המחברים מודים באופן משמעותי את פלטפורמת PICT IBiSA במכון קירי (CNRS UMR144). עבודה זו מומנה על ידי מענקים מ: המועצה האירופית למחקר לAM.LD (Strapacemi 243,103), Nationale האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-09-PIRI-0027-PCVI), קרן InnaBiosanté (Micemico) ל MP וPM. LD ומענק ERC חוקר הצעיר Strapacemi לAM.LD.

הערה חשובה: בפרוטוקול זה מבוסס על ההנחה שהעובש המכיל את הצורה לmicrochannels הרצויה כבר כבר עשה. מידע נוסף על ההכנה של העובש כבר פורסם כבר 10. פרוטוקול זה גם בהנחה שתרבות DCs מח עצם ידועה. 1. ייצור שבבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שמן PDMS וסוכן ריפוי ב10:01 יחס משקל בכוס פלסטיק. מערבבים את שני התרכובות ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטיל את התערובת מעל microchannels נושאות העובש. הגובה הכולל חייב להיות בין 0.5-1 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בועות אוויר בפעמון צנצנת ואקום בשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS הרדן בעובש על ידי הנחת האחרון בתנור במשך שעה 2 ב 65 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע PDMS הוא בטמפרטורת חדר, לחתוך חתיכה סביב המבנה גדולה עם להב כירורגים ולקלף אותו מהתבנית (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חורים שבו תא יהיה מוזרק (בדרך כלל 2 מ&quot;מ) ולשנות את גודל PDMSעם להב כירורגים בהתאם לגודל לזכוכית תחתונה מנות שבהגירה תיבחן (איור 1). לפני שימשיך, להסיר אבק שנותר בצלחת באמצעות ניקוי עדשות נייר. זה מעדיף מחייב של PDMS לזכוכית מתוארת בשלב 1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שבב PDMS לשנות את הגודל המכיל את הערוצים על ידי דבק וקילוף נייר דבק בצידי המבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate חתיכות PDMS 30 שניות ב70% אתנול להסיר אבק וחלקיקי PDMS קטנים. ייבש אותם במהירות לאחר מכן על ידי נשיפת אוויר נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את PDMS (מבנים כלפי מעלה) ומנות תרבות בדרך אוויר (או חמצן) טיפול פלזמה במהלך 30 שניות ב300 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שני משטחים מופעלים במגע להישאר באופן קבוע PDMS למצע. במידת הצורך, להשתמש במלקחיים מתכתיים ללחוץ מעט על החלק העליון של PDMS לכפות המגע בין הפולימר והזכוכית של הצלחת (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השבב בתנור ב 65 מעלות צלזיוס עבורr 1 שעות כדי לחזק את מחייב. </li></ol> 2. ציפוי של microchannels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כל המבנה על ידי פלזמה אוויר ב300 mTorr דקות 1. זה יקדם את הכניסה של נוזל לערוצים בשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו במהירות את חורי הכניסה של השבב עם פיברונקטין ב10 מיקרוגרם / מיליליטר במים. מצעים אחרים כגון PEG עשויים לשמש כדי לשנות היצמדות תא לקירות הערוץ. שים לב שהנוזל מתפשט בכל המבנה כולו. זה ניתן לבדוק בקלות על ידי העין תחת אור רגיל או באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל. הערה: במבנים קטנים מאוד, שבו דיפוזיה היא קשה יותר, כניסה של נוזל בערוצים ניתן לכפות על ידי הצבת המבנה בפעמון צנצנת ואקום בלפחות 15 דקות. כדי לוודא את היעילות של הציפוי ניתן להשתמש במצעי ניאון (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1 שעות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר לספיחה של פיברונקטין או כל subst ציפוי אחרשיעור לקירות של הערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המבנים 3x עם PBS להסיר את מצע nonbound. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, להמשיך לפרוטוקול 3 או לאחסן את השבב על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר (24 מקסימום שעה). </li></ol> 3. טעינה נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהצלחת ולמלא את microsystem עם מדיום סלולרי. בואו דגירה עבור שעה 1 כדי להרוות את הערוצים עם המדיום. הערה: לניסויים הכוללים תרופות כמו מעכבי מולקולה, מומלץ לpreincubate ערוצים עם מדיום המכיל את התרופה בריכוז הנכון. יתר על כן, תרופות מסוימות נוטות solubilize במבנה PDMS אשר מפחית את הריכוז היעיל. כמה פתרונות הוצעו כדי לנטרל נושא זה 11-12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר DCs הצף ולשחזר תאים למחצה חסיד על ידי שטיפה עם מדיום לתרבות. ספירת תאים באמצעות hemocytometer. הערה: לקבלת הדמיה גרעין, מכתים Hoechst 33342 יכול להיות מושגת על ידי מראש בcubating 2 x 10 6 תאים במהלך 30 דקות עם הצבע ב200 / מיליליטר ng במדיום שלם. לשטוף פעמיים על ידי צנטריפוגה כדי להסיר את העודפים של צבע לפני שתמשיך את הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במהלך 5 דקות (זמן ומהירות יכולים להיות שונים בהתאם לסוג התא) וזורקים את המדיום. לדלל את גלולה להגיע לריכוז של 20 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את העודפים של מדיום מהצלחת ורוקן את חורי הכניסה במבנה PDMS באמצעות micropipette. מלא את הערכים עם 5 μl של פתרון תא להגיע לסכום של 1 x 10 5 תאים בכל חור כניסה. הערה: צפיפות תאים גבוהה נדרשת להעדיף את הקשר של התאים עם הערוצים. צפיפות תא נמוכה עלולה לגרום למספר הנמוך של תאים בתוך ערוצים וכישלון של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השבב ל30 דקות ב 37 ° C בחממה. הוסף 2 מיליליטר של מדיום שלם לצלחת הניסוי. הערה: מבנה PDMS כולה צריך bדואר מכוסה על מנת למנוע התייבשות של התאים במהלך הניסוי. אם 2 מיליליטר זה לא מספיק, להוסיף עוד מדיום כדי לכסות את מבנה PDMS לחלוטין. </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשטח התחתון החיצוני של המנות עם רקמת ניקוי עדשה לפני ששם את הצלחות מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את ההגירה במספר גדול של תאים, השתמש 10X ההגדלה ותאורה בשדה רחב בוידאו מיקרוסקופ מצויד CO 2 וטמפרטורה (איור 3). כדי להקל על מעקב תא, אור מכתים וUV Hoechst יכול לשמש (ראה שלב 3.2). הגירה יכולה להיות גם נותחה באמצעות מיקרוסקופיה confocal כדי לקבל רזולוציה גבוהה יותר של מבנים הסלולר במהלך נדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה זמן לשגות ב10X, בחר בתדירות זמן בהתאם למהירות התאים הצפויה (בדרך כלל 2 דקות לתאי דנדריטים נודדים עם מהירות של 5 מיקרומטר / min). הערה: הפרוטוקול המתואר כאן עושה not כולל ניתוח של הפרמטרים נדידת תאים. כמה נקודות מפורטות בדיון על מנת להודיע ​​לקוראים על איך להמשיך כדי לחלץ מידע מהזמן לשגות סרטים. </li></ol>

<ol>
	<li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres:+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines.">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li><li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decisions+about+dendritic+cells:+past,+present,+and+future.">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li><li>Faure-Andr&#233;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74,+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain.">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li><li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration.">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li><li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions.">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li><li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels.">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li><li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li><li>Heuz&#233;, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Dum&#233;nil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+in+confinement:+a+micro-channel-based+assay.">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li><li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convenient+method+for+modifying+poly(dimethylsiloxane)+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules.">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li><li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Teflon+microfluidic+chips.">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li><li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+World+Cell+Race.">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מתארים מכשיר המורכב מmicrochannels כשיטה כדי ללמוד את מאפייני הנדידה של מספר הגדול של תאים בניסויים אחת. מערכת ניסיונית זה מחקה את הסביבה האילוצים מוגבלים נמצאים ברקמות על ידי תאים נודדים אנדוגני. עם זאת, על ידי אילוץ הגירה בממד אחד, זה מקל על מעקב תא אוטומטי והחילוץ...

הגירה היא פונקצית הסלולר מורכבת שחשובה לתהליכים פיסיולוגיים רבים באורגניזמים רב תאיים, כוללים פיתוח, תגובות חיסוניים, והתחדשות רקמות. בנוסף, במצבים מסוימים פתולוגיים כגון פלישת גידול וגרורות להסתמך על תא תנועתיות 1. מסיבות אלה, נדידת תאים הפכה לשדה עיקרי של מחקר בהקשר של מחקר בסיסי והן translational. בvivo, רוב הרקמות מאופיינות במטריצה ​​תאית עשירה וצפיפות תאים גבוהה. נדידת תאים ולכן, בתנאים פיסיולוגיים, מתרחשת בסביבה מוגבלת מורכבת. קלסי, ככל הנראה בשל סיבות היסטוריות ומגבלות טכניות, נדידת תאים נחקרה במערכות 2D שטוחות שלא מתרבות רבים של מאפייני הסביבה שנמצאו ברקמות, כגון כליאה. יתר על כן, גורמים כמו הידבקות תא, שהם חיוניים לתנועתיות ב2D, כבר הראו לאחרונה לא להיות necessarily נדרש להגירה in vivo או בתוך ג&#39;לים, טוען כי המנגנונים השולטים תנועת תאים ב2D ובסביבות אחרות נבדלים 2. מספר מערכות פותחו כדי לחקות את התכונות מורכבות של רקמות, ג&#39;ל קולגן להיות המפורסם ביותר, אשר מכוונות למשחזר את המאפיינים של הרכב המטריצה ​​תאי 3. כאן אנו מציעים microchannels כשיטה משלימה פשוט, המאפשרת נדידת תאי מחקר בממד אחד תחת סביבה מוגבלת. במערכת זו תאים נודדים לאורך microchannels שלתוכו הם נכנסים באופן ספונטני. תאים נודדים ולאחר מכן לרכוש את הצורה של הערוצים, אימוץ גיאומטריה צינורי שסביר להניח שמחזקת את הקוטביות שלהם. התנועה ליניארית של התאים בערוצים מאפשרת מעקב תא אוטומטי והחילוץ של פרמטרים כמותיים מניסויים. מנקודת מבט הטכנית, מערכת זו היא קלה וגמישה. Coatinגרם של קירות הערוץ ניתן להשפיע, בגודל ובצורה של הערוצים יכולים להיות מותאם, ומספר גדול של תאים ניתן לנתח בניסויים אחת. מערכת זו ניתן לשנותם למעלה גם לבצע ניתוח מסך לטווח בינוני של מולקולות מעורבות בתנועתיות תא. הפרוטוקול המתואר כאן כבר טופל תוך שימוש בתאים דנדריטים (DC) כמודל סלולארי. תאים אלה הם מפתח למערכת החיסונית כפי שהוא להשתתף בייזום והאחזקה של תגובות חיסוניים ספציפיות 4. במבחנה, DCS הוכחו להעביר באופן ספונטני בסביבות מוגבלות ולכן הם מודל טוב ללמוד תנועתיות תא בmicrochannels 5,6 . חשוב מכך, מערכת זו ניתנת להארכה לניתוח הגירה של כל סוג תא אחר ניעתי כלימפוציטים מסוג T, נויטרופילים, או תאים סרטניים 7-9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:273px;">PolyDimethylSiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:131px;">GE Silicones</td>
			<td style="width:139px;">RTV615</td>
			<td style="width:405px;">Package of 90% silicone base and 10% curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core sample cutter</td>
			<td>Ted Pella Int.</td>
			<td>Harris Uni-Core&#160;</td>
			<td>Diameter 2,5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass-bottom dish</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Fluorodish FD 35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>Branson 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC 32 G</td>
			<td>For small samples (35 dishes). A bigger version is also available</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)</td>
			<td>Susos</td>
			<td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y27632</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of cell migration in microfabricated channels

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הלימוד של נדידת תאים תחת כליאה בממד אחד. היא מבוססת על השימוש בערוצי microfabricated, המטילים הפנוטיפ מקוטב לתאים על ידי אילוצים פיזיים. ברגע שערוצים פנימיים, יש תאים רק שתי אפשרויות: לנוע קדימה או אחורה. ההגירה פשוטה הזה שבו כיווניות מוגבלת מאפשרת מעקב האוטומטי של תאים והחילוץ של פרמטרים כמותיים כדי לתאר את תנועת תא. פרמטרים אלה כוללים תא מהירות, שינויי כיוון, והפסקות בזמן התנועה. Microchannels גם תואם את השימוש בסמני ניאון ולכן מתאימים ללמוד לוקליזציה של האברונים ומבנים תאיים במהלך נדידת תאים ברזולוציה גבוהה. לבסוף, את פני השטח של הערוצים יכולים להיות פונקציונליות עם מצעים שונים, המאפשרים שליטה על מאפייני ההדבקה של הערוצים או המחקר של haptotaxis. לסיכום, מערכת שעותפה תאר נועד לנתח את ההגירה של מספרים סלולריים גדולים בתנאים שבהם הן את הגיאומטריה והטבע ביוכימיים של הסביבה מבוקרות, להקל על הנורמליזציה ושחזור של ניסויים בלתי תלויים.

בכל ניסוי את פני השטח של PDMS הוא מצופה במולקולה המותאמת לאינטרס של המחקר. איור 2 ערוצי הופעות מצופים במולקולת ניאון, PLL-G-PEG, לפני ואחרי שטיפה (שלב 2.4). ניסוי כזה מאפשר שליטה על ההומוגניות של הציפוי בערוצים. לאחר טעינה סלולרי, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Study of Cell Migration in Microfabricated Channels at JoVE.com

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת.

חקר נדידת תאים בערוצי Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.8K Views.  Institut Curie.  שיטה כמותית ללימודי הגירה ספונטנית של תאים בmicroenvironment מרותק חד ממדי מתוארת. שיטה זו מנצלת את ערוצי microfabricated והוא יכול לשמש כדי לחקור הגירה של מספר הגדול של תאים בתנאים שונים בניסויים אחת. 

Video: Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to investigate mechanisms governing cell adhesion under dynamic flow conditions. For instance, cancer cells labeled with multiple fluorophores can be perfused over a potentially reactive substrate to model mechanisms of cancer metastasis. However, multi-channel single camera systems and color cameras exhibit shortcomings in image acquisition for real-time live cell analysis. To overcome these limitations, we used a dual camera emission splitting system to simultaneously capture real-time image sequences of fluorescently labeled cells in the flow chamber. Dual camera emission splitting systems filter defined wavelength ranges into two monochrome CCD cameras, thereby simultaneously capturing two spatially identical but fluorophore-specific images. Subsequently, psuedocolored one-channel images are combined into a single real-time merged sequence that can reveal multiple target molecules on cells moving rapidly across a region of interest.

Dual camera emission splitting systems for two-color fluorescence microscopy generate real-time image sequences with exceptional optical and temporal resolution, a requirement of certain live cell assays including parallel plate flow chamber adhesion assays. When software is employed to merge images from simultaneously acquired emission channels, pseudocolored image sequences are produced.

במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

מערכת ג&#39;ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not occur. With conventional templates, the absence of internal micro-channels results in the lack of cell infiltration, distribution, and inhabitance deep inside the templates. Hence, a highly porous and uniformly interconnected trabecular-bone-like template with micro-channels (biogenic microenvironment template; BMT) has been developed to address these obstacles. The novel BMT was created by innovative concepts (capillary action) and fabricated with a sponge-template coating technique. The BMT consists of several structural components: inter-connected primary-pores (300-400 &#181;m) that mimic pores in trabecular bone, micro-channels (25-70 &#181;m) within each trabecula, and nanopores (100-400 nm) on the surface to allow cells to anchor. Moreover, the BMT has been documented by mechanical test study to have similar mechanical strength properties to those of human trabecular bone (~3.8 MPa)12.
The BMT exhibited high absorption, retention, and habitation of cells throughout the bridge-shaped (&#928;) templates (3 cm height and 4 cm length). The cells that were initially seeded into one end of the templates immediately mobilized to the other end (10 cm distance) by capillary action of the BMT on the cell media. After 4 hr, the cells homogenously occupied the entire BMT and exhibited normal cellular behavior. The capillary action accounted for the infiltration of the cells suspended in the media and the distribution (active migration) throughout the BMT. Having observed these capabilities of the BMT, we project that BMTs will absorb bone marrow cells, growth factors, and nutrients from the periphery under physiological conditions.
The BMT may resolve current limitations via rapid infiltration, homogenous distribution and inhabitance of cells in large, volumetric templates to repair massive skeletal defects.

A step-by-step generic process to create a bone-like template with engineered micro-channels is presented. High absorption and retention capabilities of the template are demonstrated by capillary action via micro-channels.

תבניות נימי פעולה ייחודית על ידי מיקרו-ערוצים בעצמות כמו-יכולות לשפר את הגיוס של תאים לשיקום גדול גרמי פגם

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...