אנו מכירים ד&quot;ר הרולד דבוז&#39;ק לדיונים מועילים כולל ההצעה לנסות קיבעון ב37 מעלות צלזיוס PFA. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH CA92644 P01 ועל ידי חוזה מהקרן הלאומית לחקר הסרטן.

1. תא תרבות בדיסק זכוכית מצופה קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקי זכוכית מקום (12 מ&quot;מ קוטר) בתוך צנצנת זכוכית (4 גר &#39;) וחיטוי לעקר את הדיסקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 25 מיליליטר 70% אתנול בצינור פלקון 50 מיליליטר ולמקם אותו במכסת מנוע בתרבית תאים. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים עד לרמה של הפתרון יורדת ל 20 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מלקחיים חדים עם נקודת קנס נוספת באתנול 70% למשך 5 דקות לפני השימוש בו לטיפול בזכוכית קשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המלקחיים מהצינור ולסגור את המכסה, ולאחר מכן מניח בעדינות את המלקחיים אתנול טופל בחלק העליון של הצינור לייבוש באוויר למשך 2 דקות. אל תאפשר לקצה המלקחיים לגעת בשום דבר במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים סטריליות כדי לתפוס את דיסק זכוכית סטרילית אחד מתוך צנצנת הזכוכית ולמקם אותו בטוב של צלחת תרבית תאי 24 גם. חזור על פעולה עד המספר הרצוי של בארות כבר מאוכלס עם דיסקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 500 μl של פתרון קולגן שור (50 ng / ml) לתוך באר כל אחד שמכילה כוס דיסק ולמקם אותו במעלות צלזיוס 37, 5% תרבות חממת CO 2 תא לפחות 30 דקות. אין כל רע בדגירה ארוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר HUVEC (אדם תאי טבור הווריד האנדותל) או PC3 (תאים סרטניים בערמונית) שכבר גדלו בצלחת תרבית תאי 150 מ&quot;מ דרך trypsinization ולחסום את פעילות טריפסין באמצעות מדיום התרבות השלם שלה. איסוף תאים לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התא ולוודא את הכדאיות גדולה יותר מ90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום התרבות לדלל את התאים ל10 5 תאים / מיליליטר. מקום תאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הקולגן במכסת המנוע בתרבית תאים ומניחים בעדינות 500 μl של השעיה תא היטב כל אחד שבדיסקי זכוכית precoated עם קולגן. 5 x 10 4 תאים / היטב בצלחת 24 גם ייתן 60% confluency לHUVEC וconfluency 30% לתאי PC3. הערה: להוסיף עוד השעיה תא לצפיפות תאים גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, או 24 שעות כדי לעקוב אחר פעילות nanopodia והמעבר תא. בדרך כלל, תאים יצרפו לזכוכית הדיסק ב30 דקות הראשונות, ולאחר מכן להתחיל לקטב ולהעביר בשעה הראשונה, ולבצע אינטראקציות בין תאית וחלוקת תא בשעות שלאחר מכן. </li></ol> 2. קיבוע תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל אחד גם צריכים 500 μl PFA 4% (paraformaldehyde) כדי לתקן את התאים. כך או מיוצר באופן מסחרי או טרי 4% יכול לשמש PFA. לחשב את כמות PFA דרושה המבוסס על מספר הבארות שהוכנו, ולמקם את PFA בצינור בז 15 מ&quot;ל. זהירות: paraformaldehyde הוא קרצינוגן חשד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור בז בעמדת קלקר שכבר הייתה במקום בחממה 37 מעלות צלזיוס. השאר את הצינור בחממה במשך 30 דקות למלחמהמ &#39;עד PFA 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כרית חימום במכסת המנוע בתרבית ולהפעיל אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת תרבית תאי 24 גם וPFA מתוך האינקובטור prewarmed ולמקם אותו על גבי כרית החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביד אחת כדי לשאוב את המדיום מן באר, ומייד לאחר השימוש מצד השני להחליק 500 PFA μl עדינות לתוך הבאר דרך הקצה היטב. לשאיפה קלה, להטות את צלחת התרבות ב45 על °, משעין אותו על דוכן הקלקר כך שהוא יציב בזווית זו. זה יקל על השאיפה והוספת פתרון PFA לגם מבלי להפריע לתאים בתרבית. זהו הצעד החשוב ביותר לשימור המבנה התאי המקורי של פעילות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עד שכל הבארות עם כוס דיסק קיבלו PFA. הערה: כל הצעדים שצריך לשנות את הפתרון קיים מהבאר יחולו הליכי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת בחזרה למכסת מנוע התרבות ולהטות נגד קלקר כמתואר בשלב 2.5. השתמש ביד אחת כדי להעביר את PFA עדינות מהבאר אל צינור איסוף; להשתמש לעומת זאת למקום מייד אחר כך לפחות 500 טמפרטורת חדר PBS μl בבאר. אחרי הכל הבארות נשטפו, לחזור ולחזור על שטיפת PBS פעם נוספת בכל באר. רוקן את PFA נאסף לתוך מיכל פסולת מסוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר חסימת ICC על ידי הוספת 2% שור סרום עוברי לPBS. 0.04% אזיד הנתרן (לדלל מ20% פתרון מניות) הוא הוסיף כחומר משמר. זהירות: אזיד הנתרן הוא תרכובת רעילה. החיץ ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת זמן ארוכה ללא זיהום חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צלחת התרבות עדיין מוטה נגד עמדה, שוב לעבור על כל פריט גם aspirating להסיר PBS ומייד אחר כך הוסיף 500 μl של חיץ ICC חסימה. תאים מוכנים למכתים immunofluorescence עכשיו. במידת צורך,ניתן לאחסן את תאים קבועים במקרר 4 ° C במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של חלבון TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 Immunofluorescence הכתמה של Nanopodia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל טוב, להחליף את חיץ חסימת 500 ICC μl עם מאגר חסימה חדש המכיל 0.01% טריטון X-100 ולתת לו לשבת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. אין להשתמש גבוה יותר מאשר 0.03% טריטון X-100 כפי שהוא יסיר TM4SF1 מקרום תא. PBS שטף תאים מהצעד 2.10 ניתן להעביר ישירות למאגר החסימה המכיל טריטון אם הצביעה היא מוכנה להתחיל מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן ראשוני נגד TM4SF1 (או אנטי CD9) ל0.5 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר ICC חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל טוב, הסר את ICC/0.01% חיץ טריטון ולהחליף אותו עם 300 μl של הפתרון אנטי TM4SF1 הנוגדנים. דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר או להשאיר לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל אחד עם לא פחות מ 500 μl PBS. חזור 3x; בכל פעם שנותנת בleAST 5 דקות זמן דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן וphalloidin המשני בבית הדין הפלילי הבינלאומי חיץ חסימה, באמצעות דילול 1,000 זמנים של אלקסה 488 נוגדן שכותרתו חמור אנטי עכבר המשני (2 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי) ו -1,000 דילול x של phalloidin (50 ng / מיליליטר בריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 300 μl של נוגדנים משני ופתרון phalloidin לכל היטב דגירה עבור שעה 2 או להשאיר אותו לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי כביסה PBS עם לפחות דגירה 5 דקות לכל לשטוף. בכביסה האחרונה, תעזוב את כל הטוב בPBS במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפת טיפה אחת (~ 10 μl) של תקשורת אנטי לדעוך הרכבה בשקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנד קצה 19 G ½ 1 במחט מזרק 90 ° על ידי לחיצה בעדינות על משטח קשה. השתמש ביד אחת להחזיק את המחט והתחננה ובעדינות להרים את כוס דיסק מהבאר, ולהשתמש ביד השנייה כדי לתפוס את הדיסק באמצעות המלקחיים החדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל זכוכית הדיסק &amp;# 160; עם פנים כלפי מטה ומאפשרות מגע בצד תא תקשורת ההרכבה בשקופית הזכוכית. מניח בעדינות את כוס הדיסק ולתת לו להתייבש במשך הלילה במקום חשוך בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לתמונת nanopodia immunofluorescence המוכתם, או לאחסן את השקופיות בקופסא שקופיות ב -20 ° C. השקופיות יישארו לצפייה במשך כמה חודשים ב-20 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis.">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li><li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4SF1:+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration.">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li><li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L6,+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas.">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li><li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+and+stem+cell+research.">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li><li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains.">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li><li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF/VEGF:+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis.">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li><li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li><li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability.">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li><li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA,+cell+surface+proteins,+and+intracellular+proteins.">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li><li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes.">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li><li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+(SECM).">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li><li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13+(aminopeptidase+N)+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells.">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Nanopodia ערוצי הממברנה תאית דקים שבתקיפות לצרף מטריקס דרך TMED ויכול להאריך יותר מ -100 מיקרומטר מתא סלולרי מקוטב לחוש את הסביבה ולתווך אינטראקציות בין תאית 2,3. Nanopodia לדבוק מטריצה ​​כך בתוקף כי שאריות הם השאירו מאחוריהם כמהלכי תא משם (איורים 1 ו -2). Nano...

במהלך קיטוב לתנועה, תאים של בעלי החיים להאריך מגוון של בליטות דינמיות, קרום מהשטח שלהם, ובכלל זה filopodia, lamellipodia, סיבי הכחשה, וסלסולי 1. לאחרונה התווסף לרשימה זו היתה nanopodia, סוג מוכר חדש של דק (100-300 מיקרומטר קוטר), הקרנה מוארכת (באורך של עד 50-100 מיקרומטר) קרום המספקים ערוצי קרום להארכה של מבני F-אקטין כגון filopodia וסיבים הכחשה, וכתם שחיובי עם TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) בתאי אנדותל וגידול בתרבית 2,3. TM4SF1 הוא חלבון עם טופולוגיה כמו tetraspanin-שהיה ידוע במקור אנטיגן תאים סרטניים 4 לפני הגילוי כי המולקולה היא סמן ביולוגי של תאי האנדותל שממלא תפקיד חיוני בהתפשטות תאי אנדותל והגירה 2,3. מכתים immunofluorescence גילה כי TM4SF1 הוא מקומי לperinucשלפוחית ​​ליר וקרום הפלזמה, והוא מועשר בomains TM 4SF1 דואר nriched מייקר ד (TMED). nanopodia TMED עוגן למטריקס ובהווה בדפוס פסים של מרווח קבוע של 1-3 אורך TMED / מיקרומטר של nanopodia. Nanopodia להאריך בדרך כלל מהחזית המובילה של תא ונגרר מאחור בתא קיטוב לתנועה. בשל אופי חסיד משרד עורכי TMED, nanopodia לא מצליח לחזור חזרה לתא כפי שהוא נע משם; שאריות nanopodia נטושות וכך לאתר את הנתיב של תנועה סלולרית. Nanopodia לספק ערוצי קרום להארכה והכחשה F-אקטין, ואתרים של אינטראקציות ותקשורת בין תאית 2,3. מאפיינים אלה אומר כי nanopodia מספקים הזדמנות ייחודית ללמוד את מנגנוני הרכבה F-אקטין במהלך קיטוב סלולארי, חישה סלולרית של הסביבה, קביעת הנתיב וכיוון התנועה של תא, ואינטראקציות בין תאיתnd תקשורת. בשל האופי הידרופובי מאוד של TMED והטבע הקרומי הדק ושברירי של nanopodia, טיפול מיוחד צריך להילקח על מנת לשמר TMED וnanopodia. הרס nanopodia והסרת TMED ידי שיטות מעבדה משותפות הוא סיבה אפשרית לכך שרק שישימה ושלושה פרסומים שהופיעו בTM4SF1 מאז הגילוי הראשון שלה בשינה 1986 1 ולחוסר ידע של העשרת TM4SF1 ב100-300 מיקרומטר microdomains על מלא פני התא ועד לדו&quot;ח של TM4SF1 בתאי האנדותל ב2009 2. שיטות immunostaining קונבנציונליות נפוצות שימוש בממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון כדי לתקן תאים ולהשתמש 0.1% או ריכוז טריטון X-100 גבוה יותר לpermeabilize תאים 5. מחקרים שתוארו כאן מיושמים שלושה שינויים משמעותיים בשיטה המקובלת לחשוף TMED וnanopodia: (i) להשתמש 37 מעלות צלזיוס PFA 4% ולתקן תאים ב3776; C חממה, (ii) חלה כביסה PBS טמפרטורת חדר עדינה, וכן (iii) להשתמש בפחות מ 0.03% טריטון X-100 רק לזמן קצר לpermeabilize תאים לפני תוספת של נוגדן ראשוני, כפי שטריטון X-100 גבוה יותר מאשר 0.03% יהיה לחלץ TM4SF1. כל tetraspanins יוצר microdomains על קרום התא 6 וחלק colocalize עם TMED בתאי האנדותל וגידול 2,3. כtetraspanins כמו CD9, CD81, ובאים לידי ביטוי בכל מקום בCD151, הפרוטוקול מכתים המתוארים כאן יכול להיות מורחב לסוגי תאים רבים ושונים, כי חוסר TM4SF1 למחקרים של תפקוד nanopodia.

<table><tbody><tr><td>Glass disks</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Glass jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube with Styrofoam rack</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>Sharp forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps</td></tr><tr><td>24-well Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24-well Cell Culture Plate</td></tr><tr><td>150 mm Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm cell culture plate</td></tr><tr><td>19 G 1 &amp;frac12; Syringe needle</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &amp;frac12;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon&#039;s Pure Ethanol 200 Proof</td></tr><tr><td>Collagen solution</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0.25% Trypsin-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Solution, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyde)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement &amp;amp; Growth Factors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td></tr><tr><td>Mouse anti-human TM4SF1 antibody&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB3127</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD9 antibody&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td></tr><tr><td>Anti-fade mounting media&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td></tr><tr><td>70% Ethanol&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>17.5 ml of ethanol (200 proof)&lt;br/&gt; 7.5 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>10x PBS (make 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml of 10x PBS&lt;br/&gt; 180 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (make 20 ml)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100&lt;br/&gt; 16 ml double-deionized water</td></tr><tr><td>4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (make 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g of NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; 25 ml of double-deionized water</td></tr><tr><td>50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Stock solution of 50 &amp;mu;g/ml (50 ml)&lt;br/&gt; 830 &amp;mu;l of Collagen I (3 mg)&lt;br/&gt; 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS&lt;br/&gt; 2% FBS (add 1 ml)&lt;br/&gt; 0.04% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (add 100 &amp;mu;l of 4% NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml of ICC Blocking Buffer&lt;br/&gt; 25 &amp;mu;l of 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx&quot;&gt;www.lonza.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7&quot;&gt;www.atcc.org&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Cell culture incubator&amp;nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Water Jacketed Incubator</td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>K&amp;amp;H Manufacturing</td><td>1020</td><td>K&amp;amp;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (&lt;a href=&quot;http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y&quot;&gt;www.amazon.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr></tbody></table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

תאים חסיד בתרבות לשמור על מדינה מקוטבת כדי לתמוך בתנועה ויחסי גומלין בין תאית. Nanopodia דק, מוארך, במידה רבה, ה-F-אקטין שלילי תחזיות קרום בתאי האנדותל והסרטן שניתן דמיינו באמצעות TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) מכתים immunofluorescence. אשכולות TM4SF1 בקוטר 100-300 מיקרומטר TMED (ה TM 4SF1 nriched omains ד מיקרו) המכילה 3 עד כמה ש14 TM4SF1 מולקולות בודדות. TMED מסודר לסירוגין לאורך nanopodia במרווח קבוע של 1 עד 3 TMED למ μ ותקיפות לעגן nanopodia למטריקס. זה מאפשר nanopodia להאריך יותר מ -100 μ מ &#39;מהחלק האחורי המוביל קדמי או נגרר של תאי האנדותל או גידול מקוטבים, וגורם לשאריות קרום להישאר מאחור בmatrix כאשר התא עובר משם. TMED וnanopodia כבר התעלמו בגלל השבריריות הקיצוניות שלהם והרגישות לטמפרטורה. שטיפה וקיבוע שיגרתי לשבש את המבנה. Nanopodia נשמרים על ידי קיבוע ישיר בparaformaldehyde (PFA) ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריה חשיפה קצרה ל0.01% טריטון X-100 לפני הצביעה. Nanopodia לפתוח אופקים חדשים בביולוגיה של תא: הם מבטיחים לעצב מחדש את ההבנה של איך תאים לחוש את סביבתם שלנו, לאתר ולזהות תאים אחרים במרחק, ליזום אינטראקציות בין תאית במגע קרוב, ושל מנגנוני האיתות מעורבים בתנועה, שגשוג, ותא תאי תקשורת. השיטות שפתחו ללימוד nanopodia נגזר TM4SF1 עשויות להיות שימושיות עבור מחקרים של nanopodia היוצרים בסוגי תאים אחרים דרך הסוכנות של tetraspanins הקלאסי, בעיקר CD9 הביע כל מקום בגוף, CD81, וCD151.

עבור שלב 1: אם תאים (כגון HUVEC וPC3 השתמש במחקר זה) יכולים לגדול באופן נורמלי, תאים יצרפו לדיסק מצופה קולגן בתוך 30 דקות אחרי שהם זורעים, לקטב ולהיות ניידים זמן קצר לאחר מכן, ולהאריך nanopodia קדימה הנתיב שלהם של תנועה. 1A ו-1B דמויות בה?...

Watch this Scientific Journal Video about Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions at JoVE.com

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia ערוצי קרום דקים אך שבירים שמרחיבים עד 100 מיקרומטר מהאחורי המוביל קדמי או נגרר של תא ולחוש את הסביבה הסלולרית. קיבעון ישיר על 37 ° C, כביסה עדינה, והימנעות מממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון ושל X-100 ריכוזי טריטון גבוהים יותר נדרש כדי לבחון מבנים הסלולר אלה.

Nanopodia - תחזיות דקה, שבירה ממברנה עם תפקידים בתנועת תא ואינטראקציות בין תאית

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Harvard Medical School.  Nanopodia ערוצי קרום דקים אך שבירים שמרחיבים עד 100 מיקרומטר מהאחורי המוביל קדמי או נגרר של תא ולחוש את הסביבה הסלולרית. קיבעון ישיר על 37 ° C, כביסה עדינה, והימנעות מממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון ושל X-100 ריכוזי טריטון גבוהים יותר נדרש כד...

Video: Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Visualizing Diffusional Dynamics of Gold Nanorods on Cell Membrane using Single Nanoparticle Darkfield Microscopy

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and provides a theoretical basis for the rational design of nano-medicine delivery. Single particle tracking (SPT) analysis could probe the position and orientation of individual nanoparticles on cell membrane, and reveal their translational and rotational states. Here, we show how to use traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on live cell membrane. We also show how to extract the location and orientation of AuNRs using ImageJ and MATLAB, and how to characterize the diffusive states of AuNRs. Statistical analysis of hundreds of particles show that single AuNRs perform Brownian motion on the surface of U87 MG cell membrane. However, individual long trajectory analysis shows that AuNRs have two distinctly different types of motion states on the membrane, namely long-range transport and limited-area confinement. Our SPT methods can be potentially used to study the surface or intracellular particle diffusion in different biological cells and can become a powerful tool for investigations of complex cellular mechanisms.

Here, we show the use of traditional dark-field microscopy to monitor the dynamics of gold nanorods (AuNRs) on cell membrane. The location and orientation of single AuNRs are detected using ImageJ and MATLAB, and the diffusive states of AuNRs are characterized by single particle tracking analysis.

הדמיה של דינמיקה דיפוזיונית של ננו-ירדס זהב על קרום התא באמצעות מיקרוסקופיה אחת של ננו-חלקיקים בדארקפילד

Analyzing the diffusional dynamics of nanoparticles on cell membrane plays a significant role in better understanding the cellular uptake process and ...

Biochemistry

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out shape. Following the cell-substrate attachment, the cell forms a thin sheet of lamellipodia emanating from the cell body. In the lamellipodia, globular actin (G-actin) monomers polymerize into a dense filamentous actin (F-actin) meshwork that pushes against the plasma membrane, thereby providing the mechanical forces required for the cell to spread. Notably, the molecular players that control the actin polymerization in lamellipodia are essential for many other cellular processes, such as cell migration and endocytosis. 
Since spreading cells form continuous lamellipodia that span the entire cell periphery and persistently expand outward, cell spreading assays have become an efficient tool to assess the kinetics of lamellipodial protrusions. Although several technical implementations of the cell spreading assay have been developed, a detailed description of the workflow, which would include both a step-by-step protocol and computational tools for data analysis, is currently lacking. Here, we describe the experimental procedures of the cell spreading assay and present an open-source tool for quantitative and unbiased analysis of cell edge dynamics during spreading. When combined with pharmacological manipulations and/or gene-silencing techniques, this protocol is amenable to a large-scale screen of molecular players regulating lamellipodial protrusions.

In this protocol, we present the experimental procedures of a cell spreading assay that is based on live-cell microscopy. We provide an open-source computational tool for the unbiased segmentation of fluorescently labeled cells and quantitative analysis of lamellipodia dynamics during cell spreading.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the construction and regeneration of tissues, and is critical in embryonic development, immunological responses, and wound healing. Dysregulation of cell motility contributes to pathological disorders, such as chronic inflammation and cancer metastasis. Cell migration, tissue invasion, axon, and dendrite outgrowth all initiate with actin polymerization-mediated cell-edge protrusions. Here, we describe a simple, efficient, time-saving method for the imaging and quantitative analysis of cell-edge protrusion dynamics during spreading. This method measures discrete features of cell-edge membrane dynamics, such as protrusions, retractions, and ruffles, and can be used to assess how manipulations of key actin regulators impact cell-edge protrusions in diverse contexts.

This protocol aims to measure the dynamic parameters (protrusions, retractions, ruffles) of protrusions at the edge of spreading cells.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Types of Membrane Protrusions

The protrusion of the cell surface is an initial step for several cellular processes, including cell migration, phagocytosis, and neurite outgrowth. These membrane protrusions are a result of cytoskeletal rearrangement. The most&#160; widely observed cell protrusions include lamellipodia, pseudopodia, filopodia, microvilli, invadopodia, and podosomes. These protrusions can be of two types &#8212; static or dynamic.
The microvilli, an example of stable protrusions, are finger-like projections with a generally stable actin architecture. These brush-like extensions are found on the apical surface of epithelial cells lining internal organs, such as the intestine. They greatly increase the surface area for enhanced nutrient absorption.
Contrastingly, dynamic protrusions are primarily involved in cell migration. The majority of these structures use actin polymerization as the driving force for membrane deformation. Additionally, actin binds myosin motor proteins to form contractile bundles. The myosin motors pull on the actin filaments, thus rearranging them during migration. Based on their appearance, actin-dependent protrusions are classified as lamellipodia, pseudopodia, filopodia, and invadopodia.
Many migrating cells like keratinocytes or fibroblasts exhibit lamellipodia, which are thin, sheet-like projections at the leading edge of these cells. They are involved in the rapid migration of cells to sites of injury for repair and regeneration. Lamellipodia&#160; can extend bundled actin filaments to form finger-like projections called filopodia. For example,&#160; neurons form these outgrowths to sense environmental signals and rewire the nervous system after trauma.
Other membrane protrusions include the podosomes&#160; and invadopodia. While podosomes are transient peg-like structures developed by migrating cells like macrophages, invadopodia are projections produced by metastatic cells on the extracellular matrix. Additionally, invadopodia secrete proteolytic enzymes, degrading the extracellular matrix to break tissue architecture and metastasize into adjacent tissues. Lastly, blebs are spherical membrane projections formed due to internal hydrostatic pressure. They do not depend on the actin cytoskeleton for their enlargement. Fibroblasts and immune cells exhibit bleb formation for migration and other cellular processes such as apoptosis.

סוגי בליטות ממברנות

The protrusion of the cell surface is an initial step for several cellular processes, including cell migration, phagocytosis, and neurite outgrowth. These ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Cell Polarization and Migration

KEY TERMS AND CONCEPTS

Mechanism of Lamellipodia Formation

Cells migrating in response to external stimuli form lamellipodia, which are thin membrane protrusions supported by a mesh of linked, branched, or unbranched actin filaments. These actin filaments interact with myosin motor proteins, creating the dynamic actomyosin complex within the cytoskeleton. Contractility, or the ability to generate contractile stress, is inherent to the actomyosin complex. It helps cells detect the stiffness of the surrounding ECM and exert contractile force for migration.
At the leading edge, the binding of an activated Rac GTPase to the WAVE complex initiates lamellipodia formation. Subsequently, the WAVE complex changes conformation to prime actin nucleators like the Arp2/3 complex for polymerization and branching of filaments. Additionally, members of the formin family localize at the sites of lamellipodia formation, elongating the unbranched filaments. The force generated by continuous actin polymerization pushes the membrane outwards and forms the membrane protrusion. The actin mesh at the leading edge contributes to the formation of focal adhesion points on the ECM, preventing the retraction of lamellipodia.
After lamellipodia formation, the dissociation of filaments begins at the rear end of the dynamic actin meshwork. The actin monomers steadily detach from the minus ends and attach to the plus ends of filaments in the actin network, resulting in treadmilling. This cyclic assembly and disassembly causes&#160; the forward movement of the entire actin filament network even though the position of individual filaments remains stationary to the substratum.
Behind the dynamic lamellipodial meshwork lies a stable network of bundled linear actin filaments called the lamella. This actin network supports the lamellipodium by developing mature and strong adhesion sites, which resist cell compression during migration. Additionally, stable actin filaments of the lamella associate with myosin proteins and use their inherent contractibility to propel the cell forward.

מנגנון היווצרות Lamellipodia

Cells migrating in response to external stimuli form lamellipodia, which are thin membrane protrusions supported by a mesh of linked, branched, or ...

Mechanism of Filopodia Formation

Filopodia are thin, actin-rich cellular protrusions that play an important role in many fundamental cellular functions. They vary in their occurrence, length, and positioning in different cell types, suggesting their diverse roles.
Their main function is to guide migrating cells during normal tissue morphogenesis or cancer metastasis by recognizing and making initial contacts with the extracellular matrix. However, they can also act as stationary cell anchors or help to establish communication between two cells. For example, the formation of filopodial bridges between two adjacent endothelial or epithelial cells is important for the subsequent establishment of adherens junctions. In addition, filopodia can also help the cells to reach and internalize distant targets, such as pathogens.
Filopodia Formation and Disassembly
Actin nucleation, elongation, and bundling are critical for filopodia formation and function. The filopodia core comprises 12-20 actin filaments spaced 12 nm apart. Bundling of these filaments by fascin is crucial to give filopodia the rigidity to maintain its elongated shape.
The disassembly of actin filaments during the retraction phase involves periodic helical and rotational motion of the actin shaft and is regulated by several factors. For instance, capping proteins promote filopodial retraction by shielding the polymerizing ends of the filaments from further elongation. RhoA kinase activity also regulates actin polymerization within filopodia.

מנגנון היווצרות פילופודיה

Filopodia are thin, actin-rich cellular protrusions that play an important role in many fundamental cellular functions. They vary in their occurrence, ...

Cancer Cell Migration through Invadopodia

Invadosome is a broad category of cell surface structures with proteolytic activity that&#160; degrades the extracellular matrix (ECM). Invadosomes are present in normal cell types, including macrophages, endothelial cells, and neurons, as well as tumor cells. Although the macrophage podosomes and tumor cell invadopodia are classified as invadosomes, they have different structures, molecular pathways, and functions. Podosomes are short structures that last for a few minutes. However, invadopodia can last for hours and are many microns in length.
In tumors, invadopodia are essential for cell intravasation and extravasation through blood vessels. They are similar to lamellipodia and filopodia, with a filamentous actin core shaped by actin nucleators and regulatory factors. The lifecycle of an invadopodium is initiated by complex processes involving various signaling cascades that remodel the cytoskeleton and cell membrane. The actin cytoskeleton is reorganized and assembled into new filaments and branches, which requires the activity of actin nucleators such as formins or the ARP2/3 complex.
The Arp2/3 complex requires nucleation-promoting factors (NPF) for optimal activity as it is slow to spontaneously initiate new actin branches. Cortactin, an NPF and scaffold protein, recruits ARP2/3 to filaments, allowing branching of the actin network. Additionally, cortactin can stabilize the newly generated branches. The formin proteins induce the elongation of unbranched actin filaments, while filament bundling is coordinated by fascin. Together these events promote actin filament polymerization and maturation of the invadopodium.&#160;
After the invadopodium stabilizes, kinesins use the neighboring microtubules as tracks to transport vesicles with proteases from the Golgi network. These vesicles release enzymes such as&#160; matrix metalloproteases, cathepsins, and serine proteases from the membrane of the invadopodia to degrade the surrounding ECM. Lastly, the actin core is disassembled to retract the invadopodium. Several proteins are implicated in the retraction pathway, but it is unclear how these proteins interact during the final stage of the invadopodium life cycle.&#160;

נדידת תאים סרטניים דרך Invadopodia

Invadosome is a broad category of cell surface structures with proteolytic activity that&#160; degrades the extracellular matrix (ECM). Invadosomes are ...

Cell Migration

Cell migration, the process by which cells move from one location to another, is essential for the proper development and viability of organisms throughout their life. When cells are not able to migrate properly to their ordained locations, various disorders may occur. For example, disruption in cell migration causes chronic inflammatory diseases such as arthritis.

<h4>General Mechanism</h4>

Generally, cellular migration begins when a cell, such as a fibroblast, responds to an external-polarizing-chemical signal. As a result, one end extends itself as a protrusion called the leading edge, which attaches itself to substrates via secreted adhesive compounds, in its microenvironment. The trailing edge&mdash;the area that serves as the back of the cell&mdash;also adheres to substrates to anchor the cell. After adhesion, the cell is propelled towards its destination by a sequence of contractions that are generated by cytoskeletal motility structures. Then, the adhesive attachment at the trailing edge gets released. These steps are repeated cyclically until the fibroblast reaches its destination.

<h4>Polarization</h4>

There is a diversity in the different types of signaling molecules that initiate cell migration. They illicit two types of responses: chemokinetic and chemotactic. Chemokinesis refers to movement that occurs when signaling molecules either symmetrically or asymmetrically stimulate cell migration without dictating the directionality of the resultant movement. Chemotaxis refers to a movement where a gradient of soluble (chemotactic) or substrate-bound (haptotactic) signaling molecules dictates the directionality of cellular movement.

Membrane receptors such as G-protein coupled receptors (GPCR) and receptor tyrosine kinase receptors (RTK) detect external signaling molecules and cause an accumulation of phosphatidylinositol (3,4,5) triphosphate (PIP3) at the leading edge. The accumulation of PIP3 then leads to the activation of Rho-family Ras-like small proteins called Rac, Cdc42, and Rho. Rac and/or Cdc42 cause cytoskeletal changes such as actin polymerization at the leading edge while Rho causes actin-myosin contractions at the trailing edge. As a result of actin polymerization, protrusions are generated at the leading edge.

<h4>Types of Protrusions</h4>

Actin serves as a physical scaffold for protrusions. Consequently, the shape of protrusion structures varies depending on how actin is assembled. Two commonly studied types of protrusions are lamellipodia and filopodia. Lamellipodia are broad, sheet-like protrusions that contain a branched network of thin, short actin filaments. When lamellipodia lift away from the substrate and move backward, a notably distinct ruffling movement occurs. Lamellipodia protrusions can be found in cells like fibroblasts, immune cells, and neurons. Filopodia are thin-finger-like protrusions that emanate from cell membranes. They are often observed in cells, such as neurons, working in tandem with lamellipodia during migration.