, מכתים CMP מגלה בבירור סיבי הקולגן במקביל הקנס בסטרומה של הקרנית, אשר מדגימה את השימוש בו כסוכן מכתים ספציפי קולגן. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> איור 1. תמונות הקרינה ניר סידוריים של עכבר בעירום בהזרקה לווריד עם תמונה-decaged IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 מראים ספיגת שלד על פני ארבעה ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; src איור 2. תמונות הקרינה NIR של עכברים מנוהלים עם צילום decaged IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 (א), בכלוב IR680-AHX-NB (לע&quot;מ) 9 ללא חשיפה לקרינת UV (ב &#39;), prefolded משולש סליל [IR680-AHX-(לע&quot;מ ) 9] 3 (ג), או ניתק חום חד גדיל IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 (ד &#39;) בשעה 96 HPI לאחר הסרת עור. מיקוד שלד על ידי CMP ניתן לצפות רק בA ו-D. אותות הקרינה ניר מוצגים בקנה מידת קשת בענן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> איור 3. micrographs הקרינה של שיתוף עכברקטע רקמת rneal התחילית בparaformaldehyde, ומוכתם עם DAPI וCF-מופעל על תמונה (לע&quot;מ) 9 באמצעות פרוטוקול 2, בו מוצגות stroma הצפוף collagenous (מוכתם על ידי CMP, בירוק), כמו גם אפיתל הסלולרי והאנדותל (מוכתם על ידי DAPI, בכחול ) (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

הליך זה מדגים in vivo ליד ההדמיה IR הקרינה של פעילויות שיפוץ קולגן בעכברים, כמו גם vivo מכתים לשעבר של collagens בסעיפי רקמות באמצעות פפטידים כוזב קולגן בכלוב שיכול להיות מופעל על תמונה ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.9K Views.  University of Utah.  הליך זה מדגים in vivo ליד ההדמיה IR הקרינה של פעילויות שיפוץ קולגן בעכברים, כמו גם vivo מכתים לשעבר של collagens בסעיפי רקמות באמצעות פפטידים כוזב קולגן בכלוב שיכול להיות מופעל על תמונה ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים. 

Video: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

קולגן אני Assay Organotypic: פלטפורמה חשילה לבחינת התנהגות תא בהקשר 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

בונה הנדסת רקמות מבוססת הפיברין מmyofibroblasts ויישום של אילוצים ומתח כדי לגרום לתא וקולגן ארגון (בעניין)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Medicine

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

2D ו 3D מטריצות לחקר Invadosome לינארי גיבוש ופעילות

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Optimized Methods for the Surface Immobilization of Collagens and Collagen Binding Assays

Fibrosis occurs in various tissues as a reparative response to injury or damage. If excessive, however, fibrosis can lead to tissue scarring and organ failure, which is associated with high morbidity and mortality. Collagen is a key driver of fibrosis, with type I and type III collagen being the primary types involved in many fibrotic diseases. Unlike conventional protocols used to immobilize other proteins (e.g., elastin, albumin, fibronectin, etc.), comprehensive protocols to reproducibly immobilize different types of collagens in order to produce stable coatings are not readily available. Immobilizing collagen is surprisingly challenging because multiple experimental conditions may affect the efficiency of immobilization, including the type of collagen, the pH, the temperature, and the type of microplate used. Here, a detailed protocol to reproducibly immobilize and quantify type I and III collagens resulting in&#160;stable and reproducible gels/films is provided. Furthermore, this work demonstrates how to perform, analyze, and interpret in vitro time-resolved fluorescence binding studies to investigate the interactions between collagens and candidate collagen-binding compounds (e.g., a peptide conjugated to a metal chelate carrying, for example, europium [Eu(III)]). Such an approach can be universally applied to various biomedical applications, including&#160;the field of molecular imaging to develop targeted imaging probes, drug development, cell toxicity studies, cell proliferation studies, and immunoassays.

This work presents an optimized protocol to reproducibly immobilize and quantify type I and III collagen onto microplates, followed by an improved in vitro binding assay protocol to study collagen-compound interactions using a time-resolved fluorescence method. The subsequent step-by-step data analysis and data interpretation are provided.

Fibrosis occurs in various tissues as a reparative response to injury or damage. If excessive, however, fibrosis can lead to tissue scarring and organ ...

Biochemistry

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

בתרבית של חלוקת התא במטריצות תלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ השתקפות קונאפוקלית כמותיים

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark of cardiac and musculoskeletal tissues. To study cell response to aligned microenvironments in vitro, several protocols have been developed to generate COL1 matrices with defined fiber alignment, including magnetic, mechanical, cell-based, and microfluidic methods. Of these, microfluidic approaches offer advanced capabilities such as accurate control over fluid flows and the cellular microenvironment. However, the microfluidic approaches to generate aligned COL1 matrices for advanced in vitro culture platforms have been limited to thin "mats" (&lt;40 &#181;m in thickness) of COL1 fibers that extend over distances less than 500 &#181;m and are not conducive to 3D cell culture applications. Here, we present a protocol to fabricate 3D COL1 matrices (130-250 &#181;m in thickness) with millimeter-scale regions of defined fiber alignment in a microfluidic device. This platform provides advanced cell culture capabilities to model structured tissue microenvironments by providing direct access to the micro-engineered matrix for cell culture.

This protocol demonstrates the use of a microfluidic channel with changing geometry along the fluid flow direction to generate extensional strain (stretching) to align fibers in a 3D collagen hydrogel (&lt;250 &#181;m in thickness). The resulting alignment extends across several millimeters and is influenced by the extensional strain rate.

מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...

הדמיה גידים קולגן המפוגל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video