המחברים מודים גילברט ירוק לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מNIAMS / NIH (R01-AR060484) ומשרד ההגנה אמריקאי (W81XWH-12-1-0,555) הוענק לSMY, ומ-NIH (CA92871 U24 וU54 CA151838) הוענקו לMGP

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בג&#39;ונס הופקינס. 1. אינפרא אדום קרוב (NIR) דימות פלואורסצנטי של שלד קולגן שיפוץ בvivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום והפעלה של ההזרקה לוריד CMP וזנב בכלוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 110 μl של פתרון CMP בכלוב לכל עכבר (במשקל 20-30 גרם עכבר): פתרון למינון 100 μl, עם כרית μl 10 נוספת עבור האובדן האפשרי במהלך העברה וזריקה. מערבבים 11 μl של IR680-AHX-NB פתרון 9 מניות (400 מיקרומטר) עם 11 μl של 100 ציסטאין מיקרומטר בפתרון PBS סטרילי (לע&quot;מ), ואז להביא את הנפח הכולל עד 110 μl עם חיץ 1x PBS. פתרון פפטיד הסופי מכיל 4 nmol של IR680-AHX-NB (לע&quot;מ) 9 ו1 nmol של ציסטאין בפתרון של 1x PBS 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט withdraw פתרון פפטיד לתוך מזרק אינסולין 0.5 מיליליטר עם חבית שקופה ומד קטן (28-30 G) מחט, ובזהירות להסיר את בועות האוויר. הדלק את מנורת UV כדי לאפשר למנורה להתחמם במשך 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המזרק המכיל פפטיד ישירות תחת מנורת UV (365 ננומטר,&gt; 25 mW / cm 2) במשך 5 דקות, כדי לאפשר צילום הפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, מקם את העכבר בעוצר מתחת לפנס מחומם; לתייג את העכבר עם סמן קבע על הזנב או שיטות זיהוי אחרות כגון תג אוזן או קעקוע הבוהן, ולחטא את הזנב עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר הפעלת UV, להזריק של הופעל-UV IR680-AHX-NB (לע&quot;מ) 9 פתרון לוריד הזנב 100 μl, מעדיפים בחלק האחורי של הזנב. מניחים את העכבר חזרה לכלוב לאחר הזרקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דימות פלואורסצנטי ניר פעילות שיפוץ קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערכהצלחת מחמם מיטת ההדמיה של תרמי דחף 37 מעלות צלזיוס באמצעות פרל אימפולס 2.0 תוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בעירום או מגולח לתא האינדוקציה הרדמה המכיל 2% isoflurane בחמצן. ודא עומק של מטוס הרדמה על ידי חוסר תנועת עכבר במהלך טיפול ועל ידי ניטור תדירות הנשימה (~ 1/sec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים, פתח את מגירת תרמי פרל, ולמקם את בעלי החיים על מיטת ההדמיה. להסיר במהירות את תקע חרטומו, והחלק את פרצופו של העכבר בתוך חרטומו כדי לשמור על העכבר תחת הרדמה (על ידי 2% isoflurane בחמצן מועבר ב2 ליטר / דקה בחרטומו) במהלך תהליך ההדמיה. ברגע שהעכבר נמצא במקום, לסגור את המגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המכשיר מצביע על &quot;מוכן&quot; בלוח תוכנת תמונה, לחץ על &quot;הערוץ 700&quot;, &quot;אור לבן&quot; ו &quot;85&quot; קופסות ואחריו &quot;מיקרון הכפתור לרכוש תמונה&quot;. ניר (עירור 685 ננומטר, פליטת 720 ננומטר)צילומי אור לבנים ד יובאו לאחר מכן באמצעות מיקוד וחשיפה אוטומטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההקלטה הושלמה, פתח את המגירה, להפוך את העכבר, ולרכוש תמונות מזווית אחרת. העכבר יכול להיות ממוקם בחזיתו (הגחון), גב (גב) או בצדדים מול המצלמה. רצועות צרות של סרט יכולות לשמש כמעצורים למתוח את איבריו כדי לקבל את התצוגה הטובה ביותר של האזור של עניין (לדוגמא: כלוב צלעות, קרסוליים ופרקי ידות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן נכון לקיים ספיגת שלד של IR680-CMP הוא בין 24-96 הודעה שעה הזרקה (HPI), המבוסס על המינון (~ 4 nmol / עכבר). לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהות, להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם בזמן תחת הרדמה עמוקה אחרי 72 HPI, להסיר את העור (ושיער) באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיות, ואת תמונתו על ידי הקרינה ניר כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את תמונות הקרינה ניר הנרכשות. </li></ol></li></ol> 2. ויזואליזציה של collagens בEx vivoסעיפים רקמות; 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של 10% (w / v) פתרון BSA במי deionized. להפשיר 1 מיליליטר של סרום עז באמבט מים בטמפרטורת חדר. חותכים כמה חתיכות של Parafilm בגודל של כ -2 ס&quot;מ x 5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מיליליטר של חיץ חסימה על ידי ערבוב 500 μl של סרום עז, 1 מיליליטר של 10x PBS ו8.5 מיליליטר של מים deionized. הכן 5 מיליליטר של חיץ דילול CMP ידי דילול 50 μl של 10% (w / v) BSA עם 4.45 מיליליטר של מים deionized ו500 μl 10x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרונות מניות של CMP כותרת carboxyfluorescein בכלוב, CF NB (לע&quot;מ) 9 (480 מיקרומטר), עד 5 מיקרומטר באמצעות חיץ דילול CMP. ריכוז CMP אופטימלי משתנה 2.5-30 מיקרומטר, תלוי בסוג של רקמות ואת האופי של דגימות רקמה. נפח 100 μl מומלץ למכתים שקופיות קטע רקמה אחת. אחסן את solut CMP גובשיונים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו שקופיות רקמת קרנית העכבר לאזן לטמפרטורת חדר. דגירה השקופיות בPBS חיץ 1x למשך 5 דקות. רקמות קרנית העכבר המשמשות בהפגנה זו כבר התחילית עם paraformaldehyde 4% בפתרון PBS עבור שעה 1, cryopreserved ברקמות-Tek אוקטובר בינוני, cryosectioned עד 8 עובי מיקרומטר, רכוב על שקופיות זכוכית טעונות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת רקמות והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בתא humidified. לכל שקופית, להחיל 0.5 מיליליטר של פתרון חסימת דגירה השקופיות במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את פתרון החסימה ידי סופג את השקופיות על מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל כ 100 μl של CF NB (לע&quot;מ) 9 פתרונות כדי לכסות את חלקי רקמות של כל שקופית. דגירה השקופיות במשך 2 דקות, כדי לאפשר פתרון CMP לחלחל רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדלק את מנורת UV. כאשר הנורה התחממה, לחשוף את רקמת CMP המכוסה sections לאור UV במשך 6 דקות (365 ננומטר, ~ 8 mW / 2 סנטימטר) לdeprotect CMPs בכלוב. לאחר חשיפה לקרינת UV, לכסות את חלקי רקמות של כל שקופית עם חתיכת Parafilm כדי למנוע התייבשות. מניחים את השקופיות בתא humidified דגירה אותם ב-C ° 4 לשעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול 1:3,000 של פתרון DAPI ב 1x PBS. לאחר צביעת CMP, בעדינות להסיר את Parafilm עם מלקחיים, ולמחוק את השקופיות על מגבת נייר כדי להסיר את פתרון CMP עודף. החל כ 100 μl של פתרונות DAPI מדוללים לכל שקופית רקמות דגירה במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צביעה, לטבול את שקופיות PBS חיץ 1x בצנצנת מכתים למשך 5 דקות. חזור 3x זה בטרי 1x PBS כדי לשטוף את הסוכנים מכתים מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ירידה של מדיום גובר על קטע הרקמה ולכסות אותו עם להחליק את מכסה זכוכית, תוך הימנעות לכידת בועות אוויר. שים את השקופיות במגש שקופיות קרטון כדי להגן עליהם מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">תמונת גדילי קולגן (ערוץ FITC) וגרעין תא (ערוץ DAPI) בשקופיות הרקמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+collagen+strands+by+photo-triggered+triple-helix+hybridization.">Targeting collagen strands by photo-triggered triple-helix hybridization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14767-14772 (2012).</li><li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fibrosis:+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease.">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18, 1028-1040 (2012).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Costa, A. G., Cusano, N. E., Silva, B. C., Cremers, S., Bilezikian, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+K:+its+skeletal+actions+and+role+as+a+therapeutic+target+in+osteoporosis.">Cathepsin K: its skeletal actions and role as a therapeutic target in osteoporosis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 7, 447-456 (2011).</li><li>Perentes, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+imaging+of+extracellular+matrix+remodeling+by+tumor-associated+fibroblasts.">et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts.</a> Nat. Methods. 6, 143-145 (2009).</li><li>Breurken, M., Lempens, E. H. M., Meijer, E. W., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-synthesis+of+a+protease-activatable+collagen+targeting+probe.">Semi-synthesis of a protease-activatable collagen targeting probe.</a> Chem. Commun. 47, 7998-8000 (2011).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+modification+of+collagen+scaffolds+mediated+by+triple+helical+propensity.">Spatio-temporal modification of collagen scaffolds mediated by triple helical propensity.</a> Biomacromolecules. 9, 1755-1763 (2008).</li><li>B&#228;chinger, H. P., Morris, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+thermal+stability+of+type+II+collagen+in+various+solvents+used+for+reversed-phase+high+performance+chromatography.">Analysis of the thermal stability of type II collagen in various solvents used for reversed-phase high performance chromatography.</a> Matrix. 10, 331-338 (1990).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+collagenous+proteins+by+fluorescently+labeled+collagen+mimetic+peptides.">Direct detection of collagenous proteins by fluorescently labeled collagen mimetic peptides.</a> Bioconjugate Chem. 24, 9-16 (2013).</li><li>Li, Y., Mo, X., Kim, D., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-tethered+collagen+mimetic+peptides+for+studying+heterotrimeric+triple-helical+interactions.">Template-tethered collagen mimetic peptides for studying heterotrimeric triple-helical interactions.</a> Biopolymers. 95, 94-104 (2011).</li><li>Stahl, P. J., Cruz, J. C., Li, Y., Yu, S. M., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-the-resin+N-terminal+modification+of+long+synthetic+peptides.">On-the-resin N-terminal modification of long synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 424, 137-139 (2012).</li><li>Wang, A. Y., Mo, X., Chen, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+modification+of+collagen+directed+by+collagen+mimetic+peptides.">Facile modification of collagen directed by collagen mimetic peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 4130-4131 (2005).</li><li>Wang, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+of+growth+factors+on+collagen+scaffolds+mediated+by+polyanionic+collagen+mimetic+peptides+and+its+effect+on+endothelial+cell+morphogenesis.">Immobilization of growth factors on collagen scaffolds mediated by polyanionic collagen mimetic peptides and its effect on endothelial cell morphogenesis.</a> Biomacromolecules. 9, 2929-2936 (2008).</li><li>Mo, X., An, Y. J., Yun, C. S., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle-assisted+visualization+of+binding+interactions+between+collagen+mimetic+peptide+and+collagen+fibers.">Nanoparticle-assisted visualization of binding interactions between collagen mimetic peptide and collagen fibers.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 2267-2270 (2006).</li><li>Chan, T. R., Stahl, P. J., Yu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-bound+VEGF+mimetic+peptides:+design+and+endothelial+cell+activation+in+collagen+scaffolds.">Matrix-bound VEGF mimetic peptides: design and endothelial cell activation in collagen scaffolds.</a> Adv. Funct. Mater. 21, 4252-4262 (2011).</li><li>van Hagen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+radiolabelled+cyclic+DTPA-RGD+analogue+for+tumour+imaging+and+radionuclide+therapy.">Evaluation of a radiolabelled cyclic DTPA-RGD analogue for tumour imaging and radionuclide therapy.</a> Int. J. Cancer. 90, 186-198 (2000).</li><li>Boudko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+propagation+of+the+collagen+triple+helix+in+single-chain+and+trimerized+peptides:+transition+from+third+to+first+order+kinetics.">Nucleation and propagation of the collagen triple helix in single-chain and trimerized peptides: transition from third to first order kinetics.</a> J. Mol. Biol. 317, 459-470 (2002).</li><li>Ackerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+dependence+of+the+folding+of+collagen-like+peptides.">Sequence dependence of the folding of collagen-like peptides.</a> J. Biol. Chem. 274, 7668-7673 (1999).</li><li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats.">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Brodsky, B., Persikov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+the+collagen+triple+helix.">Molecular structure of the collagen triple helix.</a> Adv. Prot. Chem. 70, 301-339 (2005).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

כפי שניתן לראות בפרוטוקול זה, המסירה של CMP היא פשוטה מאז UV-ההפעלה של CMPs בכלוב היא הצעד נוסף רק לפרוטוקולי הזרקה לוריד זנב הנפוץ 19. המפתח הוא להזריק את בדיקות פפטיד במדינה אחת הגדיל שברחה מכלוב וmetastable. קבוצת הכלוב מונעת CMP מהרכבה עצמית ומחייבת לcollagens (איור 2) עד להסרתו על ידי אור UV ובשלב CMP מתחיל לקפל לתוך סליל משולש. ניסוח ההזרקה מכיל ציסטאין, שיכול להגיב במהירות לקבוצת הכלוב ביקע במהלך קרינת UV כדי למזער את הרעילות. עכברים רבים עם זנים שונים (למשל SKH-1 ו-DR-1) נבדקו באמצעות ניסוח זה, ואנחנו לא מזהים כל ליקויי בריאות התנהגותיות או אחרים בעכברים אלו של עד שישה חודשים. אם הזריקה לא פעל מייד לאחר חשיפה לקרינת UV, CMPs יהיה לקפל לתוך סלילים משולשים homotrimeric, אשר אין להם יכולת הכלאה. איור 2C מציג מקרה קיצוני שבו לפני זריקת CMPs היו הורכב מחדש במלואו לתוך סלילים משולשים בזמן עיכוב (&gt; 2 ימים). כדי לעקוף בעיה זו, פתרון CMP צריך להיות מוכן בריכוז נמוך יחסית (למשל ~ 40 מיקרומטר), והזריק לעכברים מייד לאחר UV-decaging. בגלל קצב האיטי סליל משולש קיפול של CMPs בתנאים לדלל (מחצית זמן של קיפול מחדש:&gt; 50 דק &#39;) ואת החשיפה לקרינת UV הקצרה וזמן הזרקה (5 ~ 7 דקות בסך הכל), רוב CMPs להיכנס למחזור הדם ביחיד גדיל טופס כאשר פרוטוקול זה ואחריו. הזריק פעם אחת, CMPs צפוי להישאר כאחת גדילים, כפי הריכוז מופחת בפקטור של 20 בבריכת הדם, מה שמוביל לירידה דרמטית בשיעור הרכבת 18. אם ההזרקה מתעכבת (למשל עקב טיפול בבעלי חיים) וrefolding homotrimeric חשוד, ניתן מחדש פפטידים התאספו באופן חלקי על ידי חימום למעל 7076; C לנתק CMPs לחד גדילים, ואחריו קירור והזרקה מיידיים. אמנם פחות נוח, CMPs-ניתק חום כזה גם להראות את התוצאות צפויות של in vivo מיקוד (איור 2 ד). בהפגנה זו, עכברים בעירום שימשו לדימות פלואורסצנטי ניר כי עד 50% מאות ניר יכולים להיחסם על ידי שיער. כאשר עובד עם מודלים שיער עכבר (במיוחד את אלה עם שערות שחורות), אנו ממליצים על גילוח בעכבר באזור של עניין לפני ההדמיה באמצעות מכונת גילוח חשמלי או מסיר שיער. באיור 1, יש אותות חיוביים כוזבים מאזור הבטן של בעלי החיים, אשר נגרמת על ידי אוטומטי הקרינה של chlorophylls בתזונת בעלי החיים. אותות רקע מסוג זה יכול להיות הוריד באופן משמעותי על ידי מעבר העכבר כדי דיאטות מטוהרים כ -4 ימים לפני ההדמיה. כפי שניתן לראות באיורים 1 ו 2A, יש uptakes CMP החזק בספין הזנבדואר. לכן, כדי להימנע מחפצים הנובעים מזריקות וריד זנב לא מושלמות, אנו ממליצים הזרקה בחלק האחורי של הזנב, כך שאתר ההזרקה הוא לא נתפס בתמונה הקרינה. CMP שהכותרת מאפשר מיקוד והדמיה של מיקומים ספציפיים של שיפוץ קולגן in vivo שקשה לזהות בשיטות אחרות. לדוגמא, מבחני דם ושתן מבוססי ELISA רגישים לברי telopeptide קולגן ביקע, אבל השיטה לא יכולה למקם את המקור ממחזור קולגן, משום שהיא מתמקדת באנטיגנים מסיסים. המגבלות העיקריות של in vivo טכניקת ההדמיה באמצעות ניר שכותרת CMPs הן הנחתה ומרווה בעומק של חדירה של תאים אדומים הפרוקסימלי נקווה כמו המוגלובין הוא מרווה אנדוגני של 680/710 צבעי ניר ננומטר. יישומים עתידיים של CMP בתחום ההדמיה vivo כוללים SPECT או PET הדמיה באמצעות CMPs שכותרתו עם אטומים רדיואקטיביים פולטות גמא ישירים או עם פוזיטרונים EMItters, לאבחון של מחלות מדינות מעורבים שיפוץ קולגן (לדוגמא אוסטיאופורוזיס, דלקת פרקים, טרשת עורקים, ופיברוזיס). אנלוגים CMP כותרת רדיו אלו יבטל את המגבלות של אובדן אות בשל עומק ונוכחותם של תאים אדומים ונקווה רקמות, ויאפשר מדידות כמותיות של רקמות חולות. בנוסף, הזמן מאוחר יחסית הדמיה (למשל 48-96 HPI) כתוצאה מהפינוי מחייב ואיטי של CMPs יכול לעשות את זה קשה לעקוב אחרי שינויים מהירים בשיפוץ קולגן. הגבלה כזו ניתן להתגבר על ידי הנדסה נוספת של קינטיקה והזיקה של סוכני הדמיה CMP המחייבים. מאז CMP נקשר collagens מפוגל שיש מבנה קטן, ההדמיה מבוססת קולגן CMP היא משלימה למיקרוסקופיה דור השנייה הרמוני אשר יכול רק סיבי קולגן תמונה 5. כאשר מכתימים את חלקי רקמות עם CMPs fluorescently שכותרתו, מצאנו את זה מועיל כדי לדגורדגימות בפתרונות פפטיד הופעל-UV על 4 מעלות צלזיוס, כי הכלאת הסליל המשולשת היא הקל בטמפרטורה נמוכה 1,20. כמו כן, נמצא כי טבילת השקופיות בחיץ PBS טרי בצנצנת מכתים היא הדרך היעילה ביותר כדי לשטוף CMPs מאוגד, שעובד הרבה יותר טוב מאשר סתם pipetting מאגרי כביסה על הדגימות. הכלאת גדיל CMP-קולגן היא ספציפית מאוד וחזק, ולכן הפרוטוקול מכתים הפשוט שהוצג בסרטון הזה ניתן לשנות בקלות לcostaining סמנים ביולוגיים נוספים, ולזיהוי collagens המושפל בסעיפי רקמות מבולבל. זוהי אלטרנטיבה יעילה ונוחה לשימוש בנוגדנים נגד קולגן לאיתור collagens הסיבי בדגימות היסטולוגית שונות.

קולגן, החלבון הנפוץ ביותר ביונקים, משחק תפקיד קריטי בהתפתחות והתחדשות רקמות על ידי תמיכה בריבוי והתמיינות של תאים. בעוד collagens הסיבי (לדוגמא מהסוג I, II), ברקמות חיבור נותן חוזק מכאני לרקמות, קולגן כמו הרשת (סוג IV) בצורת פיגום בסיסי של הקרום במרתף שבו תאים לצרף וליצור רקמות מאורגנות. שיפוץ קולגן כרוך גם השפלה קולגן (על ידי פרוטאזות) וסינתזה (מקודם על ידי גורמי גדילה). למרות שיפוץ קולגן, למשל בעצמות, הוא חלק מהתהליך הנורמלי התחדשות רקמות, פעילות שיפוץ עודפת, או המופע שלה במקומות לא נורמלים, בדרך כלל מצביע על ריפוי פצע תגובה לפציעה או למצבים פתולוגיים כרוניים כגון סרטן, אוסטיאופורוזיס, דלקת פרקים, ו סיסטיק 1-4. היכולת ישירות collagens תמונה עובר שיפוץ in vivo יכולה להוביל להבנה של ההתקדמותיון של מחלות אלו, כמו גם כלי אבחון ותרופות חדשים. לדוגמא, הדמיה חיה יכולה לספק מידע על החומרה והמיקום של המחלות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את היעילות של סוכנים טיפוליים חדשים. מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton ודור שני הרמוני הוחלו collagens סיבי תמונה לניטור שיפוץ מטריצה ​​תאית בגידול בעכברים חיים 5. עם זאת, טכניקה זו דורשת בעלי חיים כדי להיות מותקנת עם תאי skinfold הגב שקופים, שהוא הליך פולשני. הדמיה ישירה ולא פולשנית של שיפוץ קולגן תיהנה מבדיקה שבמיוחד מטרות קולגן שעבר שיפוץ. בדיקה כזו היא קשה להכין מאז שהוא צריך להבחין collagens שיפוץ מcollagens שלם ובוגר, הנמצא בשפע ברקמות נורמליות 6. קולגן מורכב ממבנה הנדיר ביותר חלבון הנקרא סליל משולש, שהואביקע ידי פרוטאזות כגון metalloproteinases מטריקס (MMP) במהלך שיפוץ קולגן. ברי קולגן ביקע לאבד את מבנה הסליל המשולש שלהם ולהפוך לגדילי פרש (ג&#39;לטין), אשר מתעכלים נוספת על ידי פרוטאזות ספציפיות 1. הוא התגלה לאחרונה כי פפטיד קולגן כוזב (CMP) שבה יש הנטייה להתקפל למבנה סליל משולש במיוחד יכול למקד גדילי קולגן שהם ניתקו ממדינת הסליל המשולשת שלה או על ידי denaturation חום או על ידי פירוק אנזימטי 1,7. המחייב הוא מונע בעיקר על ידי הכלאה משולש סליל בין CMPs monomeric וגדילי קולגן מפוגלים. בגלל CMPs עצמי להרכיב לתוך סלילים משולשים homotrimeric בטמפרטורת חדר עם כוח מניע קטן לכלת קולגן, CMP בכלוב [(לע&quot;מ) 4 NB-GPO (לע&quot;מ) 4, המיועד כNB (לע&quot;מ) 9, O: hydroxyproline], פותח , אשר מכיל nitrobenzyl צילום cleavableקבוצה (NB) שצורף לגליצין של הפפטיד המרכזי. קבוצת כלוב NB sterically מונעת CMP ממתקפל לתוך סליל משולש, ובכל זאת, להסרת מקבוצת הכלוב על ידי קרינת UV מעוררת את קיפול הסליל המשולש וכלת קולגן 1 באופן מיידי. כאשר CMPs monomeric שכותרתו עם אינפרא אדום הקרוב fluorophores (NIR) מערכתי מועברים למודל עכברים, הם יכולים באופן ספציפי למקד ולאפשר בתחום ההדמיה vivo של collagens מפוגל ברקמות עוברות רגיל (למשל בעצמות וסחוס) ופתולוגיים (למשל בגידולים) שיפוץ 1 . גם CMPs שכותרתו fluorescently יכולה לשמש להדמית collagens בסעיפי רקמות היסטולוגית. במחקר היסטולוגית, רקמות שנקטפו לעתים קרובות נשמרו על ידי קיבוע כדי לשמור על המרכיבים התאיים ומורפולוגיה רקמה הכוללת מהידרדרות. נהלי תיקון, הכוללים חום, וטיפול בממסים אורגניים, ולינקין הצולב הכימיריאגנטים g (למשל paraformaldehyde), לפגל מבנה הסליל המשולש של הקולגן 8. denaturation זה יוצר אתרים עבור הכלאה CMP. הוכח שCMPs שכותרתו fluorescently במיוחד יכול להיקשר collagens בסעיפי רקמות קבועים (למשל עור, קרנית, ועצם) אפילו בצורה יעילה יותר מאשר נוגדנים נגד קולגן, אשר אפשרו זיהוי קליל של תנאים פתולוגיים ברקמות כבד fibrotic 9. CMP מטרות גדילי קולגן מפוגלים המכילים רצף חומצות אמינו של מוטיבים סליל משולשים, שהוא משותף לכל סוגי collagens. לכן יכול להיחשב CMP סוכן מכתים קולגן ספקטרום רחב. כאן, אנו מציגים הפרוצדורות מפורטות עבור i) הדמיה גדילים מפוגלים קולגן in vivo ו collagens ii) באופן חזותי בסעיפי רקמות vivo לשעבר באמצעות CMPs בכלוב שכותרתו fluorescently. תג ניר, IR680, היה מצומדת לCMP בכלוב עבור הדמיה חיה, whilcarboxyfluorescein דואר (CF) שימש בעבודת צביעת רקמות לתאימות שלה עם מיקרוסקופים הקרינה סטנדרטיים. פרוטוקול זה מתמקד ביישום ההדמיה של CMPs כקשור לשיפוץ קולגן. ניתן למצוא שיטות לסינתזת CMP בדוחות קודמים 1,7,9-15. בדו&quot;ח זה וידאו, הדמיה רקמות שלד בעכברים נורמלים וחתכים רקמה של קרנית עכבר נבחרו למטרה הפגנה, אולם השיטות שהוצגו כאן יכולות להיות מיושמות בקלות לפתולוגיות רבות ומודלים ביולוגיים מעורבים שיפוץ קולגן (למשל גידולים, ריפוי פצעים), כמו גם כמעט לכל דגימת רקמת התחילית המכילה collagens.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IRdye 680RD Maleimide (IR680)</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">929-71050</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5(6)-Carboxyfluorescein</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">21877-5G-F</td>
			<td style="width:167px;">Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:123px;">Advanced Chemtech</td>
			<td style="width:137px;">YC2200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:123px;">Butler Veterinary Supply</td>
			<td style="width:137px;">4/4/5260</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">G9023-10ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A9647</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:137px;">10236276001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluoroshield mounting medium</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">F6182-20ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="4" height="22" style="height:22px;width:643px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:137px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:123px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:137px;">1447T17</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Pearl impulse imager</td>
			<td style="width:123px;">LI-COR</td>
			<td style="width:137px;">9400</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Surgical forceps and scissors</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EasyDip slide staining system</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;">M900-12B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">20-place cardboard microscope slide tray</td>
			<td style="width:123px;">Light Labs</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">12-545-c</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:137px;">Eclipse TE2000-E</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging denatured collagen strands in vivo and ex vivo via photo-triggered hybridization of caged collagen mimetic peptides

קולגן הוא מרכיב מבני עיקרי של מטריקס תאי התומך בהקמה ובתחזוקת רקמות. למרות שיפוץ קולגן הוא חלק בלתי נפרד מהתחדשות רקמות נורמלית, כמות מוגזמת של פעילות שיפוץ עוסקת בגידולים, דלקת פרקים, ומצבים פתולוגיים רבים אחרים. במהלך שיפוץ קולגן, מבנה הסליל המשולש של מולקולות קולגן מופר על ידי פרוטאזות בסביבה תאית. בנוסף, collagens נוכח בהרבה דגימות רקמה היסטולוגית הם מפוגל באופן חלקי על ידי תהליכי הקיבוע ושימור. לכן, גדילי קולגן מפוגל אלה יכולים לשרת מטרות יעילות באותה מידה להדמיה ביולוגית. אנחנו פיתחנו בעבר פפטיד בכלוב כוזב קולגן (CMP) שיכול להיות ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים על ידי יצירת מבנה סליל משולש, אשר הוא ייחודי לcollagens-מופעל על תמונה. מטרות העל של הליך זה הם אני) לתמונת גדילי קולגן מפוגלים resulting מפעילות שיפוץ נורמלית in vivo, וii) כדי להמחיש collagens בסעיפי רקמות vivo לשעבר באמצעות CMPs בכלוב-מופעל על התמונה. כדי להשיג הכלאה ומוצלחת in vivo לשעבר vivo הדמיה אפקטיביות, CMPs בכלוב שכותרתו fluorescently הם או מייד לפני הזרקה תוך ורידית הופעל צילום, או מופעלים ישירות על חלקי רקמות. remolding קולגן שלד הנורמלי בעכברים בעירום וcollagens בסעיפי רקמת קרנית עכבר קידומת הם צילמו בהליך זה. שיטת ההדמיה המבוססת על טכנולוגית הכלאת CMP-קולגן המוצגת כאן עלולה להוביל להבנה עמוקה יותר של תהליך שיפוץ רקמות, כמו גם לאפשר פיתוח של כלי אבחון חדשים למחלות הקשורות לפעילות שיפוץ הגבוה קולגן.

איור 1 מציג תוצאה אופיינית של איך IR680-AHX-(לע&quot;מ), מופעל על תמונה 9 מפיצה בעכבר עירום SKH1 הנשי בריא לאחר הודעה 24-96 שעה הזרקה. זה מראה הצטברות CMP לכאורה בשלד לאחר 24 HPI, ובשלב זה רוב פפטידים מאוגדים כבר פינה במידה רבה. התהליך של CMP והכלאה עם גדילי קולגן שיפוץ נראה איטי יחסית, במיוחד בניגוד לבדיקות אחרות הדמיה פפטיד (למשל RGD 16). זה ככל הנראה בגלל שיעור הקיפול האיטי של הסליל המשולש קולגן 17,18. עם זאת, לאחר הכלאה, גדילי CMP הם קשורים מאוד לרקמות collagenous, כמו שרק הפחתת אות קלה נתפס לאחר 24 HPI (איור 1). ב96 HPI, תמונת הקרינה NIR של העכבר לאחר הסרת העור מדגימה בבירור את ספיגת השלד של IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 בעמוד השדרה וצלעות, כמו גם בתוך הברכיים, קרסוליים,פרקי ידיים, ולסתות התחתונות (איור 2 א). בvivo לשעבר צביעת רקמות, CMPs כלוב fluorescently שכותרת-מופעל על תמונה במיוחד להכליא גדילי קולגן מפוגלים בסעיפי רקמות. באיור 3, מכתים CMP מגלה בבירור סיבי הקולגן במקביל הקנס בסטרומה של הקרנית, אשר מדגימה את השימוש בו כסוכן מכתים ספציפי קולגן. <img alt="איור 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig1.jpg" /> איור 1. תמונות הקרינה ניר סידוריים של עכבר בעירום בהזרקה לווריד עם תמונה-decaged IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 מראים ספיגת שלד על פני ארבעה ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51052/51052fig2.jpg&quot; src איור 2. תמונות הקרינה NIR של עכברים מנוהלים עם צילום decaged IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 (א), בכלוב IR680-AHX-NB (לע&quot;מ) 9 ללא חשיפה לקרינת UV (ב &#39;), prefolded משולש סליל [IR680-AHX-(לע&quot;מ ) 9] 3 (ג), או ניתק חום חד גדיל IR680-AHX-(לע&quot;מ) 9 (ד &#39;) בשעה 96 HPI לאחר הסרת עור. מיקוד שלד על ידי CMP ניתן לצפות רק בA ו-D. אותות הקרינה ניר מוצגים בקנה מידת קשת בענן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51052/51052fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51052/51052fig3.jpg" /> איור 3. micrographs הקרינה של שיתוף עכברקטע רקמת rneal התחילית בparaformaldehyde, ומוכתם עם DAPI וCF-מופעל על תמונה (לע&quot;מ) 9 באמצעות פרוטוקול 2, בו מוצגות stroma הצפוף collagenous (מוכתם על ידי CMP, בירוק), כמו גם אפיתל הסלולרי והאנדותל (מוכתם על ידי DAPI, בכחול ) (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר).

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides at JoVE.com

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

הליך זה מדגים in vivo ליד ההדמיה IR הקרינה של פעילויות שיפוץ קולגן בעכברים, כמו גם vivo מכתים לשעבר של collagens בסעיפי רקמות באמצעות פפטידים כוזב קולגן בכלוב שיכול להיות מופעל על תמונה ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים.

הדמיה גידים קולגן המפוגל<em&gt; בvivo</em&gt; ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; באמצעות הכלאה-מופעל על תמונה של Caged קולגן כוזב פפטידים

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

imaging-denatured-collagen-strands-vivo-ex-vivo-via-photo-triggered

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

11.8K Views.  University of Utah.  הליך זה מדגים in vivo ליד ההדמיה IR הקרינה של פעילויות שיפוץ קולגן בעכברים, כמו גם vivo מכתים לשעבר של collagens בסעיפי רקמות באמצעות פפטידים כוזב קולגן בכלוב שיכול להיות מופעל על תמונה ללהכליא עם גדילי קולגן מפוגלים. 

Video: Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized tissues.  The modules can be made of collagen as well as other gelable or crosslinkable materials.  They are approximately 2 mm in length and 0.7 mm in diameter upon fabrication but shrink in size with embedded cells or when the modules are coated with endothelial cells.  The modules individually are small enough that the embedded cells are within the diffusion limit of oxygen and other nutrients but modules can be packed together to form larger tissues that are perfusable.  These tissues are modular in construction because different cell types can be embedded in or coated on the modules before they are packed together to form complex tissues.  There are three main steps to making the modules: (1) neutralizing the collagen and embedding cells in it, (2) gelling the collagen in the tube and cutting the modules and (3) coating the modules with endothelial cells.

Creation of micro-tissues using cylindrical collagen gels, called modules, that contain embedded cells and which surface is coated with endothelial cells.

ייצור של מיקרו-רקמות באמצעות מודולים של קולגן ג&#39;ל התאים המכילים

This protocol describes the fabrication of a type of micro-tissues called modules.  The module approach generates uniform, scalable and vascularized ...

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional (3D) tissue wherein hematopoiesis is regulated by spatially organized cellular microenvironments termed niches2-4. The organization of the BM niches is critical for the function or dysfunction of normal or malignant BM5. Therefore a better understanding of the in vivo microenvironment using an ex vivo mimicry would help us elucidate the molecular, cellular and microenvironmental determinants of leukemogenesis6.
Currently, hematopoietic cells are cultured in vitro in two-dimensional (2D) tissue culture flasks/well-plates7 requiring either co-culture with allogenic or xenogenic stromal cells or addition of exogenous cytokines8. These conditions are artificial and differ from the in vivo microenvironment in that they lack the 3D cellular niches and expose the cells to abnormally high cytokine concentrations which can result in differentiation and loss of pluripotency9,10.
Herein, we present a novel 3D bone marrow culture system that simulates the in vivo 3D growth environment and supports multilineage hematopoiesis in the absence of exogenous growth factors. The highly porous scaffold used in this system made of polyurethane (PU), facilitates high-density cell growth across a higher specific surface area than the conventional monolayer culture in 2D11. Our work has indicated that this model supported the growth of human cord blood (CB) mononuclear cells (MNC)12 and primary leukemic cells in the absence of exogenous cytokines. This novel 3D mimicry provides a viable platform for the development of a human experimental model to study hematopoiesis and to explore novel treatments for leukemia.

Ex vivo Mimicry of Normal and Abnormal Human Hematopoiesis

A 3D culture system for hematopoiesis is described using human cord blood and leukemic bone marrow cells. The method is based on the use of a porous synthetic polyurethane scaffold coated with extracellular matrix proteins. This scaffold is adaptable to accommodate a wide range of cells.

Ex vivo החקיינות של hematopoiesis אנושיים בריאים חריגה

Hematopoietic stem cells require a unique microenvironment in order to sustain blood cell formation1; the bone marrow (BM) is a complex three-dimensional ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

הנדסת ג&#39;ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

כימות ארגון קולגן פיברילאר עם כלים מבוססי המרה של Curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ultrasound pulsing schemes, or novel transducers for contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery. The reasons for this are the accessibility of the embryo and vessel network of the CAM as well as the low costs of the model. An important step to get access to the embryo and CAM vessels is to take the egg content out of the eggshell. In this protocol, three methods for taking the content out of the eggshell between day 5 and&#160;8 of incubation are described thus allowing the embryos to develop inside the eggshell up to these days. The described methods only require simple tools and equipment and yield a higher survival success rate of 90% for 5-day, 75% for 6-day, 50% for 7-day, and 60% for 8-day old incubated eggs in comparison to ex ovo cultured embryos (~50%). The protocol also describes how to inject cavitation nuclei, such as microbubbles, into the CAM vascular system, how to separate the membrane containing the embryo and CAM from the rest of the egg content for optically transparent studies, and how to use the chicken embryo and CAM in a variety of short-term ultrasound experiments. The in vivo&#160;chicken embryo and CAM model is extremely relevant to investigate novel imaging protocols, ultrasound contrast agents, and ultrasound pulsing schemes for contrast-enhanced ultrasound imaging, and to unravel the mechanisms of ultrasound-mediated drug delivery.

This protocol describes three methods on how to obtain and use 5 to 8-day old chicken embryos and their chorioallantoic membrane (CAM) as an in vivo&#160;model to study contrast-enhanced ultrasound imaging and microbubble-mediated drug delivery.