המחברים רוצים להכיר קרן המחקר של הנשיא מאוניברסיטת סנט לואיס זכתה לWSN

1. תחזוקה של כלובי אוכלוסייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על כלובי אוכלוסייה ב ° C25 על מחזור אור חשוך שעות 12. כל עוד קבוצות ביקורת והניסוי נחשפות לאותם תנאי התאורה, אז בטכניקה זו ניתן לבצע בסביבת מעבדה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לנקבות להטיל את ביצי לילה על צלחות מיץ תפוחים אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף זחלים שבקעו זה עתה על ידי שמירה על צלחות עם ביצים שהופקדו זה עתה ב25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מניחים מנה קטנה של שמרים במרכז הצלחת למשוך זחלים שבקעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 1 זחלי instar st שהגרו לשמרים להדביק במרכז צלחת מיץ תפוחים. השתמש במרית מתכת להעביר אותו לצלחת מיץ תפוחים טרי. שמרי רסק נוסף ניתן להוסיף על מנת להבטיח שיש מזון מתאים עד מבחני מבוצעים. גם צלחות מיץ ענבים ניתן להשתמש במקום של צלחות מיץ תפוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג l מאוחר 2 nd-מוקדם 3 rd instararvae ידי מתן 1 st instars לגיל ל40-48 שעה. בטווח זה שיעורי ההאכלה קבועים 13. גיל יכול להיות מאושר על ידי בדיקה של הפה הווים כפי שיש שינויים ברורים במבנה הזה עם כל נשירת זחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלים המאוחר 2 nd-מוקדם 3 rd instar נאספים עבור מבחני התנהגות על ידי בעדינות ולשטוף בהרחבה צלחות מיץ תפוחים עם מים ואיסוף הזחלים על מסנן רשת. הזחלים ואז הועברו לצלחת אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניתוחים מבוצעים במקביל באמצעות שליטה וחיות מעבדה. </li></ol> 2. פרדיגמה התנהגות - נידות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח זחל instar 3 rd בודד על מצע אגר 2% בצלחת תרבית רקמת 100 מ&quot;מ ולאפשר את הזחל להסתגל ל30 שניות. זחלים להשתמש sclerites cephalopharyngeal (ווי פה) כדי להניע את גופם על פני השטח של המצע אגר. הדבר נעשה על צלחת נפרדת כי אנילא קשה יותר לדמיין את הגוף של ההתכווצויות בשמרי הפתרון כמו בעלי החיים הוא כמעט באותו הצבע כמו השמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות ולהקליט כל תנועה אחורית לקדמית מעל המצע לתקופה של 1 דקות. n = 20 עבור כל גנוטיפ. לא יותר מ 10 בעלי חיים צריכים להיות assayed לכל צלחת. </li></ol> 3. פרדיגמה התנהגות - האכלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש Inox # 5 פינצטה בוטה, בזהירות להעביר את זחל instar 3 rd מהצלחת אגר של תנועה למרכז צלחת מלאה אגר ועליהן 5 מיליליטר של שמרי הפתרון של 2% אופה הופעל. ודא כי הפתרון הוא הומוגני כמו השמרים יישבו לאורך זמן. כאשר בשמרי הפתרון, זחלים יישארו במידה רבה במקום ומזון, הקלה על תצפית של ההתנהגות. שיעור התכווצויות וו פה ישירות בקורלציה עם כמות המזון ingested 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר זחל להסתגל ל30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות ולהקליט את מספרהתכווצויות וו פה לתקופה של 1 דקות. n = 20 עבור כל גנוטיפ. </li></ol> 4. וניתוחי גוט הזחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון קיבעון פורמלדהיד כיתה EM 4% בתמיסת מלח 1x שנאגרו פוספט (PBS) ומקום בכוס מקום 3 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח בזהירות נדודי אומץ זחל instar 3 rd מאוחר בצלחת זכוכית 3 היטב באמצעות פתרון 1x PBS, ולוודא בכל פעם שproventriculus נותר בשלמותה. עם מלקחיים אחד, החזק את הקצה האחורי, ועם אחרים, להחזיק את הפה הווים. בעוד מחזיק נייח הסוף האחורי, משוך בעדינות על ווי הפה כדי לקבל גישה לאומץ. הסר את כל רקמות קשורות (בלוטות רוק, מוח, גוף שומן, וכו &#39;), לאחר מכן להעביר את כל בטן למנת 3 המכילה גם את תיקון פורמלדהיד. נדודי 3 זחל instar rd משמשים כי בשלב זה של פיתוח, הזחל מפסיק האכלה בהכנה לpupariation, וproventriculus מנוקה של שמרים. </li> &lt;li&gt; דגירה אומץ ב 4 ° C למשך הלילה בתיבת תרבית רקמה אטומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הסרת פתרון קיבעון פורמלדהיד מבארות, להסיר את caeca הקיבה וקליפ midgut ~ 150 מיקרומטר 2 מproventriculus כך שבבירור ניתן לראות תחזיות ללא מכשול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לתקן פורמלדהיד מהבארות ולהחליף עם 1x PBT (1x PBS, 0.1% אלבומין בסרום שור ללא פרוטאז, 0.1% X-100 טריטון) פתרון חיץ. ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. הנח דגימות רקמה על הכתף מכאני בעת עושה כביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ב10 -6 M 5-HT כדי לשפר את האיתות של סרוטונין. ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. המחקרים קודמים הוכיחו כי זה ריכוז של 5-HT אקסוגניים אינו משפיע על ארכיטקטורה עצבית או צפיפות דליות בניתוחי immunohistochemical ופשוט משפר את האות ל15-16 יחס רעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 4 &amp;# 176; C למשך הלילה בנוגדן ראשוני נגד סרוטונין (חד שבטי שהועלה בעכבר או polyclonal גדלה ארנב). ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. הנח דגימות רקמה על הכתף מכאני בעת עושה כביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות בשני נוגדנים (IgG 568 העז אנטי עכבר או נגד הארנב אלקסה פלואוריד; 1:400 דילול). ביסודיות לשטוף את אומץ 6x עבור 10 דקות ב 1x PBT. הנח דגימות רקמה על הכתף מכאני בעת עושה כביסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב4 סודיום קרבונט מ&quot;מ עבור 10 דקות על הכתף מכאני, ואז לעלות ב4% סודיום קרבונט n-propyl gallate/20 מ&quot;מ, ולהציג תחת הקרינה. סודיום קרבונט משמש כדי להמיר את הדגימות למאגר וה-pH בשימוש בתקשורת mountant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של דגימות רקמת immunostained בהגדלה 400X לניתוח. </li></ol> 5. ניתוח עצבי המעגלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבי neurite היו לכמת (מספר וגודל של ורידיםומידת הסתעפות) באמצעות Neuroleucida וNeuroexplorer. עם זאת, זה גם יכול להיות מושלם באופן ידני או באמצעות פשוט neurite Tracer (יישום חינם שניתן להוריד באינטרנט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר תחזיות סיבים בודדות מהמוח אל proventriculus ולכמת מספר דליות, סניפים ומספר ורידים גדולים ליחידת אורך. סיבי העצב מקרינים מהמוח הם ארוזים לתוך עצב recurrens ואינם נגישים לניתוח עד שהם מגיעים proventriculus שבו הם נפרדים וfasciculate. </li></ol>

<ol>
	<li>Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+neurotransmitters+act+like+growth+factors?.">Why do neurotransmitters act like growth factors?.</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 .</li><li>Herlenius, E., Lagercrantz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+and+neuromodulators+during+early+human+development.">Neurotransmitters and neuromodulators during early human development.</a> Early Hum. Dev. 65, 21-37 .</li><li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine.">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li><li>Sodhi, M., Sanders-Bush, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+brain+development.">Serotonin and brain development.</a> International Review of Neurobiol. 59, 111-174 (2004).</li><li>Goldberg, J., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+the+neurotransmitter+serotonin+during+development+of+the+Helisoma+nervous+system.">Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system.</a> Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).</li><li>Goldberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+regulation+of+neurite+outgrowth+in+identified+neurons+from+mature+and+embryonic+Helisoma+triyolvis.">Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis.</a> Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).</li><li>Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+selectively+inhibits+growth+cone+motility+and+synaptogenesis+of+specific+identified+neurons.">Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons.</a> Sci. 226, 561-564 (1984).</li><li>Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+trophic+role+for+serotonin+in+the+development+of+a+simple+feeding+circuit.">A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit.</a> Dev. Neurosci. 32, 217-237 .</li><li>De Vry, J., Schreiber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+selected+serotonin+5-HT+1+and+5-HT+2+receptor+agonists+on+feeding+behavior:+possible+mechanisms+of+action.">Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).</li><li>Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spie&#223;, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+can+eat:+Establishing+the+existence+of+a+central+pattern+generator+for+feeding+in+third+instar+larvae+of+Drosophila+virilis+and+Drosophila+melanogaster.">The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).</li><li>Spie&#223;, R., Schoofs, A., Heinzel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+stomatogastric+nervous+system+associated+with+the+foregut+in+Drosophila+melanogaster+and+Calliphora+vicin+third+instar+larvae.">Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae.</a> J. Morphol. 269, 272-282 (2008).</li><li>Neckameyer, W. S., Bhatt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+actions+of+dopamine+on+the+development+of+a+serotonergic+feeding+circuit+in+Drosophila+melanogaster.">Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster.</a> Biomed Cent NeuroSci. 13, 26 (2012).</li><li>Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+larval+feeding+behavior+in+Drosophila+melanogaste.">Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste.</a> Genet. Res. 24, 163-173 (1975).</li><li>Joshi, A., Mueller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+higher+feeding+rate+in+Drosophila+due+to+density-dependent+natural+selection.">Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection.</a> Evolution. 42, 1090-1093 (1988).</li><li>Budnik, V., Wu, C., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+branching+of+serotonin-containing+neurons+in+Drosophila+mutants+unable+to+synthesize+serotonin+and+dopamine.">Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine.</a> J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).</li><li>Sykes, P., Condron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+sensitivity+to+serotonin+of+Drosophila+varicosities+in+the+central+nervous+system.">Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system.</a> Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).</li><li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+hot+and+cold:+behavioral+strategies,+neural+circuits,+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+inC.+elegansand+Drosophila.">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li><li>McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+sensing+across+species.">Temperature sensing across species.</a> Pflugers Archives. 454, 777-791 (2007).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

התפתחות חריגה של מעגל stomatogastric serotonergic, אשר מתרחש במהלך עובר מאוחר, תשפיע על התפקוד הבוגר שלה. שינויים בארכיטקטורת neurite innervating הבטן יכולה להיות מתואמת עם הפלט הפונקציונלי של המעגל, שהוא הזנת שיעור (שנמדדה על ידי התכווצויות וו פה בשמרי פתרון) (איור 1). השימוש במער?...

דרוזופילה היא מערכת מודל חזקה מאוד ללימוד פיתוח מעגלים עצבי בשל זמן דור מהיר, עלות ניסוי נמוכה, והיכולת לתפעל ולשלוט בגורמים גנטיים וסביבתיים. נוירוגנזה, ממצא נתיב עצבי וsynaptogenesis הם נשמרים בין בני האדם ודרוזופילה, ולכן המנגנונים ביצירה, שמירה ושינוי מעגלים עצביים הנשמרים גם כן. נוירוטרנסמיטורים קלאסיים, כגון סרוטונין (5-hydroxytryptamine, או 5-HT) יכולים לשמש כגורמי גדילה לפני אימוץ תפקידיהם כמולקולות איתות במעגלים העצביים הבוגר 1-3 מחקרים קודמים הראו כי מוטרדים רמות של 5-HT בעובר לשנות את הקישוריות של נוירונים בוגרים 4. אחרים הראו כי יישום מחוץ לרחם של 5-HT לנוירונים בתרבית Helisoma להדחיק תולדת neurite כמו גם synaptogenesis 5-7. בDrosophila, רמות 5-HT התפתחותיים הם הפוך קשורים למספר דליות וגודל, כמו גם את מידת aborization, לאורכו של neurites מקרינה למעי הקדמי ממערכת העצבים המרכזית 8. עצבית סרוטונין הוכח לווסת את התנהגויות האכלה במינים שונים, ובכלל זה דרוזופילה 8-9. מעגל ההאכלה בדרוזופילה הוא מעגל פשוט יחסית שיכול לשמש כמודל, כדי לקשר את הפלט הפונקציונלי (האכלה) עם שינויים בהתפתחות תחזיות axonal מהמוח אל המעי הקדמי. Schoofs et al. הראו כי האכלת זחל דרוזופילה מוסדרת על ידי גנרטורים דפוס מרכזיים המשפיעים על מערכת השרירים 10. בעוד האנטומיה שרירים הספציפית אינה מובנת לחלוטין, זה כבר הראה כי העצבים מחושים, עצב לסתי, ועצב אבזר prothoracic אחראים למטרות שרירים מעורבות בהתנהגות אכילה. רוב הנתונים מעורבים האנטומיה השרירים ועצבים של האכלה חסר חוליות מוגבלים לזחלי Calliphora. שיעור ההאכלה של זחלי instar שני ניתן להעריך על ידי הכחשה של sclerites cephalopharyngeal (ווי פה), וניתן לשחזור ותפוקה גבוהה. צלחות cephalopharyngeal מעוצבבים על ידי סיבים מתא עצב 5-HT המרכזי דרך העצב חזיתית. Proventriculus, או המעי הקדמי, הוא מעוצבבים על ידי סיבי serotonergic (recurrens עצב) שfasciculate בmidgut ואחראים להתכווצויות של המעי הקדמי (איור 1) 11-12. שינויים בהסתעפות באקסון והמספר והגודל של ורידים לאורך neurite, ניתן ונרשמת תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical. מניפולציה 5-HT העצבי במהלך פיתוח, במישרין או בעקיפין, יכול לשנות את הפלט הפונקציונלי של מעגל הזנה זו, שניתן להעריך ומתואם עם שינויים בmorpholoGY של ארכיטקטורת neurite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:217px;">Eclipse E-800 Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:217px;">Neuroleucida</td>
			<td style="width:175px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:115px;">NL-15</td>
			<td style="width:251px;">Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:217px;">Northern Eclipse</td>
			<td style="width:175px;">Empix Inc</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:251px;">Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:217px;">G-2E/C TRITC EX 528-553</td>
			<td style="width:175px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:115px;">96312</td>
			<td style="width:251px;">Filter for specific secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:217px;">N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded</td>
			<td style="width:175px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:115px;">MRH00400</td>
			<td style="width:251px;">Objective used for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:217px;">Simple Neurite Tracer</td>
			<td style="width:175px;">NIH Image J</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:251px;"><a href="http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer">http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional analysis of the larval feeding circuit in drosophila

מעגל האכלת serotonergic בזחלי melanogaster דרוזופילה יכול לשמש כדי לחקור מצעים עצביים חשיבות קריטית במהלך הפיתוח של המעגל. באמצעות הפלט הפונקציונלי של המעגל, האכלה, שינויים בארכיטקטורה העצבית של מערכת stomatogastric ניתן דמיינו. התנהגות האכלה יכולה להיות מוקלטת על ידי התבוננות בשיעור של הכחשה של קרסי הפה, אשר מקבלים עצבוב מהמוח. התנהגות של תנועה משמשת כביקורת פיזיולוגית להזנה, שכן זחלים להשתמש קרסי הפה שלהם כדי לעבור על פני מצע אגר. שינויים בהתנהגות אכילה יכולים להיות מתואמים עם ארכיטקטורת אקסון של neurites innervating המעיים. באמצעות אימונוהיסטוכימיה ניתן לחזות ולכמת את השינויים האלה. טיפול לא נכון של הזחלים בפרדיגמות התנהגות יכול לשנות את הנתונים כפי שהם רגישים מאוד למניפולציה. הדמיה תקינה של innervating ארכיטקטורת neuriteהבטן היא קריטית לכימות מדויק של מספר וגודל של ורידים, כמו גם את היקף צמתים סניף. ניתוח של רוב המעגלים רק לאפשר להדמיה של אדריכלות neurite או תופעות התנהגותיות, עם זאת, מודל זה מאפשר לתאם את הפלט הפונקציונלי של המעגל עם הליקויים באדריכלות עצבית.

מעגל האכלת serotonergic בזחל דרוזופילה יכול לשמש כמודל יעיל מאוד כדי לבחון את השפעתם של גורמים מסוימים בהתפתחות מערכת עצבים. על ידי quantitating שיעור האכלה, אפשר לקשר את ארכיטקטורת אקסון של מעגל ההאכלה עם הפלט הפונקציונלי שלה (איור 1). Assay של תנועה משמש כביקורת פיזי...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila at JoVE.com

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

מעגל ההאכלה בזחלי melanogaster דרוזופילה משמש מודל פשוט אך רב עוצמה המאפשר שינויים בשער האכלה להיות מתואמים עם שינויים במעגלים העצביים stomatogastric. מעגל זה מורכב מתאי עצב סרוטונין המרכזיים ששולחים תחזיות לפי הווים כמו גם המעי הקדמי.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

functional-analysis-of-the-larval-feeding-circuit-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

10.2K Views.  Saint Louis University School of Medicine.  מעגל ההאכלה בזחלי melanogaster דרוזופילה משמש מודל פשוט אך רב עוצמה המאפשר שינויים בשער האכלה להיות מתואמים עם שינויים במעגלים העצביים stomatogastric. מעגל זה מורכב מתאי עצב סרוטונין המרכזיים ששולחים תחזיות לפי הווים כמו גם המעי הקדמי. 

Video: Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...