המחברים תודה להכיר ד&quot;ר סילי Gurchenkov (מכון קירי) לרכישה ועיבוד תמונה באיור 3 ומתקן ההדמיה PICT-IBISA (מכון קירי). עבודה זו נתמכה על ידי ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 וPIC 3D - קומפלקס בדגמים סלולריים חוץ גופית.

1. טמרה-קולגן אני תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון טמרה מ&quot;ל 10 מ&quot;ג / 2.5 מ&quot;ל על ידי הוספת DMSO ל25 מ&quot;ג האבקה סיפקה טמרה. לפזר אותו על ידי vortexing עד לפירוק מוחלט. חנות ב -20 מעלות צלזיוס, ולהגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2 ליטר של הצפת תיוג (0.25 מ &#39;3 NaHCO, 0.4 מ&#39; NaCl). כדי להתאים את pH 9.5 באמצעות פתרון M 10 של NaOH. לשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות ב4 º C, אלא אם כן חומר האמור וניאון אחרת הוא מוגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק חד פעמי 1 מ&quot;ל עם 1 מ&quot;ל של קולגן עכברוש זנב המרוכז מאוד פתרון. פתרונות קולגן ריכוז גבוהים ניתנים בדרך כלל בריכוזים סביב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והם מאוד צמיג. הקפד לתפעל אותו לאט, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט 21 G מזרק, להזריק קולגן לקלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה של 10,000 MWCO נותק. השתמש בזהירות כדי להימנע מDamaגינג הקרום עם המחט. הסר את כל האוויר מקלטת הדיאליזה על ידי משיכת הבוכנה המזרק. Dialyze אותו הלילה נגד 1 ליטר של הצפת תיוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 100 μl של פתרון טמרה מ&quot;ל 10 מ&quot;ג / 900 עם μl של הצפת תיוג. הערה: זה צריך להיעשות עם שני פתרון טמרה והצפת תיוג בטמפרטורת חדר מאז DMSO קופא על 4 מעלות צלסיוס לאחר ערבוב, להביא את פתרון טמרה המדולל בחזרה עד 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את קולגן מקלטת הדיאליזה באמצעות מזרק חד פעמי 2 מ&quot;ל עם מחט 21 G מזרק. מערבבים 1 מ&quot;ל של פתרון קולגן dialyzed עם 1 מ&quot;ל של תמיסה מדוללת טמרה ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר קולגן / תמהיל טמרה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל ו דגירה לילה עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 2 מ&quot;ל של קולגן טמרה שכותרתו לתוך קלטת presoaked 3 מיליליטר דיאליזה וdialyze הלילה נגד 1 ליטר של תיוג הצפת כדי להסיר את העודפים של צבע ללא תשלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשחזר במעבדת טמרהקולגן eLED לפתרון המקורי קולגן, הצב את קלטת הדיאליזה לתוך 1 ליטר של 0.2% (V / V) פתרון חומצה אצטית, pH 4, וdialyze בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח הסופי של קולגן טמרה שכותרתו ולחשב הריכוז הסופי שלו, בהתחשב בהיקף הראשוני והריכוז של פתרון קולגן בשימוש. חנות ב 4 המעלות צלסיוס </li></ol> 2. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם תאים בודדים משובצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של 2-Mix טמרה קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PBS 10x ו1 N NaOH בכמויות מתאימות כדי להשיג את הריכוז הרצוי וקולגן pH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;למיקס של טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x עם 5 μl של 1N NaOH. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרת מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​3.68 ו415.71 μl של 4.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קולגן ללא תווית. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תאים תלויים בנפח המתאים של מדיום סלולרי צונן ללא FBS לתערובת טמרה-קולגן כדי להשיג צפיפות תאים סופית של 10 5 תאים / מ&quot;ל וריכוז קולגן סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 388.81 μl של מדיה המכיל 10 5 תאים. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל במבחן ה-pH שלטיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו לפלמר בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ&quot;מ והם 2 מ&quot;מ. כאשר polymerized, קולגן הופך לג&#39;ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות קולגן / תא. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לנדוד במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים). </li></ol> 3. מטריצות 3D טמרה-קולגן עם spheroids הסלולרי משובץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הנפח של 2 מ&quot;ג / מיליליטר טמרה-M קולגןIX ההכרחי לניסוי. תמיד להכין 20% יותר לחשבון עבור pipetting הפסדים בשל צמיגות הגבוהה קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של PBS 10x ו1 N NaOH. מסנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלסיוס מנקודה זו, כל הפעולות מתבצעות על קרח אלא אם צוין אחרת ובתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים PBS 10x, 1 N NaOH ותקשורת סלולרי ללא FBS בכמויות מתאימות כדי להשיג את ריכוז קולגן הרצוי וpH 7.4. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של מיקס טמרה-קולגן ב-pH 7.4, לשלב μl 100 של PBS 10x, 5 μl של 1 N NaOH ו388.81 μl של תקשורת. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפחים המתאימים של שניהם קולגן טמרה שכותרתו וקולגן ללא תווית ביחס 01:06 להשיג ריכוז קולגן כולל סופי של 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לדוגמה, עבור נפח סופי של 1 מ&quot;ל של 2 מיקס טמרה-קולגן מ&quot;ג / מ&quot;ל, להוסיף 90.48 μl של קולגן טמרה שכותרתו 3.68 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו 415.71 μl של 4.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של unlaקולגן beled. מערבבים היטב ולאט לאט על ידי pipetting, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. לאשר את החומציות על ידי בדיקת 10 μl של התמהיל על רצועת בדיקת חומציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 טיפות μl פיפטה של ​​מיקס טמרה-קולגן על מנות תחתיות זכוכית ולאפשר לו ליזום פילמור במשך 2-5 דקות. זה יעזור כדי למנוע טביעתה של spheroids ידי מעט מגביר את צמיגות הג&#39;ל. יש 100 טיפות קולגן μl קוטר טיפוסי של 7 מ&quot;מ והם 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף אליפטית תא ולמקם אותו על צלחת פטרי נקי. הסר את כל עודף של נוזל וresuspend זה ב10 μl של מיקס טמרה-קולגן. זה חשוב כדי למנוע דילול של קולגן עם תקשורת סלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה P20, לאסוף קולגן המושעה אליפטית ולמקם אותו בחלק העליון של מרכז ירידת מיקס טמרה-קולגן μl 100. הערה: אין יותר ממקום אחד לכל טיפת אליפטית קולגן, כיוון שהם יכולים להשפיע על כל קיבולת אחרת לפלוש ו / או להעביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מיקס טמרה-קולגן לפוליmerize בטמפרטורת חדר למשך 30-45 דקות. כאשר polymerized, קולגן הופך לג&#39;ל איש לבן. שים לב: מתן האפשרות לקולגן לפלמר מבלי לסגור את המנה תהיה למנוע היווצרות של סרט מים סביב ירידת קולגן, הפחתת ניתוק מהזכוכית. כדי להגדיל את הדבקות, יכולות להיות מצופים מנות זכוכית עם פולי-L-ליזין ב100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף בזהירות מדיום התרבות מספיק כדי לכסות את טיפות spheroids קולגן /. הימנע מנתיבים גבוהים של תקשורת או תנועות פתאומיות מאז טיפות קולגן יכולות בקלות לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על C º 37 10% באוויר humidified CO 2 למשך מספיק זמן לתאים לפלוש / להעביר במטריצה ​​(בדרך כלל 1-3 ימים). </li></ol> 4. מכתים immunofluorescence 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את התקשורת הסלולרי ולשטוף את מטריצות קולגן המכילות תאים / spheroids עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל לתקן ולחלץ תאים על ידי דוגרים עם חיץ חילוץ / קיבעון (PFA 4%,, סוכרוז 0.3% טריטון X-100 של 5% בPBS) למשך 5 דקות. להשלים עם חיץ Phalloidin מיקרומטר 2 ו 2 מיקרומטר טקסול להדמיה של שלד תא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לתקן את התאים עם PFA 4%, 5% סוכרוז ב-PBS למשך 30 דקות. לשטוף עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות נוגדנים עיקריים להכין PBS. דגירה תאים עם נוגדנים ראשוניים במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 המעלות צלסיוס הקפד להוסיף מספיק פתרון כדי לכסות את ירידת קולגן כולו. לצלחת תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ, 1.5-2 מ&quot;ל של תמיסה יהיה צורך בכך. הערה: כדי להפחית את עוצמת הקול של פתרון נוגדן, מכשול בלתי מסיס מים, כגון קו מעגל גריז סיליקון או טבעת PDMS, ניתן להציב סביב ירידת קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף 30 דקות 3x עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את נוגדנים משני אלקסה-מצומדות, phalloidin אלקסה מצומדות ופתרונות DAPI PBS. דגירה תאים עם הנוגדנים משני המתאימים עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3x 30 דקות עם 0.05% Tween-20 ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר עודפים של נוזל, להוסיף מספיק הרכבה תקשורת כדי למלא את תחתית צלחת תחתית הזכוכית (μl כ 500) ומניח על גבי coverslip 24 מ&quot;מ כדי לאטום. אל תלחץ כלפי מטה את coverslip כדי למנוע דחיסת טיפת קולגן ופגיעה בארגון 3D. </li></ol> 5. הדמיה לדוגמה ניתן להשתמש במיקרוסקופי confocal דיסק קלאסי או ספינינג. מעדיף מערכת הפוכה יש להשתמש כדי לקבוע את המרחק של התאים צלמו מתחתית הכוס. המערכת המשמשת לעבודה זו היא דיסק מסתובב confocal הפוכה מצויד במטרות נפט הטבילה 60X/1.4NA (עובד מרחקים 200 מיקרומטר ו130 מיקרומטר, בהתאמה) ו40X/1.3NA, מצלמה Photometrics CoolSNAP HQ2, 1392 x 1040 מערך הדמיה, 6.45 6.45 x מיקרומטר פיקסלים ונשלט על ידי תוכנת ההדמיה Metamorph. 405 ננומטר, 491 ננומטר, 561 ננומטר, ו633 ננומטר לייזרים משמשים בדרך כלל 30-50% בצריכת החשמל, ולקבל 1 binning של 2X 2 כדי להפחית את זמני חשיפה. מיקרוסקופ מצויד גם עם מנורה כספית וקוביות לסנן DAPI (400-418 ננומטר EXC; em 450-465), FITC (exc 478-495; 510-555) וטקסס אדומה (exc 560-580; 600 -650) להשתמש בעינית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מנורת הניאון, הצב את מטרת 40X באמצע טיפת קולגן. קבל סקירה כללית של המדגם, הן בציר XY וציר z. הקפד לא לסטות יותר מ -100 מיקרומטר מקצה ג&#39;ל על ציר XY בעת רכישה את התמונות, כדי למנוע השפעות קצה. כאשר spheroids הדמיה, לוודא שהם מתחת למרחק העבודה האובייקטיבי. שינוי אובייקטיבי אם מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב ההדמיה לחיות confocal. על ידי שימוש בלייזר ננומטר 561 לדמיין קולגן טמרה שכותרתו, החל מתחתית הכוס לקבוע את ערך Z שבו סיבי קולגן להתחיל להופיע. זהו המצע התחתון וZ = 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות כפתור הפוקוס, ללכת עד 100 מיקרומטר מZ = 0. תאים רק ב z = 100 מיקרומטראו לעיל צריך להיות צילמו כדי למנוע תופעות מתח מתחתית הזכוכית הנוקשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים לתמונה. לייעל את זמני חשיפת מצלמה וכוח לייזר לכל אורך גל. זמני חשיפה אופייניים עבור DAPI וAlexa-488 Phalloidin הם בין 100-200 אלפיות שני. זמני חשיפה למכתים נוגדן עשויים להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במצב חי confocal באמצעות לייזר המתאים כדי להמחיש את phalloidin מכתים ובאמצעות כפתור הפוקוס, להגדיר את מרווח סדרת Z על ידי קביעת ערכי z עליונים ותחתונים לנוכחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל Z-הצעד. למטרות 40X, השתמש 1 מיקרומטר. ל60x, השתמש 0.5 מיקרומטר. התחל רכישה. </li></ol>

<ol>
	<li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+(VLA-2)+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells.">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li><li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils.">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li><li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Z&#228;nker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44.">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+cancer:+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis.">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li><li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+adhesions+in+3D.">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li><li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy.">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li><li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo?.">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?.</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li><li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering.">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin.">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li><li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-linking+in+collagen+and+elastin.">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li><li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., B&#246;ni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils.">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li><li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels.">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li><li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP.">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix.">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li><li>Jawerth, L. M., M&#252;nster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy:+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks.">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li><li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+molecular+structure+to+tissue+architecture:+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy.">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול מתואר כאן לתייג קולגן fluorescently אני משתמש בטמרה מספקת שיטה מצוינת כדי לאפשר הדמיה קלה של ארגון רשת קולגן, באמצעות מיקרוסקופ confocal סטנדרטי מצוידים בליזר ננומטר 561. יתרון של שיטה זו בהשוואה למיקרוסקופיה confocal ההחזרה הוא יכולת סיבי קולגן תמונה עמוקות יותר לתוך מט?...

התחום של נדידת תאים כבר braving אל עולם הממד השלישי החדש. זה אינטואיטיבי ללמוד נדידת תאים בסביבה הדומה ביותר הפיזיולוגי אחת, ולכן, תלת ממדי (3D). עם זאת, בשל מגבלות טכניות, מחקרי נדידת התאים ביותר נעשו ניתוח תנועת תא על פני מצעים דו ממד (2D) נוקשים, או ללא טיפול או מצופה עם מטריקס (ECM) חלבונים תאיים מתאימים. המחקרים הראשונים המוקדשים לנדידת תאים בשלושה סריגי קולגן ממדיים לחזור מעל 20 שנים 1-3. עם זאת, רק ב -5 השנים האחרונות זה הפך להיות ברור כי תאים נודדים באופן מהותי יכולים שיהיו שונים במורפולוגיה ובמצב של הגירה בהתאם ממדי של המצע שלהם. ב 2D, תאים פנו מצע עם פני השטח הגחון שלהם באמצעות הידבקויות מוקד בלבד, וכתוצאה מכך היווצרות של בליטות שטוחות רחבות (lamellipodia) עםבליטות דמויות אצבע מוטבעות (filopodia) בקצה המוביל שלהם. מבנים אלה, יחד עם סיבי מתח המחברים את התא הקדמי לקצה הנגרר, הם האמינו להיות מכריע עבור תנועת תא ב2D. במטריצות 3D, תאים הם בדרך כלל מוארכים יותר, עם תא השטח כולו יצירת קשר עם ECM, גורמים לשינויים ניכרים במבנה ואת הרלוונטיות של פעילות של רבים ממבנים אלה. לעומת זאת, תכונות סלולריות אחרות להשיג רלוונטיות בהגירת 3D, כגון עיוות גרעינית ומבנים מעורבים בECM שיפוץ 4. למרות שינויים אלה ידועים מורפולוגיים, כמו גם הבדלים במצבי הגירת 5-7, אשר יכול להשתנות בהתאם לECM וסוגי תאים, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין יוצא דופן. עבודה עם מטריצות 3D עבות וצפופות נושא קשיים טכניים, כגון הדמיה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, וחוסר תאימות עם מרבית staפרוטוקולי ndard מותאמים לתרבויות 2D, כמו תיוג immunofluorescent של חלבונים אנדוגניים. כמו כן, משום שהשימוש במטריצות 3D הוא גישה חדשה יחסית, חוקרים עדיין בודקים את התנאים הטובים ביותר לדומים למצבים ספציפיים בvivo, כגון ארכיטקטורת סטרומה נורמלית של איברים או רקמות שונות בארגון ECM סביב גידול. הבדלים בתוצאות על ידי קבוצות שונות הנוגעות, למשל, מצבי סרטן תאים של הגירה או קיומן של הידבקויות מוקד, יצרו מחלוקת 8. הרבה מאמץ הוקדשה לאחרונה כדי להגיע להסכמה במונחים של ECM אופי כימי, גודל נקבובית, עובי סיבים, ומטריצת קשיחות. סוגים רבים ושונים של ECMS 3D משמשים כיום, שונים ממטריצות נגזרות סלולריים לmatrigel זמין מסחרי, קולגן שור pepsinized אני, או קולגן זנב החולדה nonpepsinized י כל אחד מהמטריצות האלה יש תכונות פיסיקליות וכימיות ספציפיות ואחד צריך רלהte המטריצה ​​של בחירה לתהליך הפיזיולוגי הנלמד. בנוסף, עובי וגודל נקבובית סיבים יכול להיות תלוי בתנאים פילמור, כגון pH וטמפרטורה 9,10. קשירה ולמרחק ממצעים קשיחים כגון זכוכית, ניתן גם לשנות את תכונות האלסטיות של המטריצה ​​10,11. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. שיטות להכנת spheroids תאים סרטניים בעבר תאר, את אלה הפופולריים ביותר להיות שיטת טיפה התלויה 12,13 ושיטת צלחת agarose המצופה 14. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, קולגן זנב החולדה nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, הוא משמש ב2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. קולגן חומצת החילוץ Nonpepsinized אני מזנב חולדה שומר שני טרמינל C-N-וtelopeptides, חלקי nonhelical של מולקולת הקולגן אחראי להאם של קולגן intermoleccrosslinking תואר בלבד ויציבות fibrilar 15. יחד, בתנאים אלה יאפשר היווצרות של רשתות קולגן שדומים באופן הדוק ביותר את אלה שנצפו בvivo 10. כדי לאפשר הדמיה של סיבי קולגן, הן בתרבויות קבועות וחיים, פרוטוקול מפורט מסופק לתייג הקולגן במבחנה 10 באמצעות 5 fluorescently - (ו- 6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה), אסתר succinimidyl. פרוטוקול זה הותאם מBaici et al. 16,17, בי isothiocyanate ההעמסה משמש לתייג מולקולות מסיסים קולגן. וכהעמסה, טמרה היא צבע פלואורסצנטי אמינו-reactive שמגיב עם קבוצות nonprotonated aliphatic אמינו של חלבונים, כגון קבוצת אמינו החופשית בN-הסופית, וחשוב יותר, קבוצה אמינית הצד של lysines. תגובה זו מתרחשת רק ב-pH הבסיסי, כאשר קבוצת אמינו ליזין היא בצורת nonprotonated. בנוסף לטמרה להיות יציבה יותר מהעמסה עלזמן, ספקטרום הפליטה שלה נופל על מגוון הכתום / אדום (= 555/518 ננומטר לשעבר / EM), אשר יכול להיות משולב מועילה להדמית תא חי של חלבוני ה-GFP-מתויגים. שימוש במולקולות מסיסים קולגן שכותרתו עם צבעי אמינו תגובתי אינו משפיעה על תהליך פילמור ולא הצפיפות, הגודל נקבובית ומעמד crosslinking של מטריצת הקולגן 10,16,18,19. פרוטוקול זה כולל גם את שיטה לתיוג immunofluorescent 3D של חלבונים אנדוגניים, אשר עבר אופטימיזציה נוספת לתייג את שלד התא או חלבונים הקשורים cytoskeleton. המיקוד הסופי של פרוטוקול זה הוא על שיטות לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תרבויות 3D באמצעות מיקרוסקופיה confocal עם תרומה מופחתת מcoverslips הזכוכית הנוקשים על מתח מטריצת הקולגן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<colgroup>
		<col span="2" />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TAMRA, SE</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:136px;">C-1171</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen High Concentration</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat tail Collagen</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taxol (Paxitel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-alpha Tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 488 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>106 226 89 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis Cassette</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>66380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bottom dishes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris 7.2.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3d

נדידת תאים באופן מסורתי נחקרה במצעי 2D. עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר שיש צורך ללמוד את נדידת תאים בסביבות 3D מתאימות יותר, שדומים יותר טוב הממדיות של התהליכים הפיסיולוגיים בשאלה. תאים נודדים באופן משמעותי יכולים להיות שונה במורפולוגיה ובמצב של הגירה שלהם, תלוי אם הם נעים על מצעי 2D או 3D. בשל קשיים טכניים ותאימויות עם פרוטוקולים הסטנדרטיים ביותר, ניתוח מבני ותפקודי של תאים מוטבעים בתוך מטריצות 3D עדיין נדיר. מאמר זה מתאר שיטות להכנה והדמיה של תרביות תאים סרטניים 3D, או כתאים או spheroids בודדים. כמצע ECM מתאים לנדידת תאי סרטן, אנחנו משתמשים בקולגן זנב חולדת nonpepsinized אני polymerized בטמפרטורת חדר, ושכותרתו fluorescently כדי להקל הדמיה באמצעות מיקרוסקופים confocal סטנדרטיים. עבודה זו כוללת גם protocol תיוג immunofluorescent 3D של שלד תא תא אנדוגני. שימוש בפרוטוקולים אלה אנו מקווים לתרום לתיאור טוב יותר של ההרכב המולקולרי, לוקליזציה, ופונקציות של מבנים הסלולר ב-3D.

תיוג עכברוש זנב קולגן אני עם טמרה מאפשר הכנה קלה ויזואליזציה של רשתות קולגן 3D. פילמור איטי בטמפרטורת חדר בתוצאות היווצרות של רשתות קולגן עם ארגון דומה לאלה שנמצאו בvivo 10. כאן אנו מציגים פרוטוקול למכתים immunofluorescence של cytoskel...

Watch this Scientific Journal Video about Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D at JoVE.com

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D.

חושף את ארגון cytoskeletal של תאי סרטן פולשני ב-3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

15.6K Views.  Institut Curie.  מאמר זה מציג שיטה לתייג קולגן שניתן להשתמש בו גם תיקון נוסף ולהדמית חיה של תרביות תאי 3D fluorescently. כמו כן אנו מספקים פרוטוקול מותאם לדמיין חלבוני cytoskeletal אנדוגניים של תאים בתרבית בסביבות 3D. 

Video: Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

מולקולרי פרופיל של microenvironment הגידול פולש במודל 3 ממדים של תאי סרטן המעי הגס ו<em&gt; Ex vivo</em&gt; פיברובלסטים

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.

We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.

הערכה לא פולשנית של היעילות של ניו Therapeutics למעי פתולוגיות שימוש הדמיה אנדוסקופי סידורי של עכברים חיים

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

חומוס לב הפלישה Assay עבור בדיקת הפולשנות של תאי סרטן והפעילות של תרכובות פוטנציאלית אנטי-פולשנית

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation תרמוגנית Preadipocytes להשתלה לבסיס מיון רקמת שומן

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

פולשנית רוחבי אבי העורקים התכווצות עכברים

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...