אנו מודים לריחאן עריף וHassaan Shahawy לעבודת מצלמה, טריפטיכון גופטה ופרדריקה Alwes לסיוע שיפור טכניקת אבלציה התא, וחברי המעבדה Extavour למשוב על נתונים, וידאו וכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תאי גזע מכון הרווארד (מספר גרנט זרע SG-0057-10-00) קרן אליסון הרפואית (ניו Scholar פרס מספר AG-NS-07,010-10) לCGE, והפרסים הרווארד תכנית המחקר במכללה ל ARN.

תגובות שעשויות להיות מועילים בביצוע צעדים מסוימים מסומנות בכתב נטוי. 1. יום 1: הכנה של חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החומרים הבאים (ראה טבלה של חומרים וציוד): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 סנטימטר ו22 טפטפות פסטר סנטימטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סופר יהלומים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי ים מלאכותי מסונן (מליחות בין 0.0018-.0020) המכילה 1 מ&quot;ג / מיליליטר Amphotericin B (1:100 של פתרון מניות 100 מ&quot;ג / מיליליטר), 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין (01:50 של פתרון מניות המכיל 5,000 / מיליליטר יחידות פניצילין ו -5,000 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מסוננים מלאכותיים ים (מליחות בין 0.0018-0.0020) ללא תוספים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל פלסטיק גדול לזוג לדיור (לפחות 15 סנטימטר x 15 סנטימטר X 5 ס&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי קטנות (3 סנטימטר או 5 ס&quot;מ) מרופדות בSylgard </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פטרי (3 סנטימטר או 5 ס&quot;מ) קטנות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> watchglass או זכוכית רב גם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים (אנו משתמשים במלקחיים בוטים נגזרים לכאן ולכאןמלקחיים מ &#39;ישן דומון # 5 שנפגעו בטעות בנהלי מעבדה אחרות, שיש לנו לשנות את ייעודו באמצעות מלקחיים חידוד אבן, כדי להבטיח שקצות המלקחיים חלקים, ששני שיניים הן באותו אורך, ושכבר אין להם נקודות חדות. מלקחיים עדינים ביותר, כגון דומון # 5 מלקחיים חדשים, אינם רצויים כיוון שהם עלולים לפגוע בעוברים ו / או נקבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פסטר עם הסוף התרחבה (ראה שלב 1.2 להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי אחזור עובר מורכב מחוט דק, מעוקל טונגסטן מוטבע לתוך הסוף הדק של פיפטה פסטר (יכולים להיות מוחלפים על ידי חלופה ליישם; לראות 1.3 להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה בפה עם פתח קטן (ראה שלב 1.4 להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחט זכוכית עשויה מזכוכית משך נימים (ראה שלב 1.5 להלן) </li></ul> אין חומרים רעילים לבני אדם נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חוקרים צריכים להבטיח שהם לובשים כפפות או הלבוש מגן אחר כפי שנדרשו על ידי guidel ניהול הסיכוניםאינס של המוסד שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פיפטה התרחבה פסטר, ציון בסיבוב הראשון פיפטה פסטר 15 סנטימטר בנקודה שבי פיפטה תתחיל לצמצם עם סופר יהלומים, לעטוף את האזור קלע של פיפטה במגבת Kimwipe או נייר כדי להגן על האצבעות, ולאחר מכן בזהירות לשבור את הקצה בקו הציון. החזק את קצו השבור של פיפטה מעל להבת מבער בונזן במשך כמה שניות כדי להחליק את הקצוות. הפתיחה צריכה להיות מעט צרה יותר מהרוחב המרבי של טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפוך את הכלי לנתח תיל טונגסטן, הכנס תיל טונגסטן לסוף הזכוכית פיפטה פסטר 15 סנטימטר, ומחזיק לזמן קצר על אש מבער בונזן כדי להמס את הזכוכית, תיקון החוט במקום. שימוש במלקחיים בעדינות לעקומת קצה החוט לצורת מכור. ראה איור 3 לדוגמה לצורה מתאימה לכלי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את פתח קטן לפיפטה בפה, למשוך את הקצה הדק של פיפטה פסטר 22 סנטימטר לשני החלקים ovאה להבה, ולשבור את הקצה של הקצה הקטן. הכנס לסוף בעל פיפטה בפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מחט הזכוכית שתשמש לנקב לסטומרים של עניין במהלך הליך אבלציה באמצעות חולץ מחט. מחט בצורה כראוי מוצגת באיור 4. מחט זו משכה על חולץ מחט p97 סאטר באמצעות תכנית עם פרמטרים 2x (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 20, זמן = 250) + 1X (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 100, זמן = 250). התכנית הספציפית והמכשיר משמש לייצור את המחט יכולים להשתנות, אבל המחט חייבת להיות נקודה עדינה, ועם זאת גם להיות יציב מספיק כדי לא לשבור כאשר דחף נגד סיסית של העובר. </li></ol> 2. יום 1: זוגות התכנסות Parhyale מזווגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה פסטר התרחבה (שלב 1.2 לעיל) כדי לאסוף הזדווגות פ זוגות hawaiensis מיכל התרבות הגדול, ולהעביר אותם למכל המכיל ג נפרדלהישען מי ים מלאכותי. אין זה הכרחי כי מי ים זה להיות מסונן. עדיף לאסוף זוגות הזדווגות בשעתי אחר הצהריים המאוחרים ולהשאיר את הזוגות בטמפרטורת חדר (20-23 מעלות צלזיוס) בלילה, כך שלמחרת בבוקר, רוב העוברים יהיו כבר מופרים לאחרונה והופקדו, ולכן במחשוף שלבים המוקדם מתאים אבלציה. לאסוף לפחות 20 זוגות הזדווגות כדי להבטיח שכמה נקבות תהיה נשיאת עוברי שלב מוקדם על ידי מחשוף למחרת בבוקר. </li></ol> 3. יום 2: התכנסות Parhyale עוברים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוקר למחרת, להחדיר מי ים מלאכותי מסונן (FASW) עם CO 2. כמה מהנשים תהיה בשחייה חופשית מהזכרים שלהם במהלך הלילה; לאסוף נשים מופרדות אלה ומרדימים אותם בFASW / CO 2. הזכרים מזווגים הנותרים ניתן להסיר מיכל זוג הזדווגות וחזרו לתרבות הגדולה. זוגות הזדווגות שנותרו ניתן לשמור לאוסף עובר מאוחר יותרביום או ביום שלמחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הנקבה מורדמת אחת נושאת עובר לזכוכית שעון בFASW / CO 2. כל הנקבות מופרדות צפויות הפקידו ביצים, שיהיה גלוי על ידי העין כורודה חיוור או סגולים הספרואידים דרך צלחות coxal השקופה של הנקבות (איור 1 א). כדי לקבוע אם הם עובר בשלבי מחשוף מוקדמים ובכך מתאים לאבלציה blastomere, החוקר צריך להסיר את העוברים מהכיס להרהר ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צופה בהליך תחת מיקרוסקופ לנתח, לתפוס את צלחות coxal לאורך צד אחד של הגוף עם מלקחיים. עוברים יהיו גלויים בכיס הדגירה הגחון בין צלחות coxal אלה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכניס את הכלי הדק, מעוקל תיל (איור 3; צעד 1.3 לעיל) אל הקצה האחורי של כיס הדגירה, ועדינות להרים את החוט לקראת הסוף הקדמי של הנרתיק להרהר להפריד הגוזליםכיסויי נרתיק (אלה הותאמו נספחים הגחון נקראים oostegites 30), שפתח את הכיס והתרופפות העוברים. עוברים שנמצאים בשעה הראשונה של שהניח כולם סגורים בתוך קרום דק מאוד ושקוף שיהיה בקלות להיות מופר על ידי כלי התיל; קרום זה נעלם על ידי כ 2-3 שעות לאחר הטלת ביצים, ועוברים אינם מאוגדים לזה או לנקבה בכל דרך מנקודה זו ואילך בכל עובר. אם חוקרים מוצאים את זה לא נוח או קשה לתמרן את כלי התיל המעוקל להסיר את העוברים מכיס הדגירה, אלטרנטיבי ליישם עשוי לשמש, כל עוד התנועות עדינות ולא בלחץ קשה מוחל על העוברים או את כיס הדגירה. כלים אחרים מתאימים להסרת עוברים מכיס הדגירה כוללים מלקחיים קהות או נימי זכוכית עם קצה אטום ומוחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי כדי לשטוף מים דרך כיס הדגירה נפתח, דוחף החוצה tהוא עובר, שאמור ליישב לתחתית של זכוכית השעון. העבר את הנקבה כדי לנקות FASW (ללא CO 2), כדי לאפשר התאוששות לפני reintroducing לתרבות המרכזית. ניתן להציב נקבות מרובות לתוך את אותה המנה התאוששות, אלא לאפשר נקבות כדי להחלים לחלוטין לפני שמחזירים אותם לתרבות הראשית, כיוון שהם עלולים להיאכל על ידי בעלי חיים אחרים אם הם עדיין מורדמים באופן חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי להעביר את העוברים לצלחת פטרי עם FASW הנקי, ולהציג תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בשלב העוברי שלהם. עוברים נפרדים שנמצאים במחשוף השלישי (שלב 4 5), אשר מתאים להליך זה. זה צריך להיות אפשרי גם להחלת פרוטוקול זה לכל שלב מחשוף לפני היווצרות דיסק נבט (שלבי 7-8 מאי). </li></ul> 4. תאים בודדים ablating: יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צלחת פטרי מרופדת Sylgard בשכבה רדודה של FASW. השתמש pi פסטר 15 סנטימטר ללא שינויpette להעביר עובר אחת לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בוטים, בעדינות מגלגל את העובר כדי לזהות את התא להיות ablated (2A דמויות ו2B). גרם מבשר שורת הנבט יכול להיות מזוהה כmicromere הקטן ביותר, היושב על גבי Mav macromere הקטן ביותר. בנוסף, גרם לא ישירות לפנות לתא צמוד, המהווה את micromere ישירות מולו, כמיליליטר micromeres מבשר המזודרם ונתח mr גבול תא באמצע של העובר. Mr הוא blastomere מימין גרם, ו מיליליטר הוא micromere משמאל גרם. Macromeres אחותו של מר, מיליליטר, וחדר הם מבשרי האאקטודרם אה, אל, ופרקים בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים בLEFיד לא אם החוקר הוא ימני (או ביד ימין אם החוקר הוא שמאלי), לכוון את העובר עם התא של עניין לימין (או לשמאל אם החוקר הוא שמאלי), ו בעדינות לתפוס את העובר בין המלקחיים כדי לייצב אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט משכה זכוכית (שלב 1.5 לעיל; איור 4), בעדינות לנקב את התא של עניין. אל תכניס את המחט עמוקה מדי, כדי שלא לדחוף את המחט לתוך תאי שכנים או מתחת לתא של עניין. המחט רק צריכה לנקב את סיסי וקרום תא בסיסי, ואין צורך להאריך עמוק לתוך התא להיות ablated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את המחט נהגה לנקב את העובר לסוף כוס פיפטה בפה עם קנס הוציאה קצה פיפטה פסטר (שלב 1.4 לעיל). החזק את קצה פיפטה כדי לסגור את החור נוצר בתא של עניין, ולהחיל שאיבה עדינה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוד ללחוץ בעדינות את העובר עם המלקחיים. כמו התוכן של blastoסתם נדחף אל מחוץ לסיסי דרך החור שנוצר בשלב 4.4, למצוץ אותו לתוך פיפטה הפה כדי לאפשר מבט פתוח של העובר. אם החור גדול מספיק, גרעין התא ניקב ניתן לראות לצוץ גם כן. זו בדיקה טובה כדי לוודא את תוכן התא כולו הוסר, ולא יכול להיות מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנא קראו בעיון את העובר כblastomere של עניין מוסר. הגבול של התא ניקב יהיה לסגת לעבר החור בסיסי, מה שהופך את צמתים של תאי הבסיס נראים לעין. המשך להפעיל לחץ עד שכל blastomere עניין הוסר. שימוש במלקחיים לגלגל את העובר מצד לצד וחזותי לאשר כי כל blastomere של עניין הוא נעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיפטה פסטר 15 סנטימטר ללא שינוי, להעביר את העובר כדי לנקות FASW + (מ&quot;ג FASW + 1 / מיליליטר Amphotericin B, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברים-ablated blastomere בבארות בודדותצלחת 48 היטב נקייה בFASW +, שינוי 50% מFASW-בתוספת האנטיביוטיקה + יומית. בידיים שלנו עוברים לשרוד ולהתפתח היטב, אבלציה אף שלאחר מכן, בטווח של טמפרטורות 18-28 º C. חוקרים צריכים להעלות העוברים שלהם בטמפרטורה אשר יש להם משטח נקי (אך לא בהכרח סטרילי) שעליו להעלות את העוברים עם הפרעה מינימאלית. כדי להיות מסוגל להשוות את העיתוי של אירועים התפתחותיים בעוברים-ablated blastomere עם פקדים, אנחנו מפנים את הקורא למידע היערכות התפתחותית מפורט שזמין עבור עוברים הועלו ב18 º 4 C, C º 25 4, ו26 º C 5,6. </li></ol>

<ol>
	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li><li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates.">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods:+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis.">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos.">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean,+Parhyale+hawaiensis.">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li><li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li><li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology.">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean.">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li><li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology.">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li><li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clash+of+traditions:+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G&#246;sta+J&#228;gersten+and+Sven+H&#246;rstadius.">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of G&#246;sta J&#228;gersten and Sven H&#246;rstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים פרוטוקול לאבלציה ידנית וההסרה פיזית מלאה של לסטומרים אחד מהשלבים המוקדמים של מחשוף פ amphipod hawaiensis. אנו מדגימים שימוש בפרוטוקול זה על ידי הסרת תאים גרם מבשר שורת החיידק הבודד מעובר בשלב שמונה תאים, ומראים כי אבלציה הייתה מוצלחת אם תאשר היע?...

Hawaiensis Parhyale סרטני amphipod התפתחה בעשור האחרון כאורגניזם מודל מבטיח עם פוטנציאל גדול לשימוש במחקר בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית 1. בין פרוקי הרגליים, רוב מערכות מודל הן חרקים, ולמדו נרחב ביותר של אלה הוא זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה. ד melanogaster הוא חבר Diptera כדי חרקים, וכמו תכונות עובריות רבות מציג באופן שנגזרות ביחס לאלו של חרקים basally הסתעפות 2. יתר על כן, חרקים מקוננים בתוך subphylum Pancrustacea 3, כלומר יש לי חרקים קרובי המשפחה הקרובות ביותר שלהם בתוך הקבוצה ארוכת השנים &quot;הטבעית&quot; בשם pancrustaceans, וכי קבוצה זו היא paraphyletic. הדבר מצביע על כך, בנוסף להסתעפות basally דגמי חרקים, מחקרים של סרטנים אחרים נדרשים כדי לקבל תצוגה רחבה יותר של ההיסטוריה האבולוציונית של התכונות התפתחותיותמנגנונים מולקולריים nd שנחקרו כל כך טוב בד melanogaster. עם זאת, מעט מאוד סרטנים כבר מבוססים היטב על ניתוח מעבדה ניסיוני של פיתוח. Amphipod פ hawaiensis היא מערכת מודל מעבדה צייתנית מאוד, נוחה למגוון של טכניקות ניסוי. Amphipods להציג תכונות ייחודיות רבות בתוך superorder ההורה שלהם Peracarida (מינן חוף, סקדים, ושרימפס היטב), ולכן חשב שניתן להפיק יחסית בתוך קבוצה זו של סרטנים. עם זאת, קלות היחסית של מניפולציה גנטית עוברית ופונקציונלית המוצע על ידי Parhyale להפוך amphipod זו תוספת רבת ערך למלאי הנוכחי של אורגניזמים מודל. כחיות מעבדה, פ hawaiensis מציע יתרונות רבים. בעלי חיים הם סובלניים למגוון רחב של טמפרטורות ומליחות, ולשרוד גם בתרבויות גדולות של מי ים מלאכותי 1. זה קל להבחין betwזכרים ונקבות een מבוססים על הבדלים מורפולוגיים ברורים, בעיקר, איברים הגדולים, מכור, תא מטען קדמי כי גברים להשתמש בו כדי לתפוס את הנקבות בעת ההזדווגות. לעבודה עוברית והתפתחותי, פ יש hawaiensis כמה תכונות מושכת מאוד. עובר נמשך כ 10 ימים והזמן לבגרות מינית הוא כשישה שבועות ב28 º C (אבל שים לב שParhyale שורד גם בטמפרטורות הנעות בין כ 20-30 º C, וכי מידע בימוי התפתחותית מפורט נגיש לעוברים הועלו ב18 º C 4 , 25 C º 4, ו26 º C 5,6). מבוגרים הזדווג בכל ימות במעבדה השנה, כך שהעוברים זמינים בכל עת של שנה. נקבות מטיל 2-20 (תלוי בגיל של נקבה) ביצים המופרות לתוך כיס דגירה הגחון ממוקם בין כמה הזוגות הראשונים של רגליים (איורים 1 א ו 1 ב &#39;), ואפשר לאסוף עובר אלהזה מוקדם מאוד בפיתוח בלי להרוג את הנקבה או פגיעה בעוברים (איור 1 ג). העוברים לשרוד במי ים מלאכותיים מסוננים דרך לבקיעה, יכולים להיות קבועים לביטוי גנים שלאחר מכן או ניתוח היסטולוגית 7, ושולחן היערכות מפורט מאפשר זיהוי מדויק של ההתקדמות בפיתוח 5. פרוטוקולים חזקים שימשו כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים על ידי הכלאה באתר 8-15 או immunostaining 4,16,17, מציאה פונקציונלית על ידי התערבות RNA 13,15 או 12 morpholinos, וקו נבט יציב Transgenesis 18. שימוש במערכת transgenesis, הביטוי מושרה 14 ומלכודת משפר גם 19 שיטות יכולות לשמש כדי לחקור את תפקוד גן בפ hawaiensis. בעוד רצף הגנום זמין לציבור אינו זמין כרגע, יש transcriptome מכיל תעתיקים נוצרים במהלך oogenesis ועובר דבורהn דה נובו התאסף ומבואר 20, והופקד במסד נתונים לחיפוש 21, הנחיית גילוי גן. לסיכום, פ hawaiensis הוא אורגניזם מודל צייתן מאוד מתאים לגישות ניסיוניות וגנטיות רבות להבנת התפתחות. בניגוד לשסעים לי עובריים המוקדמים של ד melanogaster, פ עוברי hawaiensis לדבוק holoblastically הבא (איור 2 א) הפריה. ניתוח התחקות שושלת הראה כי על ידי מחשוף שלישי, כל אחד מלסטומרים המחשוף השלישי נגזר במיוחד כדי להצמיח אחד משלוש השכבות נבט או הקו נבט 6 (איור 2). נתונים אלה, יחד עם נתוני microarray 22, שושלת תא מנתח 6,23, וניסויים בידוד blastomere 4 הראו כי פוטנציאל התפתחותי מופרד ללפחות חלק לסטומרים מחשוף שלישי בירושה סימטרית של celגורמי גורל ליטר. בהתאם לכך, בניסויי אבלציה blastomere שבמבשר שורת הנבט (שמכונה &quot;G&quot; במינוח שושלת תא Parhyale 6) הוסר בשלב התא שמונה, עוברים חסרי תאי נבט בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר 4, כפי שצוינו על ידי ההעדר של תאים המבטא את החלבון ושה, אשר מהווה סמן שורה נבט ברוב metazoans 24. לעומת זאת, ניסויי אבלציה blastomere גופניים הראו כי פ עוברי hawaiensis גם בעלי יכולות רגולציה משמעותיות, כך שגורלם של מבשר לסטומרים המזודרם או האאקטודרם מלוטש בשלב שמונה תאים שניתן לנקוט על ידי צאצאיהם של חלק מלסטומרים נותר 25. איך החלפת גורל תא ויסות יכולה להתרחש, ועל ידי לסטומרים סומטיים היקף אימוץ גורל תא אוטונומי, נותר עלום. טכניקות עובריות ניסיוניות כגון אבלציה blastomere יכולות להיות שימושיות במבדינג האוטונומיה היחסית וnonautonomy של החלטות גורל תא 26,27 ולכן עניין במחקר של פ עובר hawaiensis. בניסויים שהדגימו החלפה רגולטיביות של שושלות ectodermal וmesodermal, אבלציה blastomere בוצעה על ידי הזרקה 28 והעירור הבא של צובעת phototoxic 25. אמנם שיטה זו היא יעילה להרוג blastomere (ים) המוזרק, זה לא להסיר לחלוטין את גוף תאים המת מן העובר. בנוסף, הבדלים שנצפו בין נתונים שנאספו באמצעות שושלת תא לשלבי gastrulation של עובר על ידי הזרקת לסטומרים עם קליעים נותבים שושלת ניאון 28,29, ונתונים שנאספו על ידי ביצוע לסטומרים מוטרד באמצעות פיתוח של אותו שלבים עובריים 23. ההסרה גופנית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים. אנחנו שפורסמו בעבר התוצאות של שושלת תא ניתוחים של עוברים שבו תאים בודדים היו ablated 23 באופן ידני. יחד עם זאת, הפעולות העדינות נדרשו להסיר לסטומרים אחד מעוברים בשלב מחשוף מוקדמים טרם תוארו באופן מלא. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוסף של פ עוברי hawaiensis ואבלציה הידנית של blastomere בודד מעובר בשלב שמונה תאים. מטרתה של שיטה זו היא להשיג הסרה מלאה של גוף התא מהעובר, ומאפשר התבוננות בהתנהגויות הסלולר ויכולות גורל תא של התאים שנותרו בעובר והתפתחות פוסט עוברי. הפרוטוקול שלנו מראה הסרת g שורת נבט המבשר (איור 2 ג), אבל יכול להיות מיושם על כל תא בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף קודם לכן. באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם להסרת תאים בודדים מעוברי שלב מחשוף המוקדמים של other holoblastically ביקוע חסרי חוליות ימיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא סרטנים קטנים שנמצאו בבתי הגידול ימיים intertidal ברחבי העולם. במהלך העשור האחרון, Parhyale התפתחה כאורגניזם מודל מבטיח למחקרי מעבדה של פיתוח, מתן השוואת קבוצת חוץ שימושית לאורגניזם מודל arthropod למד היטב תסיסנית. בניגוד לשסעים לי עובריים של תסיסנית, השסעים המוקדמים של Parhyale הם holoblastic. מיפוי גורל באמצעות צבעים נותב מוזרקים לתוך לסטומרים מוקדם הראו כי כל שלוש השכבות הנבט והקו נבט נקבעו בשלב שמונה תאים. בשלב זה, שלושה לסטומרים נגזר על להצמיח האאקטודרם, שלוש נגזרו על להצמיח המזודרם, ושני לסטומרים הנותרים הם המבשרים של הקו האנדודרם ונבט בהתאמה. עם זאת, ניסויי אבלציה blastomere הראו כי עוברי Parhyale גם להחזיק capabiliti רגולציה משמעותיתes, כזה גורלות לסטומרים ablated בשלב שמונה התא ניתן השתלטו צאצאים כמה לסטומרים הנותר. אבלציה Blastomere כבר בעבר שתוארה על ידי אחת משתי שיטות: הזרקה וההפעלה הבאה של צבעי phototoxic או אבלציה הידנית. עם זאת, photoablation הורג לסטומרים אך אינו מסיר את התאים המת מהגוף את העובר. ההסרה פיזית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול להסרה ידנית של לסטומרים אחת מבמת שמונה התאים של עוברי Parhyale, הממחיש את המכשירים ונהלים ידניים הכרחיים להסרת תאי הגוף מלאה, תוך שמירה על לסטומרים שנותר בחיים ושלמים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תא Parhyale בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף המוקדם אחרים. בנוסף, באופן עקרוני בפרוטוקול זה יכול להיות ישים לקליאה המוקדמתעובר שלב vage של חסרי חוליות ימיות holoblastically ביקוע אחרות.

בעקבות אבלציה מוצלחת של מחשוף הסינגל השלישי פ micromeres hawaiensis כפי שתואר בפרוטוקול זה, micromeres שנותר לעבור בהדרגה את עמדותיהם במקצת, כדי לכבוש את השטח הכבוש בעבר על ידי blastomere ablated באופן חלקי. לדוגמא, כאשר גרם מוסר, השכנה mr לסטומרים ומ&quot;ל...

Watch this Scientific Journal Video about Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis at JoVE.com

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale.

אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.5K Views.  Harvard University.  Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale. 

Video: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection של ארגונית הקוטב Explants בעלי חיים מעוברים Xenopus laevis והרכבה של Assay הידבקות התא

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...