פרוטוקול זה יכול ללכוד קינטיקה בזמן אמת ברמת תא יחיד. אנו יכולים למדוד פרמטרים בודדים של התאים בתגובה לזיהום ב- HIV ולשייך אירועי איתות מוקדמים עם צעדים מאוחרים של מחזור החיים הנגיפי. זוהי חלופה מדרגית משולבת לשיטות הדמיה מסורתיות באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית חדשנית למיון תאים בודדים, פולחן, הדמיה ואוטומציה של תוכנה.
זוהי השיטה הראשונה הוקמה עבור ננופלואידית, תפוקה גבוהה, תרבית תא יחיד אורך והדמיה. טכניקה זו יכולה להיות מאומצת באופן נרחב כדי ללמוד קינטיקה איתות הסלולר אינטראקציות מולקולריות דינמיות במגוון מצבי מחלה. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה כדי להעביר את האופן שבו הניסוי מוגדר, כיצד התאים ממוינים אופטית לתוך עטים, וכיצד להגדיר חליטות דרך השבב.
כדי להתחיל, להכין פתרון טעינה טרי Fluo-4 AM על ידי הוספת 25 microliters של ממס דטרגנט מרוכז 100X ו 2.5 microliters של 1, 000X Fluo-4 AM לצינור 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן מערבולת לערבב. פיפטה 2.5 מיליליטר של מדיה תרבותית לפתרון הטעינה וההפך לערבב. צנטריפוגה שני מיליון MT-4 תאים ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את המדיה ולהשתעלות מחדש את גלולה בשני מיליליטר של פתרון הטעינה המוכן Fluo-4 AM.
פיפט השעתה מחדש תאים לצלחת פטרי 35 מ"מ. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות, ולאחר מכן דגירה במשך 15 עד 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. להעביר את ההשעיה התא צינור צנטריפוגה צנטריפוגה צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
Resuspend גלולת התא על ידי pipetting במיליליטר אחד של מדיום התרבות צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך שלוש דקות לשטוף. Resuspend גלולת התא על ידי pipetting במדיום התרבות בריכוז של שני מיליון תאים למיליליטר עבור לפחות 50 microliters. כדי להכין שבב עם פתרון הרטבה, אשר מקל על כתיבת תאים, לטעון צינורות צנטריפוגה המכילים שני מיליליטר של פתרון הרטבה ו 50 מיליליטר של מים deionized על המכשיר עם שבב optofluidic חדש ולהפעיל את פונקציית שבב רטוב אשר להציף את השבב עם פתרון הרטבה.
דגירה השבב ב 50 מעלות צלזיוס ולשטוף את השבב עם מים שלוש פעמים. לאחר שטיפת מים נעשה, לשטוף את השבב עם שלושה מחזורים של 250 microliters של מדיה תרבות. להשלים את השעיית התא מהשלב הקודם עם אחד לכל 100 חלקים F127 חומר ניקוי מסיס לפני הטעינה כדי להפחית את הסבירות של תאים נדבקים לערוצי השבב.
השתמש במחט ייצוא המכשיר כדי לייבא תאים מצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר עם פעולת העומס וייבוא נפח קטן עבור נפח חבילת תאים חמישה microliter. תאי עט המשתמשים במיקום אופטו-אלקטרוני ממוטב או במתח OEP של 4.3 וולט וחמישה מיקרומטרים לשניה במהירות כלוב באמצעות פונקציית העט האוטומטי, שתזהה תאים בודדים באופן אוטומטי, תקיף אותם בכלוב OEP ותעביר אותם לעט סמוך. אם תאים מעניינים נשארים לאחר ההטבעה האוטומטית, השתמש בפונקציית העט הידנית כדי לבחור תאי יעד ועט יעד.
לאחר השלמת ה penning, לשטוף את השבב עם שלושה מחזורים של 250 microliters של מדיה תרבות כדי לנקות את כל התאים שנותרו unpenned מהשבב. לאחר כתיבת תאים, השג תמונות פלואורסצנטיות של תאים בערוצי FITC, טקסס רד ו- DAPI כדי למדוד את פלואו-4 הבסיסי, mCherry ושפע אוטומטי. להחדיר HIV-1 לתוך השבב בריכוז של 13 ננוגרם של HIV-1 NLCI לכל שני מיליון תאים על ידי צינור איטי את ההשעיה לתוך השבב באמצעות מחט הייצוא.
מיד לאחר תוספת HIV-1, שוב ושוב להשיג תמונות בערוצי FITC ו DAPI על פני קורס זמן של 10 דקות. השג תמונות בערוצי טקסס רד ו-DAPI באחד, שניים, שלושה וארבעה ימים לאחר ההדבקה. מתודולוגיה זו שימשה לזיהוי וקיבוץ של תאים נגועים ב- HIV ולא נגועים באמצעות מדידת mCherry.
תאים עם שינוי באות mCherry גדול או נמוך מ 40, 000 ממוצע עוצמת פלואורסצנט היו מקובצים לתוך mCherry גבוהה או mCherry אוכלוסייה נמוכה בהתאמה. אשכולות אלה נותחו עבור קינטיקה זרם סידן על ידי מדידת סידן תאיים באמצעות פלואורסצנטיות Fluo-4 שוב ושוב על פני קורס זמן של תשע דקות, אשר הוכיח זרם סידן מוקדם בתאים נגועים ב- HIV. מתאם חיובי משמעותי בין זרם סידן לבין פלורסנט mCherry נצפתה.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתחיל עם התאים בטווח הצמיחה המעריכי הן עבור ייצור וירוסים והן זיהום כי תאים מגודלים יגרום לירידה דרמטית באות ממסיפת תינוק זו. עבודה עם HIV-1 יכולה להיות מסוכנת. לכן, BSL-2 שיטות כפי שצוין בתקן פתוגן המועבר בדם OSHA תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
טכניקה זו היא מרגשת כי זה יאפשר לנו ללמוד שינויים פנוטיפיים חד תאיים או שעתוק בתנאים מבוקרים. יש לזה פוטנציאל רחב לתאם את ההשפעה של גירויים על מסלולים מולקולריים בסוגי תאים רבים.
