המחברים רוצים להכיר במימון החלקי של האירופי FP7 פרויקט המחקר NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246,479, http://www.namdiatream.eu) ופרויקט INTERREG IV צרפת שוויץ נעמי.

1. תרבות והרחבת ESC האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התפשטות תאים (הנקרא בערב) המכיל נוק DMEM בתוספת 20% נוק סרום, 1% חומצות אמינו שאינו חיוניות MEM, 1% L-גלוטמין 200 מ&quot;מ, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו3.5 μl β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר ESC האנושי (hESC) ב8 בינוני PM מיליליטר ו צנטריפוגות 5 דקות ב115 XG להשליך בינוני הקפאת תוספת DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מדיום PM מכיל 10 מעכב מ&quot;מ רוק כדי למנוע אפופטוזיס ולשפר את הישרדות תא על ההפשרה (דגירה שעה 24 בלבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת גורם בסיסי גדילה פיברובלסטים (bFGF) לראש הממשלה בריכוז הרצוי (4-10 ng / ml) לתחזוקה של pluripotency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט hESC על אדם מוקרן עורלת תאים מזינים (γHFF) (איור 1 א), מצופה בעבר בריכוז של 2 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית מדי יום ובמידת צורך, להסיר חלקים של גolonies מתחיל להבחין על ידי שאיפה באמצעות פיפטה פסטר חד לחתוך מוארכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם בשבוע, מושבות מעבר אנזימים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף מושבות עם 2 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ו דגירה אותם עם 0.5 מיליליטר לכל טוב של IV collagenase החם ב1 מ&quot;ג / מיליליטר ל10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שברי מושבה ב2 מיליליטר בערב וצנטריפוגות חדשים ב115 XG במשך 3 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, ניתן passaged מושבות מכאנית על ידי גירוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף מושבות עם 2 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לגרד מושבות באמצעות כלי מגרד רולר StemPro EZPassage (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שברי מושבה ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 3 דקות ב115 XG כדי להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שברי צלחת על γHFF או לעבד אותם לבידול לגופי embryoid (EBS). </li></ol></li></ol> 2. בידול ESC אדםפרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום ההתמיינות (DM) באמצעות נוק DMEM בתוספת 2% בסרום Hyclone, 1.0% חומצות אמינו שאינו חיוניות MEM, 1.0% L-גלוטמין 200 מ&quot;מ, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, 3.5 β-mercaptoethanol μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני ולשטוף מושבות עם 2 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היווצרות EB של שברי מושבה בהשעיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ו דגירה אותם עם 0.5 מיליליטר לכל טוב של IV collagenase החם ב1 מ&quot;ג / מיליליטר ל10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף שברי מושבה ב2 מיליליטר DM וצנטריפוגות החדשים ב115 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבותם בהשעיה בקובץ המצורף נמוך במיוחד 6 צלחות היטב (2 מ&quot;ל לכל טוב) במשך 4 ימים (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף וצלחת EBS שהוקם על צלחות 24 גם ג&#39;לטין מצופה 0.1% (גם EBS כ -3 /) (1D איור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, נאלץ צבירה של תאים בודדים לEBS באמצעות צלחת Aggrewell: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולנתק מושבות לתוך תאים בודדים באמצעות Accutase (0.5 מיליליטר / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה ו resuspend ב DM ב1.2 x 10 6 / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר לכל תא Aggrewell ליום 1 (איור 1 ב &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף EBS שהוקם זה עתה (איור 1 ג &#39;) וצלחת אותם על צלחות מצופים ג&#39;לטין 0.1% 24 גם (EBS על 3 / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי DM כל 2-3 ימים עד להופעה של מכות אשכולות של שריר לב (15-30 יום). </li></ol></li></ol> 3. תרבויות 3D האוויר נוזליים של מכות אשכולות וסימון עם HNPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולנתח באופן ידני אשכולות של שריר לב פועם (1D איור), בדרך כלל מופיע אחרי 2-4 שבועות של תרבות, באמצעות פיפטה פסטר חד לחתוך מוארכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדת 4 מסנני PTFE לכל הכנס שיוצבו על צלחת 6 היטב (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של מדיום DM על גבי EACגם שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אחד אשכול גזור מכה על כל מסנן PTFE (איור 1E), 4/well המרבי, כלומר 24 מצרפים לכל צלחת (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית DM כל 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתייג את האשכולות, להסיר את מסנן PTFE מכיל מקבץ המכות ולשים אותו על 3.5 צלחת תחתית זכוכית סנטימטר (170 מיקרומטר עבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של HNP בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר למשך 30 דקות. </li></ol> 4. דימות אופטי שאינו ליניארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדגם. לאחר תיוג HNP (ראה שלב 3.6), להעביר או hEBs כל ההבחנה המוקדמת או אשכולות מכות לב (גזורים על מראה התכווצות) במסנני PTFE על צלחת זכוכית תחתונה עבה 170 מיקרומטר תואמת את מרחק העבודה של מטרות צמצם מספריות גבוהות. לחלופין, להחיל ציפוי ישיר של מכות אשכולות לצלחת הזכוכית תחתונה מראש מצופה עם ג&#39;לטין .0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות לכל אחד ב-מיקרוסקופ מצויד בדוגרים קאמריים להבטיח טמפרטורה יציבה, לחות ו-CO 2 שליטה על פני תקופות זמן ארוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בדיקה ראשונית, תמונת המדגם באמצעות הדמיה רחב בתחום תחת תאורת אור הלבנה כדי לזהות מבנים של עניין בתוך EBS הבדיל או אשכולות מכות פעילים שייבחרו לחקירות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם autofluorescence התא מNADH וSH מHNPs צריכים להיות שנרכשו בו זמנית, שנקבע באורך גל קצר יותר עירור לייזר (כלומר 720 ננומטר) כדי להתאים את הספיגה המולקולרית. השתמש במסנן אחד צר להקה עוברת רפאים מרוכזים במחצית אורך גל העירור (כלומר, λ = 360 ± 10 ננומטר) כדי לזהות SH, ועוד אחד כדי לזהות autofluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית לבצע החלטה מהירה, נמוכה, סריקה תלת ממדית כדי לבנות מחדש את המורפולוגיה הכוללת של אשכול הלב ובחר מטוס תמונה בתוך צביר הנפח עם כמה HNP הגלויs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לשנות את אורך גל העירור באופן חופשי כדי להתאים הטוב ביותר תכונות אופטיות של המדגם או כדי למנוע photobleaching, נזק תמונה ותמונה עמוק יותר לתוך רקמות עם אורך גל IR (כלומר, ננומטר 790) ולהחליף את המסנן ההרמוני השני בהתאם (כלומר, ננומטר 395 ). לייעל את ההגדרות של דופק לייזר מראש המדחס באורך גל העבודה של בחירה על ידי למקסם את האות ההרמונית השנייה של HNPs הופקד על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח בזמן אמת התכווצויות אשכול לב, להגדיר את הסורק האופטי המיקרוסקופ במצב המהיר ביותר כגון מצב תהודה, המאפשר רכישה במהירות גבוהה של תמונות דו ממדיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ההגדרות כפשרה הטובה ביותר בין ניגוד תמונה ומהירות רכישה, כגון: <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיצוע סריקה: 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן להתעכב פיקסל: 0.1 μsec </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דרג תמונה: 3.75 מסגרות לשנייה (fps) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוח הלייזר מותאם לים במקום מוקדize ומהירות סריקה. 50 mW (נמדד בכניסה לאובייקטיבית) הוא ערך אופייני ל0.1 μsec זמן להתעכב פיקסל ומטרת התכנית APO 20X NA 0.75 שימור כדאיות תא. </li></ol> 5. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך כיול צירי. בחר HNP יחיד שהופקד על מצע חשוף. התאם את המיקוד (כלומר העמדה צירית של nanoparticle) למקסם את עוצמת SH. להשתנות באופן מבוקר את העמדה צירית של הבמה מיקרוסקופ כדי לקבל עקומת הכיול הנוגעת בעוצמה SH כפונקציה של HNP לקזז ממישור המוקד. הפלט של הליך כיול זה למטרת התכנית APO 20X NA 0.75 מדווח באיור 4C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר HNPs נוכח בכל מסגרות הווידאו ולקבוע תנועות תקופתיות שלהם. יכול להיות אוטומטי הליך זה בקלות, למשל על ידי קוד מותאם אישית מחפש נקודות מרבי אות בעוצמה באזור מוגדר של עניין והקושר אותם בין מסגרות שונות (קוד דוגמא הכתוב ב-Matlab R2009 b באמצעות הפונקציה &#39;אבזרי אזור &quot;של ארגז הכלים עיבוד תמונה מוצג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הכימות של התקות, out-of-מטוס הקשורים HNPs שאינה ברציפות למעקב נע לאורך הציר האופטי, על ידי המרת מודולציות עוצמתם לאורך מסגרות שונות לעקירה צירית באמצעות עקומת הכיול שהוקמה בשלב 5.1. שים לב שהליך זה נותן גישה לתנועות צירית, אך לא ניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הכיוון המוחלט (כלפי מעלה או מטה). </li></ol>

<ol>
	<li>Bonacina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+Fe(IO3)3+nanocrystals+as+local+probes+for+nonlinear+microscopy.">Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy.</a> Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+nanowire+nonlinear+optical+probe.">Tunable nanowire nonlinear optical probe.</a> Nature. 447, 1098-1101 (2007).</li><li>Aufray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthesis+of+Nanosized+Niobium+Oxides+and+Lithium+Niobate+Particles+and+Their+Characterization+by+XPS+Analysis.">New Synthesis of Nanosized Niobium Oxides and Lithium Niobate Particles and Their Characterization by XPS Analysis.</a> J Nanosci Nanotechno. 9, 4780-4785 (2009).</li><li>Hsieh, C. L., Grange, R., Pu, Y., Psaltis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+harmonic+holographic+microcopy+using+nanoparticles+as+probes+for+cell+imaging.">Three-dimensional harmonic holographic microcopy using nanoparticles as probes for cell imaging.</a> Opt Express. 17, 2880-2891 (2009).</li><li>Pantazis, P., Maloney, J., Wu, D., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+harmonic+generating+(SHG)+nanoprobes+for+in+vivo+imaging.">Second harmonic generating (SHG) nanoprobes for in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14535-14540 (2010).</li><li>Baumner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evanescent-field-induced+second+harmonic+generation+by+noncentrosymmetric+nanoparticles.">Evanescent-field-induced second harmonic generation by noncentrosymmetric nanoparticles.</a> Opt Express. 18, 23218-23225 (2010).</li><li>Le Xuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostable+second-harmonic+generation+from+a+single+KTiOPO4+nanocrystal+for+nonlinear+microscopy.">Photostable second-harmonic generation from a single KTiOPO4 nanocrystal for nonlinear microscopy.</a> Small. 4, 1332-1336 (2008).</li><li>Sandeau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocused+imaging+of+second+harmonic+generation+from+a+single+nanocrystal.">Defocused imaging of second harmonic generation from a single nanocrystal.</a> Opt Express. 15, 16051-16060 (2007).</li><li>Johnson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field+imaging+of+nonlinear+optical+mixing+in+single+zinc+oxide+nanowires.">Near-field imaging of nonlinear optical mixing in single zinc oxide nanowires.</a> Nano Lett. 2, 279-283 (2002).</li><li>Kachynski, A. V., Kuzmin, A. N., Nyk, M., Roy, I., Prasad, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+nanocrystals+for+nonresonant+nonlinear+optical+microscopy+in+biology+and+medicine.">Zinc oxide nanocrystals for nonresonant nonlinear optical microscopy in biology and medicine.</a> J Phys Chem C. 112, 10721-10724 (2008).</li><li>Bonacina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+Nanomedecine:+Harmonic+Nanoparticles+toward+Targeted+Diagnosis+and+Therapy.">Nonlinear Nanomedecine: Harmonic Nanoparticles toward Targeted Diagnosis and Therapy.</a> Mol Pharmaceut. 10, 783-792 (2013).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHG+nanoprobes:+advancing+harmonic+imaging+in+biology.">SHG nanoprobes: advancing harmonic imaging in biology.</a> Bioessays. 34, 351-360 (2012).</li><li>Campagnola, P. J., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-harmonic+imaging+microscopy+for+visualizing+biomolecular+arrays+in+cells,+tissues+and+organisms.">Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms.</a> Nat Biotechnol. 21, 1356-1360 (2003).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Photon+Laser+Scanning+Fluorescence+Microscopy.">2-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Magouroux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Speed+Tracking+of+Murine+Cardiac+Stem+Cells+by+Harmonic+Nanodoublers.">High-Speed Tracking of Murine Cardiac Stem Cells by Harmonic Nanodoublers.</a> Small. 8, 2752-2756 (2012).</li><li>Staedler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonic+Nanocrystals+for+Biolabeling:+A+Survey+of+Optical+Properties+and+Biocompatibility.">Harmonic Nanocrystals for Biolabeling: A Survey of Optical Properties and Biocompatibility.</a> Acs Nano. 6, 2542-2549 (2012).</li><li>Extermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodoublers+as+deep+imaging+markers+for+multi-photon+microscopy.">Nanodoublers as deep imaging markers for multi-photon microscopy.</a> Optics Express. 17, 15342-15349 (2009).</li><li>Chen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wavelength+dependent+damage+in+biological+multi-photon+confocal+microscopy:+A+micro-spectroscopic+comparison+between+femtosecond+Ti+:+sapphire+and+Cr+:+forsterite+laser+sources.">Wavelength dependent damage in biological multi-photon confocal microscopy: A micro-spectroscopic comparison between femtosecond Ti : sapphire and Cr : forsterite laser sources.</a> Opt. Quantum Electron. 34, 1251-1266 (2002).</li><li>Ferreira, L., Karp, J. M., Nobre, L., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+opportunities:+The+use+of+Nanotechnologies+to+manipulate+and+track+stem+cells.">New opportunities: The use of Nanotechnologies to manipulate and track stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 136-146 (2008).</li><li>Kaur, S., Singhal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+nano+meets+stem:+The+impact+of+nanotechnology+in+stem+cell+biology.">When nano meets stem: The impact of nanotechnology in stem cell biology.</a> J Biosci Bioeng. 113, 1-4 (2012).</li><li>Hong, H., Yang, Y. N., Zhang, Y., Cai, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Invasive+Imaging+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Non-Invasive Imaging of Human Embryonic Stem Cells.</a> Curr Pharm Biotechno. 11, 685-692 (2010).</li><li>Tumbar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+epithelial+stem+cell+niche+in+skin.">Defining the epithelial stem cell niche in skin.</a> Science. 303, 359-363 (2004).</li><li>Shah, B. S., Clark, P. A., Moioli, E. K., Stroscio, M. A., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+mesenchymal+stem+cells+by+bioconjugated+quantum+dots.">Labeling of mesenchymal stem cells by bioconjugated quantum dots.</a> Nano Lett. 7, 3071-3079 (2007).</li><li>Zimmer, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+series+of+small+indium+arsenide-zinc+selenide+core-shell+nanocrystals+and+their+application+to+in+vivo+imaging.">Size series of small indium arsenide-zinc selenide core-shell nanocrystals and their application to in vivo imaging.</a> J Am Chem Soc. 128, 2526-2527 (2006).</li><li>Vallee, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-based+cardiopatches+improve+cardiac+function+in+infarcted+rats.">Embryonic stem cell-based cardiopatches improve cardiac function in infarcted rats.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 248-260 (2012).</li><li>Idris, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+transplanted+cells+in+live+animal+using+upconversion+fluorescent+nanoparticles.">Tracking transplanted cells in live animal using upconversion fluorescent nanoparticles.</a> Biomaterials. 30, 5104-5113 (2009).</li><li>Haase, M., Schafer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upconverting+nanoparticles.">Upconverting nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 5808-5829 (2011).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Upconversion+Nanoparticles+for+Dual-Modal+Imaging-Guided+Stem+Cell+Therapy+under+Remote+Magnetic+Control.">Multifunctional Upconversion Nanoparticles for Dual-Modal Imaging-Guided Stem Cell Therapy under Remote Magnetic Control.</a> Adv Funct Mater. 23, 272-280 (2013).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two-photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two-photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

היישום של הננוטכנולוגיה למחקר בתאי גזע הוא תחום חדש יחסית, אך המתרחב במהירות. כפי שציין במאמרי ביקורת שונים על הנושא, השימוש של חלקיקים ניתן ליישם כדי לבצע משימות מחקר שונות, החל מתא מעקב (הן במבחנה in vivo), למשלוח תאיים של חלבונים והגנים, לפחות לא ביצירת סביבות סלול...

מערכות מיקרוסקופיה קוי, הודות לשלוש יכולות חתכם הטבועות ממדיות, יש יותר ויותר שהפעילו את הביקוש לfluorophores צילום יציב עם להקות קליטת שני פוטונים באינפרא אדום הקרוב. רק בשנים האחרונות, כדי להשלים את הפיתוח של תוויות המבוססת על הקרינה (צבעים, נקודות קוונטיות, חלקיקי המרה-up), המתודולוגיה הדמיה שונה כבר מנצלת את השימוש במשפחה חדשה של חלקיקי מיסוד קוי כתוויות, כלומר חלקיקים הרמוניים (HNPs) אשר פותחו במיוחד עבור מיקרוסקופ רב פוטון. תוויות אלה, המבוססים על גבישי noncentrosymmetric אורגניים, להפעיל ניגוד אופטי שהניבו SH של תדר העירור: למשל על ידי המרת חלק קטן של אור עירור פעם הקרוב אינפרא אדום (λ = 800 ננומטר) לאור כחול גלוי (λ / 2 = 400 ננומטר) . כמה מחברים בתקופה האחרונה בחנו חומרים שונים, ובכלל זה iodate ברזל Fe (IO <sub&gt; 3) 3 1, niobate אשלגן (KNbO 3) 2, niobate ליתיום (Linbo 3) 3, titanate בריום (BaTiO 3) 4,5, אשלגן זרחה titanyl (KTiOPO4, KTP) 6-8, ותחמוצת אבץ (ZnO 5,9,10). בהשוואה לבדיקות ניאון, HNPs יש שורה של נכסים אטרקטיביים, כגון עדר מוחלט של הלבנת ומהבהבת, להקות פליטה צרות, tunability עירור באורך הגל (מסגול לאינפרא אדום), יכולת שליפת אורינטציה, ותגובה אופטית קוהרנטית. מאפיינים ייחודיים אלה כבר הסבירו לאחרונה בשני מאמרי סקירה מקיפים 11,12. האפשרות לעבוד באזור רפאים אינפרא אדום, אשר מגדיל את עומק הדמיה ידי מזעור פיזור וקליטה, גם באופן דרסטי מגבילה מדגם השפלה תמונה 13,14. יתר על כן, את אות צילום יציב לאין שיעור ערבות HNPs עושה בדיקות האידיאליות למעקב סלולרי לטווח ארוך, שבו אניזה מושך במיוחד ליישומי רפואת רגנרטיבית 15. בניסוי דמיינו את זה, פרטים בפרוטוקול ניתנים לתיוג במבחנה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) עם HNPs unfunctionalized. הסינתזה והכנת תרחיפים colloidal היא מפורטת בפרסום קודם ובהפניות בי 16 והוא מעבר להיקף של עבודה זו. מתודולוגיות לחקירת hESC ידי מיקרוסקופית רב פוטון והבידול שלהם בצבירי לב (נשמרו כתרבויות אוויר נוזלי לטווח ארוך) מוצגות. ניתן לתת ESC האנושי להבחין בתוך גוף שנקרא embryoid (EBS) בשתי דרכים שונות, או על ידי היווצרות EB של שברי מושבה בהשעיה או, לחלופין, נאלצו צבירה של תאים בודדים לEBS באמצעות צלחת Aggrewell, כפי שמודגם באיור 1 א fac מסננים נקבוביים. Culturing להכות אשכולות של תאי לב על polytetrafluoroethylene (PTFE)ilitates התחזוקה ארוך הטווח שלהם למחקרים נוספים (למשל מדידות אלקטרו של פוטנציאל פעולה). מקור העירור של הסריקה מיקרוסקופ צריך להיות מסוגל לספק פולסים ultrashort (עם משך פעימה קטן יותר מאשר 300 fsec במדגם) על מנת להגיע לשיא הכוח דרוש כדי לבצע הדמיה הרמונית שנייה של HNPs. לדוגמא, fsec-המקור הנפוץ ביותר המשמש להדמיה הוא Ti מתכונן: לייזרי ספיר. לחלופין, יכולים להיות מועסקים לייזרים מהירים אחרים, ליון ארביום למשל 17, forsterite כרום 18 או טי: מתנדים פרמטרים אופטיים אינפרא אדום ספיר שאוב. מיקרוסקופ יכול להיות מצויד במטרה עם עדיפות צמצם מספרי גבוה למדי. מאוד חשוב, לפני מדידות, ובכל פעם המטרה מוחלפת, הוא חובה כדי למזער את הווה הפיזור בהגדרה (עדשות) על ידי אופטימיזציה של ההגדרות של דופק לייזר מראש המדחס בעבודהאורך גל של בחירה. הליך זה, שפורט בפרוטוקול, מבטיח כי דופק הלייזר הוא קרוב ככל האפשר ללהפוך לתקופה מוגבלת (כלומר כקצר ביותר אפשרי) במישור המוקד ומגדיל את התגובה קוי מדגם. המטרה של ניתוח התמונה שתואר בסוף הפרוטוקול היא לזהות ולעקוב אחר תנועות 3D HNPs קשורים ההתכווצויות קצביות של מכות אשכולות לב. חלקיקי מעקב במטוס התמונה הוא פשוט הבין שעל ידי זיהוי עמדותיהם במסגרות סרט רצופים. כדי לחלץ מידע על תנועה צירית, כיול מוקדם של תגובה בעוצמה לא קוי כפונקציה של תזוזה צירית הוא חובה. שים לב שעבור מדידות לטווח ארוך, שליטת interferometric פעילה של מדגם עמדה צירית נדרש כדי לשמור על תוקפו של עקום הכיול בנוכחות מרחף תרמית ו / או מכאני. HNPs משמש כאן לטראקתאי דואר פועמים בתוך אגרגטים מבוססים על תחמוצת אשלגן niobate (KNbO 3), אבל ננו קוי זמין אחר נסקרים בפירוט בעבודה של טאדלר אח&#39; 16. היעילות האופטית קוי של רוב ננו נחקר עד כה הן מאוד דומה. הבחירה לKNbO 3 הונעה בעיקרו על ידי היציבות טובה של פתרון colloidal וההתאמה הביולוגית הטוב שלה, בדקה בכמה שורות תאים אנושיות אפילו בריכוז גבוה למדי ופעמים אקספוזיציה ארוכות 16. לאור החידוש של nanomaterial מועסק לעבודה זו, המאפיינים העיקריים של HNPs בהשוואה לביו סמני ניאון / ניאון מוצגים באנימצית מחשב וידאו קצרה מקורית הבינה המחברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1008">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Microscope Incubator</td>
			<td style="width:231px;">OKO LAB</td>
			<td style="width:205px;">UNO package (top stage)</td>
			<td style="width:343px;">&#160;37&#176;C, 5% CO2, moisturized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="2" style="height:64px;width:231px;">Multiphoton microscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td rowspan="2" style="width:205px;">AR1-MP</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:343px;">Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Filters SHG and autofluorescence</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Semrock</td>
			<td style="width:205px;">FF01-360/12-25</td>
			<td rowspan="3" style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FF01-395/11-25&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">FF02-485/20-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:231px;">Microscope objectives</td>
			<td rowspan="3" style="width:231px;">Nikon</td>
			<td style="width:205px;">CFI Plan Fluor 10x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.30, WD 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">CFI Plan Apo 20x</td>
			<td style="width:343px;">NA 0.75, WD 1.0 mm, VC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">CFI Apo 40x</td>
			<td style="width:343px;">NA 1.25, WD 0.18mm &#955;S, Nano-Crystal Coat</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Rhock inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">Y-27632</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Knockout DMEM</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10829</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Knockout Serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">10828</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">MEM Non-Essential Amino Acids&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">1140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">L-glutamine 200mM&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">25030</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">15140</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">&#946;-mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">M7522</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Collagenase IV&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">17104-019</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Roller scraper tool&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemPro EZPassage, Invitrogen</td>
			<td style="width:205px;">23181-010</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">StemPro Accutase&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:205px;">S11105-01</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Aggrewell system&#160;</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:205px;">27845</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Hyclone serum&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:205px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Gelatin</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:205px;">G9391</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">6-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:205px;">353046</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">24-well plates&#160;</td>
			<td style="width:231px;">Nunclon</td>
			<td style="width:205px;">142475</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters</td>
			<td style="width:231px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:205px;">NA76/25</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:231px;">Inserts</td>
			<td style="width:231px;">Millipore</td>
			<td style="width:205px;">PICM03050</td>
			<td style="width:343px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harmonic nanoparticles for regenerative research

בניסוי דמיינו את זה, פרטים בפרוטוקול ניתנים לתיוג במבחנה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) עם חלקיקי דור שני הרמוני (HNPs). האחרונים הם משפחה חדשה של בדיקות שהוכנסו לאחרונה לתיוג דגימות ביולוגיות להדמיה רב פוטון. HNPs מסוגל להכפיל את התדירות של אור העירור על ידי התהליך האופטי קוי של דור השני הרמוני עם אין הגבלה על אורך גל העירור. רב פוטון מתודולוגיות לבידול hESC לאשכולות לב (נשמרו כתרבויות אוויר נוזלי לטווח ארוך) המבוסס מוצגים בפירוט. בפרט, ראיות על איך למקסם את הפליטה האינטנסיבית השנייה ההרמונית (SH) של HNPs המבודד במהלך ניטור 3D של רקמת לב פועם ב3D מוצגת. הניתוח של תמונות וכתוצאה מכך לאחזר דפוסי תזוזת 3D הוא גם מפורט.

לפני הערכת פעילות המכות על ידי ההדמיה confocal, אפיון מדוקדק של התגובה האופטית לא לינארית של מסנני PTFE בוצע, לבד או בנוכחות HNPs בריכוז גבוה (1 מ&quot;ג / מיליליטר). הוא הבטיח כי: א) הקרינה נרגשת שני הפוטונים המצע החשוף היא חלשה מאוד ולא יכולה למנוע מדידת הדגימות ביולוגיות הרלוונט...

Watch this Scientific Journal Video about Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research at JoVE.com

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

פרטי פרוטוקול ניתנים לתאים במבחנה תיוג גזע עובריים אנושיים עם חלקיקים ליצירת הרמוניים שני. מתודולוגיות לחקירת hESC ידי מיקרוסקופית רב פוטון והבידול שלהם בצבירי לב גם מוצגות.

הרמוני חלקיקים למחקר הרגנרציה

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

harmonic-nanoparticles-for-regenerative-research

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.2K Views.  University of Geneva.  פרטי פרוטוקול ניתנים לתאים במבחנה תיוג גזע עובריים אנושיים עם חלקיקים ליצירת הרמוניים שני. מתודולוגיות לחקירת hESC ידי מיקרוסקופית רב פוטון והבידול שלהם בצבירי לב גם מוצגות. 

Video: Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively for tissue regeneration, a number of variables must be taken into account. These variables include: the total volume and surface area of the implantation site, the mechanical properties of the tissue and the tissue microenvironment, which includes the amount of vascularization and the components of the extracellular matrix. Therefore, the materials being used to deliver these cells must be biocompatible with a defined chemical composition while maintaining a mechanical strength that mimics the host tissue. These materials must also be permeable to oxygen and nutrients to provide a favorable microenvironment for cells to attach and proliferate. Chitosan, a cationic polysaccharide with excellent biocompatibility, can be easily chemically modified and has a high affinity to bind with in vivo macromolecules4-5. Chitosan mimics the glycosaminoglycan portion of the extracellular matrix, enabling it to function as a substrate for cell adhesion, migration and proliferation. In this study we utilize chitosan in the form of microspheres to deliver adipose-derived stem cells (ASC) into a collagen based three-dimensional scaffold6. An ideal cell-to-microsphere ratio was determined with respect to incubation time and cell density to achieve maximum number of cells that could be loaded. Once ASC are seeded onto the chitosan microspheres (CSM), they are embedded in a collagen scaffold and can be maintained in culture for extended periods. In summary, this study provides a method to precisely deliver stem cells within a three dimensional biomaterial scaffold.

A major hurdle in current stem cell therapies is determining the most effective method to deliver these cells to host tissues. Here, we describe a chitosan-based delivery method that is efficient and simple in approach, while allowing adipose-derived stem cells to maintain their multipotency.

בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.2. Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart3. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact4. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

In these studies, we provide methodology for novel, neonatal, murine cardiac scaffolds for use in regenerative studies.

Neonatal לב פיגומים: מטריצות Novel ללימודי הרגנרציה

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

ייצור של חלקיקי מתכת על ידי פעימה לייזר ablation בנוזלים: כלי לחקר מאפיינים אנטיבקטריאליים של חלקיקים

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20 mJ, 1 PS Yb: YAG דיסק דק מגבר משובי

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues תלת-ממד עבור טיפול בזריקות רגנרטיבית ותפוקה גבוהה והתרופות הקרנה

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.