בתוך העוברים, תאים מתקשרים זה עם זה, מחליפים מידע כימי ומכאני. אחת ה דרך יעילה לבחן אינטראקציות אלה היא להרוג תאים מסוימים ולנטר את ההשלכות על תאים שכנים. השיטה שאנו מתארים מאפשרת לנו לנפח במדויק תאים, אפילו בתוך העובר, מבלי לפגוע ברקמות השכנות.
הכן את המיקרוסקופ הדו-פוטוני על ידי הגדרת הלייזר הראשון לאורך הגל אבלציה 820 ננומטר, ואת הלייזר השני אל אורך הגל הדמיה mCherry 1, 160 ננומטר. באמצעות מראות ניידות בנתיב האופטי, יישר את שתי קרני הלייזר בכניסה וביציאה של ראשי הסריקה, ולאחר מכן מדוד את העוצמה המרבית של הלייזר הראשון ב- 820 ננומטר. מקם את מד הכוח מתחת למטרה, סגור את התא השחור והגדר את כוח הלייזר הראשון ל- 100%התחל איסוף נתונים במד הכוח, פתח את תריס הלייזר ולאחר מכן מדוד את עוצמת הפלט וחשב את אחוז כוח הלייזר הדרוש כדי להגיע ל- 300 מילי וואט.
הגדר את הלייזר הראשון לאורך גל העירור GFP של 920 ננומטר וכוח ל- 7%התאם את כוח הלייזר השני ל- 15%הפעל את גלאי ה- PMT עבור קווים ירוקים ואדומים, והגדר רגישות PMT של קו ירוק ואדום ל- 65. התאם את שדה הראייה ל- 400 על 400 מיקרומטר, רזולוציית תמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ותדר סריקה ל- 800 הרץ. בחר מצב הדמיה של זמן 3D ולאחר מכן צור תיקיה והפעל שמירה אוטומטית לשמירת נתונים לאחר כל רכישה.
להרכיב את תא החימום ולהגדיר אותו 28 מעלות צלזיוס. המתן לפחות 10 דקות עד שהאולם והמטרה להתחמם. תחת סטריאמפיקוסקופ פלואורסצנטי, לזהות עוברים ב 70% epiboly להביע GFP.
באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק, מעבירים שלושה עד ארבעה עוברים נבחרים בצלחת מצופה אגרוז ומניחים אותם בקפידה במלקחיים עדינים. ב בקבוקון זכוכית קטן, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון של פניצילין-סטרפטומיצין בינוני המכיל 2%agarose, ומניחים את בקבוקון בתנור בלוק מחומם מראש, יבש ב 42 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה זכוכית מלוטשת אש, להעביר עובר dechorionated ל בקבוקון, דואג לא להוסיף מדי מדיום עובר לאגרוז.
יש להשליך את מדיום העובר הנותר מהפיפטה. שאפו את העובר בחזרה, יחד עם מספיק אגרוז כדי לכסות את החלקה של צלחת התחתונה זכוכית. לפוצץ את agarose עם העובר על שקופית הזכוכית של המנה, להבטיח את העובר אינו נוגע באוויר או בצד הפלסטיק של המנה.
לאחר מכן, מלאו את התא סביב מגלשת הזכוכית באגרוז. באמצעות ריס, כוון את העובר כך שהאזור המיועד יהיה בחלק העליון. לאחר חמש דקות, כאשר agarose מוגדר לחלוטין, להוסיף כמה טיפות של פנסילין-סטרפטומיצין מדיום למגלשת הזכוכית.
מניחים את צלחת התחתונה של הכוס מתחת למטרה בתא המחומם. לטבול את המטרה מדיום עובר פניצילין-סטרפטומיצין לפני סגירת התא. הזז את המחוון כדי להגדיר את נתיב האור למשקפת.
תדליק את מנורת הפלואורסצנטיות. מצא עובר והגדר את המוקד על פני השטח שלו. כבה את מנורת הפלואורסצנטיות והגדר את נתיב האור ל- PMTs לפני סגירת התא השחור.
התחל הדמיה חיה ולאתר את מסודרם צירי. כדי לקבל אות טוב, להתאים את כוחות הלייזר. השתמש בערוץ האדום כדי להזיז את הבמה לחלק העליון של העובר, והקצה מיקום זה כ- Z שווה לאפס.
בחר שלב זמן של דקה אחת ו- Z-step של שני מיקרומטרים. הגדר את הפרוסה הראשונה ב 15 מיקרומטר מעל mesoderm צירי, ואת הפרוסה האחרונה ב 15 מיקרומטר מתחת mesoderm צירי. הקלט 10 עד 15 דקות של סרט לפני אבלציה.
בהדמיה חיה, אתר את קווי המתאר של הפולסטר, ולאחר מכן, באמצעות אזור אפנון אלקטרו-אופטי של עניין, או כלי EOM-ROI, צייר מלבן גדול של 20 פיקסלים המשתרע על רוחב הפולסטר, והצב את המלבן באמצע הפולסטר. שים לב למיקום האקסיאלי של המישורים הגבוהים והנמוכים ביותר שיש לאבל, ומבטיח שה- ROI לא יחפוף את תא החלמון באף אחד מהמישורים. מקם את הבמה בעמדת Z הנמוכה ביותר כדי להיות אבלה.
הגדר את אורך הגל הראשון של הלייזר ל-820 ננומטר והזן את אחוזי הכוח כפי שחושבו קודם לכן כדי להשיג כוח יציאה של 300 מילי-וואט. הגדר את תדר ההדמיה ל-200 הרץ והדמיה לייזר ראשונה EOM לאפס. לאחר בחירת מצב טיפול החזר על ביצועים, כבה את ה- EOM והגדר את הטיפול כך שיפעל מיד לאחר אפס מסגרת.
עבור את מצב ההדמיה ל- Timelapse והפעל את פעולתה של שמירה אוטומטית. לאחר בחירת מצב מהיר בשלב זמן, התאם את מספר מסגרות הטיפול ומספר המסגרות לערך המתאים לעומק המיועד. תתחילו להדמיה.
הרכישה צריכה להיות שחורה, כמו התריס PMT נסגר במהלך טיפול EOM. לאחר מכן, עלו על הבמה לעמדת Z הבאה, ובצעו אבלציה דומה. חזור על כל תנוחת Z עד שהחלק העליון של הפולסטר יגיע.
כאשר תהליך אבלציה הושלם, הגדר את הלייזר הראשון ל 920 ננומטר ולהתאים את כוח ההדמיה שנבחר בעבר. שים את EOM הדמיית הלייזר הראשונה ל- 100 ובחר במצב שדה מלא. תדירות ההדמיה צריכה להיות 800 הרץ, ויש לכבות את EOM לפני בדיקת הערימה כולה במצב חי כדי לבדוק אם כל מטוס כבר ablated.
לאחר אישור אבלציה, בחר זמן תלת-ממדי למצב הדמיה. הפעל מחדש את שמירה אוטומטית והתחל להקליט את הסרט לאחר אבלציה למשך 40 עד 60 דקות. בסרט שלאחר אבלציה, בדוק אם התאים הממוקדים היו יעילים.
כמו אבלציות על פני פולסטרים לא צריך לפגוע בעוברים, המורפולוגיה הרגילה של העוברים אבלים ניתן לראות ב 24 שעות לאחר ההפריה. בתוצאה המוצלחת של אבלציות לייזר, רקמות כיסוי לא הושפעו על ידי אבלציה של מבנים בסיסיים. טיפול אינטנסיבי מדי, או טיפול מועט מדי, הביא לכשלים בבלציה בלייזר.
דוגמה לאבלציה לא מוצלחת מראה תאים מעל הפולסטר להיות אבלה, אשר ניכר על ידי פסולת autofluorescent במישור המוקד מעל הפולסטר. בניסיון לא יעיל אחר, התאים מולבנו אך לא הושחתו, ואותות פלואורסצנטיות נמוכה עדיין חושפים את קווי המתאר של התאים השלמים. לבסוף, תאים מסוימים אפילו לא מולבנו עקב טיפול לייזר מספיק.
היווצרות של בועות נובעת cavitation המושרה על ידי טיפול לייזר אינטנסיבי מדי. ערימות Z נלכדו כל דקה במשך 40 דקות בבלציה מוצלחת, ותיעדו הן את האותות הציטופלסמיים והן את אותות ה-mCherry הגרעיניים. בנוסף, גרעינים השייכים לחצי האחורי של הפולסטר מסומנים בנקודה מגנטה ומעקב לאורך זמן, לפני ואחרי אבלציה.
כמדד להתמדה בנדידה, נלמד מתאם אוטומטי של התאים לפני ואחרי אבלציה. תאים השייכים לחלקו העורפי של הפולסטר הציגו תנועה מתמשכת לפני אבלציה, אשר פוחתת באופן דרסטי לאחר אבלציה, מה שמצביע על אובדן של הגירה קולקטיבית מכוונת. יישור נכון של הלייזרים ומדידת כוח הלייזר הם קריטיים כדי לקבל תוצאות ניתנות לשחזור.
זה גם המפתח כדי לבדוק את יעילות אבלציה על התמונות הראשונות לאחר אבלציה. אנו משתמשים בבלציות לייזר כדי לפקפק בתפקידן של אינטראקציות בין תאים בהנחיית נדידת התאים בתוך העובר. אבל ההליך יכול להיות מותאם בקלות לשאלות רבות אחרות שבהן תאים או רקמות צריך להיות ablated בדיוק, פוטנציאל עמוק באורגניזם.
