אנו מכירים ד&quot;ר הרולד דבוז&#39;ק לדיונים מועילים כולל ההצעה לנסות קיבעון ב37 מעלות צלזיוס PFA. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH CA92644 P01 ועל ידי חוזה מהקרן הלאומית לחקר הסרטן.

1. תא תרבות בדיסק זכוכית מצופה קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיסקי זכוכית מקום (12 מ&quot;מ קוטר) בתוך צנצנת זכוכית (4 גר &#39;) וחיטוי לעקר את הדיסקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 25 מיליליטר 70% אתנול בצינור פלקון 50 מיליליטר ולמקם אותו במכסת מנוע בתרבית תאים. פתרון זה ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים עד לרמה של הפתרון יורדת ל 20 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מלקחיים חדים עם נקודת קנס נוספת באתנול 70% למשך 5 דקות לפני השימוש בו לטיפול בזכוכית קשיח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את המלקחיים מהצינור ולסגור את המכסה, ולאחר מכן מניח בעדינות את המלקחיים אתנול טופל בחלק העליון של הצינור לייבוש באוויר למשך 2 דקות. אל תאפשר לקצה המלקחיים לגעת בשום דבר במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים סטריליות כדי לתפוס את דיסק זכוכית סטרילית אחד מתוך צנצנת הזכוכית ולמקם אותו בטוב של צלחת תרבית תאי 24 גם. חזור על פעולה עד המספר הרצוי של בארות כבר מאוכלס עם דיסקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 500 μl של פתרון קולגן שור (50 ng / ml) לתוך באר כל אחד שמכילה כוס דיסק ולמקם אותו במעלות צלזיוס 37, 5% תרבות חממת CO 2 תא לפחות 30 דקות. אין כל רע בדגירה ארוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר HUVEC (אדם תאי טבור הווריד האנדותל) או PC3 (תאים סרטניים בערמונית) שכבר גדלו בצלחת תרבית תאי 150 מ&quot;מ דרך trypsinization ולחסום את פעילות טריפסין באמצעות מדיום התרבות השלם שלה. איסוף תאים לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר התא ולוודא את הכדאיות גדולה יותר מ90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 10 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במדיום התרבות לדלל את התאים ל10 5 תאים / מיליליטר. מקום תאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הקולגן במכסת המנוע בתרבית תאים ומניחים בעדינות 500 μl של השעיה תא היטב כל אחד שבדיסקי זכוכית precoated עם קולגן. 5 x 10 4 תאים / היטב בצלחת 24 גם ייתן 60% confluency לHUVEC וconfluency 30% לתאי PC3. הערה: להוסיף עוד השעיה תא לצפיפות תאים גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים במעלות צלזיוס 37, 5% CO 2 באינקובטור במשך שעה 1, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, או 24 שעות כדי לעקוב אחר פעילות nanopodia והמעבר תא. בדרך כלל, תאים יצרפו לזכוכית הדיסק ב30 דקות הראשונות, ולאחר מכן להתחיל לקטב ולהעביר בשעה הראשונה, ולבצע אינטראקציות בין תאית וחלוקת תא בשעות שלאחר מכן. </li></ol> 2. קיבוע תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל אחד גם צריכים 500 μl PFA 4% (paraformaldehyde) כדי לתקן את התאים. כך או מיוצר באופן מסחרי או טרי 4% יכול לשמש PFA. לחשב את כמות PFA דרושה המבוסס על מספר הבארות שהוכנו, ולמקם את PFA בצינור בז 15 מ&quot;ל. זהירות: paraformaldehyde הוא קרצינוגן חשד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינור בז בעמדת קלקר שכבר הייתה במקום בחממה 37 מעלות צלזיוס. השאר את הצינור בחממה במשך 30 דקות למלחמהמ &#39;עד PFA 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כרית חימום במכסת המנוע בתרבית ולהפעיל אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחת תרבית תאי 24 גם וPFA מתוך האינקובטור prewarmed ולמקם אותו על גבי כרית החימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ביד אחת כדי לשאוב את המדיום מן באר, ומייד לאחר השימוש מצד השני להחליק 500 PFA μl עדינות לתוך הבאר דרך הקצה היטב. לשאיפה קלה, להטות את צלחת התרבות ב45 על °, משעין אותו על דוכן הקלקר כך שהוא יציב בזווית זו. זה יקל על השאיפה והוספת פתרון PFA לגם מבלי להפריע לתאים בתרבית. זהו הצעד החשוב ביותר לשימור המבנה התאי המקורי של פעילות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עד שכל הבארות עם כוס דיסק קיבלו PFA. הערה: כל הצעדים שצריך לשנות את הפתרון קיים מהבאר יחולו הליכי שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחת בחזרה למכסת מנוע התרבות ולהטות נגד קלקר כמתואר בשלב 2.5. השתמש ביד אחת כדי להעביר את PFA עדינות מהבאר אל צינור איסוף; להשתמש לעומת זאת למקום מייד אחר כך לפחות 500 טמפרטורת חדר PBS μl בבאר. אחרי הכל הבארות נשטפו, לחזור ולחזור על שטיפת PBS פעם נוספת בכל באר. רוקן את PFA נאסף לתוך מיכל פסולת מסוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגר חסימת ICC על ידי הוספת 2% שור סרום עוברי לPBS. 0.04% אזיד הנתרן (לדלל מ20% פתרון מניות) הוא הוסיף כחומר משמר. זהירות: אזיד הנתרן הוא תרכובת רעילה. החיץ ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת זמן ארוכה ללא זיהום חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צלחת התרבות עדיין מוטה נגד עמדה, שוב לעבור על כל פריט גם aspirating להסיר PBS ומייד אחר כך הוסיף 500 μl של חיץ ICC חסימה. תאים מוכנים למכתים immunofluorescence עכשיו. במידת צורך,ניתן לאחסן את תאים קבועים במקרר 4 ° C במשך שבוע ללא אובדן משמעותי של חלבון TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 Immunofluorescence הכתמה של Nanopodia <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל טוב, להחליף את חיץ חסימת 500 ICC μl עם מאגר חסימה חדש המכיל 0.01% טריטון X-100 ולתת לו לשבת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. אין להשתמש גבוה יותר מאשר 0.03% טריטון X-100 כפי שהוא יסיר TM4SF1 מקרום תא. PBS שטף תאים מהצעד 2.10 ניתן להעביר ישירות למאגר החסימה המכיל טריטון אם הצביעה היא מוכנה להתחיל מייד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדן ראשוני נגד TM4SF1 (או אנטי CD9) ל0.5 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר ICC חסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל טוב, הסר את ICC/0.01% חיץ טריטון ולהחליף אותו עם 300 μl של הפתרון אנטי TM4SF1 הנוגדנים. דגירה 2 שעות בטמפרטורת חדר או להשאיר לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף היטב כל אחד עם לא פחות מ 500 μl PBS. חזור 3x; בכל פעם שנותנת בleAST 5 דקות זמן דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן וphalloidin המשני בבית הדין הפלילי הבינלאומי חיץ חסימה, באמצעות דילול 1,000 זמנים של אלקסה 488 נוגדן שכותרתו חמור אנטי עכבר המשני (2 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי) ו -1,000 דילול x של phalloidin (50 ng / מיליליטר בריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהוסיף 300 μl של נוגדנים משני ופתרון phalloidin לכל היטב דגירה עבור שעה 2 או להשאיר אותו לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי כביסה PBS עם לפחות דגירה 5 דקות לכל לשטוף. בכביסה האחרונה, תעזוב את כל הטוב בPBS במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפת טיפה אחת (~ 10 μl) של תקשורת אנטי לדעוך הרכבה בשקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנד קצה 19 G ½ 1 במחט מזרק 90 ° על ידי לחיצה בעדינות על משטח קשה. השתמש ביד אחת להחזיק את המחט והתחננה ובעדינות להרים את כוס דיסק מהבאר, ולהשתמש ביד השנייה כדי לתפוס את הדיסק באמצעות המלקחיים החדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל זכוכית הדיסק &amp;# 160; עם פנים כלפי מטה ומאפשרות מגע בצד תא תקשורת ההרכבה בשקופית הזכוכית. מניח בעדינות את כוס הדיסק ולתת לו להתייבש במשך הלילה במקום חשוך בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לתמונת nanopodia immunofluorescence המוכתם, או לאחסן את השקופיות בקופסא שקופיות ב -20 ° C. השקופיות יישארו לצפייה במשך כמה חודשים ב-20 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li><li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis.">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li><li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4SF1:+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration.">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li><li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+effects+of+L6,+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas.">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li><li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+and+stem+cell+research.">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li><li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains.">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li><li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF/VEGF:+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis.">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li><li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+(MAPs).">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li><li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability.">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li><li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA,+cell+surface+proteins,+and+intracellular+proteins.">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li><li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes.">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li><li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+(SECM).">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li><li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13+(aminopeptidase+N)+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells.">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Nanopodia ערוצי הממברנה תאית דקים שבתקיפות לצרף מטריקס דרך TMED ויכול להאריך יותר מ -100 מיקרומטר מתא סלולרי מקוטב לחוש את הסביבה ולתווך אינטראקציות בין תאית 2,3. Nanopodia לדבוק מטריצה ​​כך בתוקף כי שאריות הם השאירו מאחוריהם כמהלכי תא משם (איורים 1 ו -2). Nano...

במהלך קיטוב לתנועה, תאים של בעלי החיים להאריך מגוון של בליטות דינמיות, קרום מהשטח שלהם, ובכלל זה filopodia, lamellipodia, סיבי הכחשה, וסלסולי 1. לאחרונה התווסף לרשימה זו היתה nanopodia, סוג מוכר חדש של דק (100-300 מיקרומטר קוטר), הקרנה מוארכת (באורך של עד 50-100 מיקרומטר) קרום המספקים ערוצי קרום להארכה של מבני F-אקטין כגון filopodia וסיבים הכחשה, וכתם שחיובי עם TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) בתאי אנדותל וגידול בתרבית 2,3. TM4SF1 הוא חלבון עם טופולוגיה כמו tetraspanin-שהיה ידוע במקור אנטיגן תאים סרטניים 4 לפני הגילוי כי המולקולה היא סמן ביולוגי של תאי האנדותל שממלא תפקיד חיוני בהתפשטות תאי אנדותל והגירה 2,3. מכתים immunofluorescence גילה כי TM4SF1 הוא מקומי לperinucשלפוחית ​​ליר וקרום הפלזמה, והוא מועשר בomains TM 4SF1 דואר nriched מייקר ד (TMED). nanopodia TMED עוגן למטריקס ובהווה בדפוס פסים של מרווח קבוע של 1-3 אורך TMED / מיקרומטר של nanopodia. Nanopodia להאריך בדרך כלל מהחזית המובילה של תא ונגרר מאחור בתא קיטוב לתנועה. בשל אופי חסיד משרד עורכי TMED, nanopodia לא מצליח לחזור חזרה לתא כפי שהוא נע משם; שאריות nanopodia נטושות וכך לאתר את הנתיב של תנועה סלולרית. Nanopodia לספק ערוצי קרום להארכה והכחשה F-אקטין, ואתרים של אינטראקציות ותקשורת בין תאית 2,3. מאפיינים אלה אומר כי nanopodia מספקים הזדמנות ייחודית ללמוד את מנגנוני הרכבה F-אקטין במהלך קיטוב סלולארי, חישה סלולרית של הסביבה, קביעת הנתיב וכיוון התנועה של תא, ואינטראקציות בין תאיתnd תקשורת. בשל האופי הידרופובי מאוד של TMED והטבע הקרומי הדק ושברירי של nanopodia, טיפול מיוחד צריך להילקח על מנת לשמר TMED וnanopodia. הרס nanopodia והסרת TMED ידי שיטות מעבדה משותפות הוא סיבה אפשרית לכך שרק שישימה ושלושה פרסומים שהופיעו בTM4SF1 מאז הגילוי הראשון שלה בשינה 1986 1 ולחוסר ידע של העשרת TM4SF1 ב100-300 מיקרומטר microdomains על מלא פני התא ועד לדו&quot;ח של TM4SF1 בתאי האנדותל ב2009 2. שיטות immunostaining קונבנציונליות נפוצות שימוש בממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון כדי לתקן תאים ולהשתמש 0.1% או ריכוז טריטון X-100 גבוה יותר לpermeabilize תאים 5. מחקרים שתוארו כאן מיושמים שלושה שינויים משמעותיים בשיטה המקובלת לחשוף TMED וnanopodia: (i) להשתמש 37 מעלות צלזיוס PFA 4% ולתקן תאים ב3776; C חממה, (ii) חלה כביסה PBS טמפרטורת חדר עדינה, וכן (iii) להשתמש בפחות מ 0.03% טריטון X-100 רק לזמן קצר לpermeabilize תאים לפני תוספת של נוגדן ראשוני, כפי שטריטון X-100 גבוה יותר מאשר 0.03% יהיה לחלץ TM4SF1. כל tetraspanins יוצר microdomains על קרום התא 6 וחלק colocalize עם TMED בתאי האנדותל וגידול 2,3. כtetraspanins כמו CD9, CD81, ובאים לידי ביטוי בכל מקום בCD151, הפרוטוקול מכתים המתוארים כאן יכול להיות מורחב לסוגי תאים רבים ושונים, כי חוסר TM4SF1 למחקרים של תפקוד nanopodia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1597">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass discs&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-545-82&#160;</td>
			<td style="width:983px;">12-mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass jar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-310</td>
			<td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">12-544-1</td>
			<td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50-ml falcon tube&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:133px;">352070</td>
			<td>50-ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">15-ml falcon tube with Styrofoam rack</td>
			<td style="width:160px;">Corning</td>
			<td style="width:133px;">430790</td>
			<td>Corning 15-ml PP Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sharp forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">13-812-42</td>
			<td>Dissecting Extra-Fine-Pointed Splinter Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353047</td>
			<td>24-well Cell Culture Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">150-mm cell culture plate&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">353025</td>
			<td>150-mm cell culture plate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">19G 1 &#189; syringe needle&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">309635</td>
			<td>19G 1 &#189;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>2701</td>
			<td>Decon&#39;s Pure Ethanol 200 Proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">collagen solution&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">354249</td>
			<td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:160px;">Cellgro</td>
			<td style="width:133px;">25-053-CI</td>
			<td><a name="RANGE!D15">0.25% Trypsin-EDTA 1X</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>DMEM high glucose (1X), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">75889 5 LT</td>
			<td style="width:983px;">PBS, 10X Solution, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:160px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:133px;">19943 1 LT</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4135-500ML</td>
			<td><a name="RANGE!D19">Fetal Bovine Serum</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">EGM2-MV</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">T8787</td>
			<td>Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">S2002-25G</td>
			<td>solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human TM4SF1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Millipore</td>
			<td style="width:133px;">MAB3127</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">mouse anti-human CD9 antibody&#160;</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:133px;">555370</td>
			<td>Epitope is located in extracellular domain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">A-21202</td>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Chemicon</td>
			<td style="width:133px;">90324</td>
			<td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">anti-fade mounting media&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:133px;">P-36931</td>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Buffers and solutions</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">70% ethanol&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td>17.5 ml of ethanol (200 proof) 
			7.5 ml of double deionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">10X PBS (make 200 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20 ml of 10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">180 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">20% Triton X-100 (make 20 ml)&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">4 ml</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">16 ml double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">4% NaN3 (make 25 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">1 g of NaN3</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 ml of double deionized water</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">50 ng/ml bovine collagen solution in PBS (make 5 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Make stock soln. of 50 &#956;g/ml (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">830 &#956;l of Collage I (3 mg)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml PBS&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">ICC Blocking Buffer (50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">49 ml PBS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">2% FBS (add 1 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:983px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">0.04% NaN3 (add 100 &#956;l of 4% NaN3)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (make 50 ml)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">50 ml of ICC Blocking Buffer&#160;</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">25 &#956;l of 20% Triton X-100</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Cell</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">HUVEC&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Lonza&#160;</td>
			<td>C2517A</td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PC3</td>
			<td style="width:160px;">ATCC</td>
			<td style="width:133px;">CRL-1435</td>
			<td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">cell culture hood</td>
			<td style="width:160px;">NuAIRE</td>
			<td style="width:133px;">Nu-425-600</td>
			<td>NU-425 (Series 60) BIOLOGICAL SAFETY CABINET&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:323px;">37 &#176;C, 5% CO2 cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:160px;">CellStar</td>
			<td style="width:133px;">QWJ300DABA&#160;</td>
			<td>Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">heating pad&#160;</td>
			<td>K&#38;H Manufacturing</td>
			<td style="width:133px;">1020</td>
			<td style="width:983px;">K&#38;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">centrifuge</td>
			<td style="width:160px;">Sorvall&#160;</td>
			<td style="width:133px;">T6000B&#160;</td>
			<td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemacytometer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">Z359629</td>
			<td>Bright-Line Hemacytometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanopodia - thin, fragile membrane projections with roles in cell movement and intercellular interactions

תאים חסיד בתרבות לשמור על מדינה מקוטבת כדי לתמוך בתנועה ויחסי גומלין בין תאית. Nanopodia דק, מוארך, במידה רבה, ה-F-אקטין שלילי תחזיות קרום בתאי האנדותל והסרטן שניתן דמיינו באמצעות TM4SF1 (הטרנסממברני-4-L-שש משפחה-1) מכתים immunofluorescence. אשכולות TM4SF1 בקוטר 100-300 מיקרומטר TMED (ה TM 4SF1 nriched omains ד מיקרו) המכילה 3 עד כמה ש14 TM4SF1 מולקולות בודדות. TMED מסודר לסירוגין לאורך nanopodia במרווח קבוע של 1 עד 3 TMED למ μ ותקיפות לעגן nanopodia למטריקס. זה מאפשר nanopodia להאריך יותר מ -100 μ מ &#39;מהחלק האחורי המוביל קדמי או נגרר של תאי האנדותל או גידול מקוטבים, וגורם לשאריות קרום להישאר מאחור בmatrix כאשר התא עובר משם. TMED וnanopodia כבר התעלמו בגלל השבריריות הקיצוניות שלהם והרגישות לטמפרטורה. שטיפה וקיבוע שיגרתי לשבש את המבנה. Nanopodia נשמרים על ידי קיבוע ישיר בparaformaldehyde (PFA) ב 37 מעלות צלזיוס, ואחריה חשיפה קצרה ל0.01% טריטון X-100 לפני הצביעה. Nanopodia לפתוח אופקים חדשים בביולוגיה של תא: הם מבטיחים לעצב מחדש את ההבנה של איך תאים לחוש את סביבתם שלנו, לאתר ולזהות תאים אחרים במרחק, ליזום אינטראקציות בין תאית במגע קרוב, ושל מנגנוני האיתות מעורבים בתנועה, שגשוג, ותא תאי תקשורת. השיטות שפתחו ללימוד nanopodia נגזר TM4SF1 עשויות להיות שימושיות עבור מחקרים של nanopodia היוצרים בסוגי תאים אחרים דרך הסוכנות של tetraspanins הקלאסי, בעיקר CD9 הביע כל מקום בגוף, CD81, וCD151.

עבור שלב 1: אם תאים (כגון HUVEC וPC3 השתמש במחקר זה) יכולים לגדול באופן נורמלי, תאים יצרפו לדיסק מצופה קולגן בתוך 30 דקות אחרי שהם זורעים, לקטב ולהיות ניידים זמן קצר לאחר מכן, ולהאריך nanopodia קדימה הנתיב שלהם של תנועה. 1A ו-1B דמויות בה?...

Watch this Scientific Journal Video about Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions at JoVE.com

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Nanopodia ערוצי קרום דקים אך שבירים שמרחיבים עד 100 מיקרומטר מהאחורי המוביל קדמי או נגרר של תא ולחוש את הסביבה הסלולרית. קיבעון ישיר על 37 ° C, כביסה עדינה, והימנעות מממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון ושל X-100 ריכוזי טריטון גבוהים יותר נדרש כדי לבחון מבנים הסלולר אלה.

Nanopodia - תחזיות דקה, שבירה ממברנה עם תפקידים בתנועת תא ואינטראקציות בין תאית

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Harvard Medical School.  Nanopodia ערוצי קרום דקים אך שבירים שמרחיבים עד 100 מיקרומטר מהאחורי המוביל קדמי או נגרר של תא ולחוש את הסביבה הסלולרית. קיבעון ישיר על 37 ° C, כביסה עדינה, והימנעות מממסים אורגניים כמו אתנול, מתנול, או אצטון ושל X-100 ריכוזי טריטון גבוהים יותר נדרש כד...

Video: Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

הערכת אינטראקציות חלבונים בתאים חיים עם פליטה רגישה ל-FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral budding, among other vital cellular processes. For efficient biological activity, cell membranes should be rigid enough to maintain the integrity of the cell and its compartments yet fluid enough to allow membrane components, such as proteins and functional domains, to diffuse and interact. This delicate balance of elastic and fluid membrane properties, and their impact on biological function, necessitate a better understanding of collective membrane dynamics over mesoscopic length and time scales of key biological processes, e.g., membrane deformations and protein binding events. Among the techniques that can effectively probe this dynamic range is neutron spin echo (NSE) spectroscopy. Combined with deuterium labeling, NSE can be used to directly access bending and thickness fluctuations as well as mesoscopic dynamics of select membrane features. This paper provides a brief description of the NSE technique and outlines the procedures for performing NSE experiments on liposomal membranes, including details of sample preparation and deuteration schemes, along with instructions for data collection and reduction. The paper also introduces data analysis methods used to extract key membrane parameters, such as the bending rigidity modulus, area compressibility modulus, and in-plane viscosity. To illustrate the biological importance of NSE studies, select examples of membrane phenomena probed by NSE are discussed, namely, the effect of additives on membrane bending rigidity, the impact of domain formation on membrane fluctuations, and the dynamic signature of membrane-protein interactions.

This paper describes the protocols for sample preparation, data reduction, and data analysis in neutron spin echo (NSE) studies of lipid membranes. Judicious deuterium labeling of lipids enables access to different membrane dynamics on mesoscopic length and time scales, over which vital biological processes occur.

ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...