סינפסות הן האלמנטים התפקודיים של נוירונים והפגמים או ההפסדים שלהם נמצאים בבסיס מספר הפרעות נוירודגנרטיביות ונוירולוגיות. מחקרי הדמיה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תפקודם ואת פלסטיותם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. בשל גודלם ומבנהם, מחקרי לוקליזציה של חלבונים דורשים טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליך ללמוד בנוירונים ראשוניים את ההתאמה של חלבוני יעד עם סמנים סינפטיים ברמת רזולוציית-על באמצעות מיקרוסקופיה מובנית של תאורה. SIM היא טכניקת תאורת אור בדוגמת המכפילה את הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה שדה רחב, ומגיעה לפרטים של כ -100 ננומטר. הפרוטוקול מציין את הפקדים וההגדרות הדרושים למחקרי לוקליזציה חיים וסקירה של השיטות הסטטיסטיות לניתוח נכון של נתוני ההדמיה.
המפתח לאפשר את הניתוח ברמה של רזולוציית-על הוא, עם זאת, הריג'ינים המשמשים במהלך הרכישה, כגון כיסויים קאמריים ופתרונות הרכבה התואמים למדד העקמים של המטרה. כדי להשיג נוירון ראשי בהיפוקמפוס העכבר, לבודד היפוקמפוס מ P1 כדי P4 גורים. תאי לוח ב 70, 000 תאים לגם בנפח של 200 microliters לגם.
המתן עד נוירונים ראשוניים ההיפוקמפוס התבגרו באופן מלא 12 עד 14 ימים לאחר ציפוי לבצע מחקרים לוקליזציה שיתוף. הוסף 4% paraformaldehyde, PFA, ב PBS 200 microliters לכל באר לנוירונים כדי לתקן אותם במהירות. הסר את הפתרון והדגירה את הדגימות עם אלבומין סרום 1%bovine, BSA, ב PBS ב 200 microliters ל הבאר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לכסות באופן פסיבי את כל משטחי כריכה חופשית של הצלחת עם חלבון לא רלוונטי לניתוח.
מאגר חסימה מבוסס BSA ללא Triton X-100 מפחית את רקע הנוגדנים בצורה יעילה יותר מאותו מאגר עם 0.2%Triton X-100. מוסיפים את הנוגדן העיקרי. כשליטה שלילית, אין להוסיף נוגדן ראשוני לאחת הבארות.
הרכב תאים באמצעות Mountant תואם SIM, למשל. ארוך זכוכית Antifade Mountant. לכסות ולהגן על התאים עם coverglass, למשל, coverglass עגול עם קוטר של שמונה מילימטרים.
ניתן להשתמש גם בריבועים. אחסן את הכיסויים התאיים בטמפרטורת החדר והמתן לפחות 48 שעות לפני רכישת התמונות. זכוכית יהלום דורשת לפחות יומיים של ריפוי לפני רכישות ברזולוציית-על.
השתמש בשתי אסטרטגיות כדי להבטיח ספציפיות נוגדנים. הראשון הוא שימוש בלפחות שני נוגדנים שונים המכוונים לאותו מצע. האסטרטגיה השנייה היא נטרול נוגדנים על ידי דגירה עם יעד החלבון המטוהר, או משמש להעלאת הנוגדן.
אנו משתמשים באופן שגרתי במיקרוסקופ רזולוציית-על N-SIM המיוצר על-ידי ניקון לצורך הניתוח שלנו. ההוראות הבאות מיועדות לרכישת תמונות SIM ללא תלות במיקרוסקופ השימוש. חשוב גם למקסם את הביצועים של המיקרוסקופ כדי לבצע כיול מדויק של המכשירים, כולל טבעת תיקון, יישור לייזר, והתמקדות בלוק סורג.
לפני רכישת תמונות SIM, המערכת דורשת כיול נכון עם חרוזים פלואורסצנטיים ספציפיים בגודל תת-רזולוציה. דוגמה לכך היא מיקרוספרות טטרה-ספק. חרוזים אלה מוכתמים בצבעים פלואורסצנטיים שונים כדי לאפשר כיול של לייזרים שונים עם דגימה אחת.
באמבט מים, sonicate סביב 1.8 פעמים 10 כדי מיקרוספרות פלואורסצנטי 8 במשך 10 דקות. מדללים את המיקרוספרות הפלואורסצנטיות אחד ל-500 במים מזוקקים כפולים. Sonicate בפעם השנייה במשך 10 דקות נוספות.
פיפטה 15 מיקרוליטרים של חרוזים מדוללים לתוך באר של כיסוי קאמרי. תן לפתרון להתייבש במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון ההרכבה, למשל.
להאריך זכוכית, ולה מניחים כיסוי שמונה מילימטר על גבי. המתן לפחות 48 שעות כדי לאפשר ריפוי נאות. תפעיל את המיקרוסקופ והלייזרים.
תן למערכת להתחמם כדי להגיע לשיווי משקל תרמי של כל רכיבי המיקרוסקופ ומערכת המיקרוסקופ ברזולוציית-העל SIM דורשת לפחות שלוש שעות. בחר את המטרה 100X. התחל את הכיול על-ידי יישור הלייזרים למרכז בלוק החיתוך של ההיחסנות.
במערכת N-SIM, ידית מיקרומטר ומצלמה ייעודית מאפשרות מרוכך של קרני האור למטרה. הכנס את המכסה התאי של המיקרוסקופ לצפייה. הגדר את המערכת לעובי הכיסוי התאי על-ידי התאמת כיסוי התיקון האובייקטיבי.
ל-NIS Software, התוכנה הקניינית המסופקת עם מערכות מיקרוסקופ סופר-רזולוציה של N-SIM, יש פונקציה אוטומטית להסדרת תיקון צבעים. התאימו את מוקד החסימה עבור כל ערוץ כדי להבטיח תאורת דוגמאות מילוי מובנית ממוקדת בדגימה. התוכנה מספקת פונקציה אוטומטית עבור משימה זו.
רכשו תמונות SIM תלת-מימדיות גולמיות של המיקרוספרות הרב-צבעיות. חישבו עבור כל אורך גל נפרד את המרת פורייה של התמונה הסופר-פתורה. אם התמונה שהשתנתה אינה מצליחה להשיג תבנית דמוית פרח נכונה, הפעל מחדש את הכיול מאחר שלא הושגה רזולוציית-על.
בתמונה הסופר-פתורה, בחרו מיקרוספרה אחת וחשבו את פרופיל העוצמה שלה לכל ערוץ כדי למדוד את הרזולוציה שהושגה. עכשיו זה צריך להיות קרוב ל -100 ננומטרים באופן מאוחר יותר. בצע רישום ערוצים על-ידי כיסוי רכישה רב-ערוצית של המיקרוספרות.
המטרה היא לאסוף את כל אותות הערוץ באופן אוברישי ואקסיאלי. פעולה זו תבטל סטייות כרומטיות עקב חוסר התאמה של הערוצים השונים ותסייע בניתוח לוקליזציה שותף. אשר את איכות הכיול באמצעות שלב התאורה פונקציות ואת המוקד בדוגמת תאורה של SIMcheck, חבילה של תוספים עבור יישום קוד פתוח ImageJ.
התחל לנתח את הדגימה באמצעות מטרה 40X במצב קונפוק או שדה רחב. זה מאפשר ניווט של המדגם, שמירה על פרטים טובים שדה גדול של תצוגה. השתמש אות נוגדן MAP2 כדי לזהות אזור המייצג תהליכים עצביים.
רכוש תמונות של הדגימה במצב קונפוקל כדי לקבוע את איכות הכתם. עבור למטרה 100X. החל שמן על המטרה 100X.
רכוש תמונה רחבה או תמונת קונפוקל שתשמש מאוחר יותר להערכת איכות התמונה הסופר-פתורה. עברו למצב SIM תלת-מימדי. באמצעות חלונות דו-שיח כדי להגדיר את הפרמטרים לרכישה, בחר את הגדרת עומק הסיביות הגבוהה ביותר הזמינה כדי להגדיל את מידע הצבע.
בדרך כלל, 16 סיביות היא הבחירה הסטנדרטית. יתר על כן, כדי לשפר את יחס האות לרעש, בחר ערך בתדר נמוך לרכישה, כגון מגה-הרץ אחד. באמצעות חלונות היסטוגרמה, הגדר כוח לייזר כדי לקבל תגובה ליניארית של אות כדי למנוע אובדן מידע, להגביל פיקסלים רוויים בתמונות.
מערכת N-SIM משתמשת במצלמת iXon3 של אנדור. בעת עבודה ב- 16 סיביות, בחר עוצמת יעד של 16,000 כדי להבטיח את התגובה ליניארית של המצלמה. לחלופין, בחר טווח שבין 30,000 ל- 45,000 כדי למקסם את הטווח הדינמי של הרכישות.
הגדר את כוח הלייזר בין 0.1% ל- 50% בעת הדמיית הדגימות ושזמניות החשיפה בין 50 אלפיות השניה לשתי שניות. כוחות לייזר מעל 50% עלולים לגרום לצילום מהיר של הפלואורופורים בשימוש. התחל לרכוש את התמונות במצב SIM תלת-מימדי.
השתמש SIMcheck, חבילה של תוספים חינם עבור ImageJ, כדי להעריך את איכות הרכישות של התמונות הגולמיות. אם SIMcheck אינו מזהה חפצים או בעיות איכות, רכוש מינימום של 10 תמונות משכפולים טכניים מלאים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי. תמונות שנרכשו הן נתונים גולמיים שיש לעבד כדי להשיג תמונות SIM משוחזרות שישמשו לניתוח נוסף.
בפרוטוקול, אנו ממליצים להשתמש סינפטופיצין ו PSD-95 כמו סמנים סינפטיים לפני ופוסט. עם זאת, ניתן להשתמש סמנים נוספים. גוף עצום של ספרות תומך בשימוש בחלבונים אחרים, כגון דרברין ובסון כמו סמנים סינפטיים.
תמונות שנרכשו על-ידי SIM תלת-מימד הן תמונות גולמיות שיש לעבד כדי להשיג תמונות ששוחזרו באופן סופר-פתור. שחזור שגוי של תמונות גולמיות יכול להוביל לחפצים שישפיעו על ניתוח הדגימות. לכן יש להקדיש תשומת לב רבה לבחירת פרמטרי שחזור כראוי.
עבד את התמונות הגולמיות באמצעות תוכנת ניתוח שחזור מיקרוסקופ כדי להשיג תמונה סופר פתורה. לחלופין, השתמשו ב-ImageJ Plugin FairSIM זמין בחופשיות כדי לשחזר את התמונות הגולמיות. לחשב את המרה פורייה של תמונות סופר פתורות באמצעות תוכנת שחזור מיקרוסקופ או ImageJ תוסף SIMcheck.
תמונה משוחזרת טובה אמורה להחזיר, עבור כל ערוץ, תמונה דמוית פרח. אם התמונות ששוחזרו אינן מצליחות ליצור צורה דמוית פרח, הפעל מחדש מהתמונות הגולמיות ושחזר אותן מחדש על-ידי שינוי פרמטרי שחזור, כגון סינון ליניארי, apodization והסתרת סדר אפס. בתוכנת NIS באמצעות התצוגה המקדימה כדי לנטר כיצד שינוי הפרמטרים משפיע על התמונה הסופית שנפתרה, לשנות את ניגודיות אפנון התאורה של הפרמטר, דיכוי רעש ברזולוציה גבוהה, ומחוץ לדיכוי המיקוד.
נתח את התמונה המשוחזרת כדי לזהות חפצים באופן בלתי משוחד באמצעות NanoJ-SQUIRREL, תוסף מבוסס ImageJ, כדי להעריך את האיכות של תמונות סופר פתורות. בניתוח שלנו של לוקליזציה שותף, השתמשנו בשתי גישות. הראשון הוא גישה חזותית המבוססת על ניתוח הפרופיל המציג אירועים בודדים של לוקליזציה במשותף ומזהה את תרומתו של כל ערוץ.
כצעד ראשון לחקר לוקליזציה בין סמנים סינפטיים לחלבון מעניין, יש לייקט תמונה סופר-פתורה ולנתח לוקוס יחיד כדי לקבוע חפיפה לאות. זהה לוקוס יחיד בתמונה הסופר-פתורה. השג את פרופילי האינטנסיביות של אותות הפלואורסצנט לפוקוס העניין.
אם ניתוח פרופיל הציע לוקוס יחיד לוקליזציה, ניתוח כללי יותר של התמונה כולה יכול להתבצע על ידי חישוב מקדמי פירסון ומנדר. השתמש JACoP, תוסף ImageJ, כדי לקבוע שני פרמטרים של לוקליזציה משותף, פירסון של מנדר. לאחר כיילנו את המערכת והערכנו את איכות התמונות המשוחזרות, התחלנו לאחר מכן לנתח את התרבויות העצביות העיקריות המוכתמות בנוגדן נגד MAP2, סמן עצבי, PSD-95, סמן פוסט-סינפטי וחלבון היעד שלנו SUMO1.
ניתחנו לראשונה את הדגימה המבצעת מיקרוסקופיה קונפוקל בת ארבעה ערוצים עם מטרה של פי 40. עם בחירת אזור המייצג תהליכים עצביים, עברנו למטרה של פי 100. רכשנו גם תמונות קונפוקל וגם תמונות SIM של אותו אזור כדי להעריך את איכות השחזור עם NanoJ-SQUIRREL ולבצע ניתוח לוקליזציה משותף.
ביהור המבנה וההרכב של הסינפסה חיוני להבנת תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים המווסתים את הזיכרון ואת ההכרה. בעוד סינפסות מצב נורמלי הם אבני הבניין של זיכרון, הם גם על בסיס של הפרעות נוירולוגיות מורכבות, כגון אחת הצורות הנפוצות ביותר של מחלת אלצהיימר דמנציה. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחקור את הרכב החלבון של הסינפסות בטכניקת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר הנקראת מיקרוסקופ תאורה מובנית.
