אנו מודים לכל חברי Lenne ומעבדות ברטרנד, בפרט אוליבייה בלאן לפיתוח תוכנה וג&#39;רמי Capoulade לדיון. אנו מודים גם למתקן PICsL-IBDM ההדמיה, בפרט קלוד מורטי ורייס Detailleur לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מATIP CNRS (לפ-FL ו-VB), Labex להודיע ​​מענק (לפ-FL ו-VB) ומענק מSanofi-Aventis (לVB). אנו מכירים בתשתית צרפת-bioimaging נתמכת על ידי Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (ANR-10-InSb-04-01, מכנים &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. הגדרת גיליון האור ונתיב איתור איור 1 נותן תכנית כללית של ההתקנה האופטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ולתקן את המיקרוסקופ והלייזרים על השולחן האופטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משלב לייזרים 488 ננומטר, 561 ננומטר וננומטר 405 עם מראות dichroic המתאימות. אחרי מראות dichroic, הלייזרים צריכים להיות דווקא לשתף מיושרים. שים לב כי הבחירה של אורכי גל הלייזר, מראות dichroic, ומסננים אופטיים נקבעת מספקטרום הספיגה של תוויות ניאון הספציפיות המשמשות בניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מסנן אקוסטי האופטי מתכונן (AOTF). השתמש בגיליון הבדיקה המסופק על ידי הספק כדי להתאים את התדירות והעצמה של AOTF. כאשר מיושר היטב, על 90% מכוח הלייזר מועברים בכוונון מרבי, כפי שנמדדו על ידי powermeter. שים לב שחלק הלייזרים ניתן לשלוט באופן מלא על ידי תוכנה, אשר יכול להפוך את AOTF מיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ולתקןטלסקופ. שים לב שהטלסקופ מורכב משתי עדשות המרחיבות את הקרן לרוחב שווה או גדול יותר מהקוטר של הצמצם האחורי של העדשה האובייקטיבית התאורה. העדשה עם אורך המוקד הקטן ביותר צריכה לבוא קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום, ליישר ולתקן את פריסקופ להביא כלפי מעלה הנתיב האופטי קרוב יותר לצמצם האחורי של העדשה הגלילית. שים לב ששתי המראות של פריסקופ הם רכובים באופן שהציר הארוך שלהם מנחית על הנטייה של המראה על מנת לשקף את הקרן הרחיבה באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העדשה הגלילית בסמוך ליציאת פריסקופ. שים לב שהעדשה הגלילית מתמקדת הקרן בכיוון אחד ומשאירה אותו collimated בכיוון האחר, וכך יוצר גיליון אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולמקד את גיליון אור וכתוצאה מכך על ידי שימוש בעדשה אובייקטיבית התאורה. שים לב שנקודת המוקד של התמונה אובייקטיבי התאורה צריכה לחפוף עם מוקד האובייקט של מטרת זיהוי. להקרין את הקרןעל מסך (למשל קיר) במרחקים ארוכים. הזז את מטרת התאורה לאורך ציר אלומת התאורה להשיג בקווי המתאר החדים המסך של גיליון האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הקו מרובע (405/488/561/638) פליטה לסנן במקום שמורות במיקרוסקופ (הקובייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את המצלמה EMCCD בנמל פלט מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את שלב התרגום הידני הראשון על הבמה מיקרוסקופ על ידי ברגים בחורים שנקדחו בבמת מיקרוסקופ. שים לב שקצה הבמה התרגום צריך להיות ממוקם בכ -2 ס&quot;מ ממרכז הבמה מיקרוסקופ, כך שקובט מרוכז מתחת לעדשת מטרת זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את שלב התרגום הידני השני על הראשון. הכיוונים של שני שלבים צריכים להיות בניצב (תרגומי X ו-Y). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את השלב פיזואלקטריים Z בחלק העליון של שני השלבים הקודמים. שים לב ששלב ממונע יכול לשמש במקומו של השלב פיזואלקטריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן holde קובטr (ראה איור 2) בחלק העליון של השלבים. קובט יהיה ובכך להיות ממוקם בצומת של דרך ההארה ודרך זיהוי, שהם ניצבים זה לזה. </li></ol> 2. בדיקת גיליון האור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא קובט זכוכית עם פתרון ניאון, ולמקם אותו על בעל המדגם בצומת של שני נתיבים אופטיים. גיליון האור וכך גלוי לעין. זה חייב להיות אופקי, וסימטרי / מרוכז ביחס לעדשת מטרת זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העדשה הגלילית ולרכוש תמונה כדי למדוד את העובי של גיליון האור. שים לב שהעובי של גיליון האור תלוי בצמצם המספרי (NA) של העדשה האובייקטיבית התאורה (כ 3-4 מיקרומטר לNA = 0.3). שים לב שעבור עדשה נתון, העובי של אור גיליון יכול להיות מוגבר על ידי הקטנת הגודל של הקרן נכנסת בגב הצמצם עם שסע. שימו לב שזעיר מניאון יכול לשמש כדי למדוד את הגרזןרזולוציה ial ורוחב של מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את העדשה הגלילית לפני תחילת הניסוי. </li></ol> 3. ההרכבה של ג elegans עוברים השלבים הבאים הם בתמונה באיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעט סימון יהלומים כדי לחתוך חתיכת זכוכית שקופית של מ&quot;מ 10 x 20 x 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5% bacto-אגר במים, להרתיח אותו ולתחזק אותו בבלוק דוד ב60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פולי-L-ליזין בצד אחד של פיסת השקופית לחתוך, לאפשר לו להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית מיקרוסקופ על הספסל ולתקן את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים בסמוך פיסת השקופית לחתוך עם השקופית קבועה ולהוסיף טיפה של אגר נמסו בחלקו העליון. לסחוט את אגר באמצעות אחר שקופית מיקרוסקופ נקייה כדי לקבל משטח אגר דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר למשטח אגר להתייבש לפני הסרת השקופית העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את משטח אגר בצד של השקופית קבועה על מנת להשאיר עודף של כ 3 מ&quot;מ oאגר ו ולהסיר בעדינות את השקופית קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פולי-L-ליזין על אגר ולתת לו להתייבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים תולעים הרה להולדת במדיום M9 בזכוכית שעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את התולעים ברמה של הפות עם אזמל כדי לשחרר את העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת משקפת לזהות את העוברים בשלב של עניין ולאסוף אותם באמצעות פיפטה microcapillary. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים על חלק מאגר מצופה פולי-L-ליזין שבולט מחתיכת השקופיות לחתוך. מניחים את העוברים רק בסמוך לגבול של השקופית. אל תציב את העוברים בגבול של אגר, כי הם לא יהיו יציבים מספיק. הסר בעדינות את הנוזל כך שהעוברים ידבקו על שכבת פולי-L-ליזין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ליישר את העוברים, כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף לחתוך בצלחת פטרי פלסטיק ובעדינות להוסיף בינוני M9 כדי לכסות את השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק תחת משקפת שהביצים עדיין תקועות על אגר. </li&gt; </ol> 4. הקלטה של ג פיתוח elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את ההכנה הקודמת (שקופיות לחתוך, אגר בתוספת עוברים) בבעל המדגם ולמקם אותו בקובט. איור 4 מתאר את בעל תוצרת בית ואיור 5 מראה נוף של קובט בהקשר תצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את קובט על הבמה פיזואלקטריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את מיקומו של עובר עם תאורה בשדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת תוצרת בית השליטה AOTF, את המצלמה ואת הבמה פיזואלקטריים. שים לב שתוכנה חופשית, כגון micromanager, יכולה לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הקו והכוח (AOTF) הלייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום של גיליון האור באמצעות שלב 3 כיווני תמיכה העדשה הגלילית ועדשת התאורה. להזיז את הבמה יחד בכיוון לרוחב (X) כדי לקבל את האות הבהירה. התאם אז Z מיקום של גיליון האור, ואת מיקום האורך (Y) כדי להשיג הדואר האות הטוב ביותר יחס רעש. שים לב שהעמדה של מוקד גיליון האור ייתכן שתצטרך להיות מותאמת מעובר אחד למשנו כדי לתקן את ההבדלים באורכים נתיב אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת זמן לשגות תמונות, לבחור את זמן החשיפה, להשיג, זמן בין שתי תמונות, כמו גם את מספר התמונות שרכשו, ואת כוח הלייזר. לרכישה 2 צבע, בחר קו לייזר שני. שתי תמונות צבע נרכשות ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לרכוש מחסנית AZ, בחר גם את המרחק בין שתי פרוסות, והתחלה ואת סוף העמדות של פיזואלקטריים. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר התקנה קלה של מיקרוסקופיה גיליון אור לin vivo הדמיה של ג elegans עוברים. האלמנטים אופטיים הדרושים כדי ליצור וליישר את גיליון האור, כוללים לייזרים, הרחבה קרן, collimation ועדשות מיקוד, יכולים להיות מותקן בקלות על ספסל אופטי. בשילוב עם מיקרוסקופ זקוף לדרך האיתור והמצלמה, זה מספק פתרון פשוט להתקנה מיקרוסקופ גיליון אור. גיאומטריה זו הופכת את הסביבה לדוגמא פשוטה. דגימת החיים ממוקמת בקובט זכוכית, המוחזקת, מיקומו ועבר על ידי קבוצה קטנה של חתיכות מכאניות. מיקרוסקופיה תאורת גיליון היא טכניקת שדה רחבה עם חתך יכולת, תנועה היחידה ציר יחיד ממונעות נדרש להדמית 3D. זה מגביל את הדרישה של סנכרון לאלמנט סריקה בודד ומאפשר פיתוח תוכנה. לעומת 6 iSPIM geomet הזקוף שלנור&quot;י מאפשר השימוש בעדשה אובייקטיבית NA גבוהה לצורך זיהוי. בהשוואה להגדרות SPIM עם עדשות אובייקטיביות במישור האופקי ההרכבה של מדגם וההדמיה מסדרה של עוברים הן יותר קלה. בסך הכל, את היישום של טכניקה זו הוא פשוט וניתן להשיג עם מומחיות קטנה בתחום האופטיקה. זוהי אלטרנטיבה זולה יותר למיקרוסקופי confocal עם היתרונות של מהירות גבוהה יותר וphototoxicity אבל חסרון של רזולוציה צירית נמוכה מופחתים. אנחנו גם פיתחנו דרך קלה ולשעתק לעלות ג עוברי elegans לin vivo הדמיה באמצעות מערכת זו. הליך ההרכבה הוא מהיר (15 דקות) והוא מתאים לניסויים יומיומיים. לג הדמיה elegans, היתרונות של ההתקנה הפשוטה הזה לפחות שני קפלים: (i) בתחום ההדמיה טוטו אפשרית ללא סיבוב ובכך שחזור 3D הוא פשוט; (Ii) הרכבת מדגם קלה ועוברים מרובים יכולים להיות צילמו ברצףבאותה השקופית. הראינו דוגמאות של זמן לשגות סרטים עם רזולוציה של זמן מספיק כדי לבחון חלוקות תא ושינויי צורת תא. כוחה של מיקרוסקופיה גיליון אור ללמוד ג פיתוח elegans יש גם מאויר לאחרונה על ידי אחרים 6, 7, 8. לכן, טכניקה זו תהיה שימושית מאוד ללמוד המורפוגנזה ודפוסים של ג עובר elegans. מערכת זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההתפתחות של אורגניזמים מודל אחרים? חשוב להכיר בכך שהיישום של מיקרוסקופיה תאורת גיליון לאורגניזם קטן ושקוף כמו ג elegans הוא פחות חמור משל אורגניזמים גדולים יותר, כמו עוברי דרוזופילה. בהדמית טוטו של דרוזופילה בדרך כלל דורש סיבוב ושחזורים רב להציג 9, 10. עירור משני צדדים עם עדשות אובייקטיביות עירור קוליניאריות יכולים גם הפחית את תופעות הצל שנגרמו על ידי attenuatיון של 11 אור. עם זאת, ההגדרה שהוצגה כאן היא עדיין מותאמת לצד תמונה אחד מעוברי דרוזופילה, עם הלבנת נמוכה וphotoxicity הנמוך. גם הגדרה זו יכולה להיות שימושית לעוברי תמונה קטנים ושקופים כגון ascidians או דג הזברה.

היווצרות ועיצובה של האורגניזם כרוך תנועות תא, שינויים בצורת תא, חלוקת תא והתמיינות תאים. הבנת ההתקדמות ותיאום של תהליכים אלה דורשים כלי הדמיה מהירים עם יכולת תלת ממדים ורזולוציה subcellular. בין הטכניקות עם in vivo יכולות הדמיה אלה, מיקרוסקופיה תאורת גיליון אור הנקראת גם מיקרוסקופיה יחידה / תאורת מטוס סלקטיבית יש את היתרון הייחודי של הפקת אפקטים נמוכים phototoxic ונמוך photobleaching 1,2. במיקרוסקופיה תאורת גיליון, המדגם הוא מואר מהצד בגיליון אור, אשר מבצע חתך האופטי. נתיב ההארה ואת נתיב הגילוי הוא ניצבים זה לזה וגיליון האור מיושר יעלה בקנה אחד עם מטוס מוקד האובייקט של העדשה האובייקטיבית זיהוי. המדגם ממוקם בצומת של שני נתיבים,nd ניתן להעביר לאורך ציר זיהוי כדי לאפשר הדמיה 3D. רק המטוס של עניין הוא מואר ואת כל הנקודות של המטוס הזה מתגלות באותו הזמן. זה מגדיל באופן משמעותי את מהירות הרכישה ומפחית photobleaching כמו גם phototoxicity בהשוואה למיקרוסקופיה confocal 3. למעשה, מיקרוסקופיה תאורת גיליון היא קלה להתקנה וalign: עבור שתי הדמיה ממדית, אין סריקה היא הכרחית לא לחלק זיהוי, ולא לחלק התאורה; כטכניקת שדה רחב עם חתך יכולת, ניתן לקבל הדמיה תלת ממדית על ידי תנועת ציר יחידה של הבמה מחזיקה את המדגם. כאן אנו מציגים את הקמת מיקרוסקופ פשוט אור גיליון ויישומה בתחום הדמיה לטוטו של ג elegans עוברים. ג elegans עוברים מתאימים גם לחיות בvivo הר&quot;יגינג בשל שקיפותם, שושלת בלתי משתנה וסטריאוטיפית תא עמדות 4,5. גיליון התקנת האור פותחה מבוססת על מיקרוסקופ הזקוף סטנדרטי לגילוי. הפרוטוקול המובא להלן מפרט כיצד לבנות וליישר את עירור מודול / נתיב, לבדוק ולאפיין את גיליון האור ולעלות את המדגם עבור ההדמיה 3D. הוא גם מספק דוגמאות של הזמן לשגות סרטים שנרכשו עם ההתקנה על זנים שונים להביע סמני ניאון.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detection</td></tr><tr><td>upright microscope</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&amp;nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD back illuminated</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Illumination</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&amp;nbsp;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td></tr><tr><td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>mirror</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lens 50 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescope 5X</td></tr><tr><td>lens 200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescope 5X</td></tr><tr><td>periscope</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>cylindrical lens f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sample</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Bectkton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% in water</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Aspiration tube (mouth pipette)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCL (5g/L)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM final)</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuvette holder</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Brice Detailleur&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>sample holder</td><td>HOME MADE</td><td></td><td>made by Claude Moretti&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>x stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coverslip 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>cut then in 10x20x1mm</td></tr><tr><td>piezo electric stage with amplifier/controller</td><td>PI</td><td>P-622.ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) home made software</td><td></td><td></td><td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&amp;egrave;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

טכניקות הדמיה phototoxic מהירה ונמוכות הן תנאי מוקדם כדי ללמוד את ההתפתחות של אורגניזמים בטוטו. מיקרוסקופיה מבוססת גיליון אור מפחיתה צילום הלבנה ואפקטי phototoxic השוואה למיקרוסקופיה confocal, תוך מתן תמונות 3D עם הרזולוציה subcellular. כאן אנו מציגים את תוכנית ההתקנה של מיקרוסקופ אור גיליון מבוסס, שמורכבת ממיקרוסקופ זקוף וקבוצה קטנה של אלמנטי אופטו מכאני עבור הדור של גיליון האור. הפרוטוקול מתאר כיצד לבנות, ליישר מיקרוסקופ ולאפיין את גיליון האור. בנוסף, הוא מפרט כיצד ליישם את השיטה להדמית טוטו של ג elegans עובר באמצעות תא תצפית פשוט. השיטה מאפשרת את לכידתו של הזמן לשגות סרטי שני צבעים 3D מעל כמה שעות של פיתוח. זה אמור להקל על המעקב של צורת תא, חלוקות תא וחלבונים מתויגים על פני תקופות זמן ארוכות.

שלושה ניסויי הקלטת הזמן לשגות 3D משלושה ג שונה elegans זנים להמחיש את סוג הנתונים שניתן להשיג באמצעות התקנת מיקרוסקופ אור הגיליון שתוארה לעיל. בדקנו כי בתנאים אלה עוברים לפתח במהירות רגילה ולשרוד את ההדמיה, עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים המצביעים על כך ההדמיה SPIM גורמת לרמות נמוכות phototoxicity רק בג elegans עוברי 6,7. הזן הראשון מבטא היסטון התמזגו GFP (zuIs178; stIs10024). הקלטה בוצעה במהלך 2 שעות עם ערימה של 20 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) נלקחה כל שניות 37. איור 6 ממחיש מישור אחד של המחסנית בנקודות זמן שונה. שני גרעיני interphasic (חץ) והכרומטין תמצית המיטוטי (ראש חץ) נראים בבירור. הזן השני מבטא טובולין התמזגו GFP (ruIs57) והיסטוןהתמזגו mCherry (itIs37; stIs10226). הקלטה בוצעה במהלך 16 דקות עם ערימה של 20 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) נלקחה כל שניות 105. איור 7 ממחיש מישורים שונים של המחסנית ונקודות זמן שונה. הסרט קשור 1 המציג 3D שחזורים ב3 נקודות זמן רצופות. במהלך החלוקה, ציר mitotic (הירוק) והכרומוזומים מרוכזים (אדום) נראה בבירור המאפשר המעקב של אוריינטציות חלוקת תאים במהלך התפתחות. הזן השלישי מבטא את אפוליפופרוטאין VIT-2 התמזגו GFP (pwIs23) וקרום מחויב mCherry (ltIs44). הקלטה בוצעה במהלך 25 דקות עם ערימה של 10 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) נלקחה כל 30 שניות. איור 8 ממחיש מישורים שונים של המחסנית ונקודות זמן שונה. התנועות מהירות של החלקיקים ליפופרוטאין בחלמון (ירוק) בתוך התאים יכולות להיות בקלותאחריו. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1: התקנה אופטית SPIM המורכב מיחידות התאורה וזיהוי, קדמית ונוף תחתית. ביחידת התאורה, הלייזרים בשילוב ידי מראות dichroic להיכנס AOTF, השולט בכוחו של כל אחד הלייזר באופן עצמאי. לאחר מכן, טלסקופ מגדיל את הגודל של הקרן על ידי פי 4 ופריסקופ מביא אותו לגובה של המיקרוסקופ. העדשה הגלילית מהווה את גיליון האור, אשר מקד מחדש על ידי מטרת ההארה. יחידת האיתור משולבת במיקרוסקופ הזקוף, והוא מורכב בעיקר על ידי עדשת האיתור, הסינון, עדשת הצינור וEMCCD. המדגם ממוקם בצומת שבין נתיבי התאורה וזיהוי. שלב פיזואלקטריים מאפשר התקות אנכיות (Z) של המדגם<html> לרכישת 3D. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2:. בעל קובט בעל כולל 3 פלטות אלומיניום ומוברג על הבמה פיזואלקטריים. קובט הזכוכית מוחזק על ידי אביב (באדום). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: התקנת פרוטוקול של ג עוברי elegans לניסויי SPIM. חתיכת הזכוכית לחתוך מצופה פולי-L-ליזין. כרית של אגר ממוקמת על המשטח המצופה. פולי-L-ליזין הוא הוסיף לאחר מכן על הכרית אגר. לבסוף, ג elegans עוברים מיושרים על משטח אגר מצופה פולי-L-ליזין. ther.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4: בעל מדגם. בעל מתאים לממדים הפנימיים של קובט הזכוכית. שתי מעיינות (באדום) מחזיקות שקופיות הזכוכית (מתוארות באיור 3). בעל זה ואז לשים בתוך קובט הזכוכית. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5:... בעל מדגם בהקשר תצפית עוברים הם משותקים בשקופית הזכוכית לפי הפרוטוקול סיכם באיור 3 השקופיות מוחזקות על ידי בעל המדגם המתואר באיור 4 בעל המדגם מוכנס בקובט הזכוכית, הוחזק על ידי המחזיק המתואר באיור 2. גיליון האור הוא אופקי ואניlluminates העוברים מהצד. עדשת מטרת זיהוי היא אנכית, מעל למדגם. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6: הקלטה של ג עובר elegans להביע היתוך היסטון :: ה-GFP תמונות מטוס יחידה של עובר מהונדס מבטא היסטון :: GFP היתוך (zuIs178; stIs10024) בנקודות זמן שונות תמונות שחולצו מן הקלטת הזמן לשגות 3D:.. ערימות עשויות 20 פרוסות ( מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר); זמן חשיפה לכל פרוסה: 30 אלפיות שניים; מרווח זמן בין ערימות: 37 שניות; זמן כולל רכישה: 2 שעות. חץ: גרעין interphasic, ראש חץ: הכרומטין המיטוטי מרוכז. בזמן t = 0 דקות העובר הוא בשלב 2 התאים ובt = 120 דקות העובר מכיל כ 70 תאים כצפוי על פי סעיף התפתחותית נורמליהשתין (שים לב שרק את התאים כלולים במישור אחד נראים בתמונות ולא בכל התאים של העובר). כוחה של תאורה היה 30 μW ב488 ננומטר (נמדד ביציאה של מטרת התאורה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7: הקלטה של ג עובר elegans להביע :: GFP היתוך טובולין והיסטון :: היתוך mCherry. תמונות שחולצו מן הקלטת הזמן לשגות 3D של ג עובר elegans להביע :: היתוך טובולין GFP (ruIs57) והיסטון :: היתוך mCherry (itIs37; stIs10226). תנאי הקלטה: רכישת ערימה של 20 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1מיקרומטר) בכל שנייה 105; סה&quot;כ זמן רכישה: 16 דקות; זמן חשיפה: 200 אלפיות שני לכל ערוץ. לוח תערוכות 10 פרוסות אותה הערימה. לוח ב &#39;מציג את אותו פרוסה כל שניות 210. כוחה של תאורה היה 30 μW ו300 μW, ל488 ו561 לייזרי ננומטר, בהתאמה (שנמדדו ביציאה של מטרת התאורה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8: הקלטה של ג עובר elegans להביע GFP היתוך VIT-2 :: וממוקד קרום mCherry. תמונות שחולצו מן הקלטת הזמן לשגות 3D של ג עובר elegans להביע היתוך VIT-2 :: GFP (PWIs23) וmCherry ממוקד קרום (ltIs44). תנאי הקלטה: רכישת ערימה של 10 פרוסות (מרחק בין פרוסות 1 מיקרומטר) כל 30 שניות; סך הכל זמן רכישה: 25 דקות; זמן חשיפה לכל ערוץ: 200 אלפיות שניים. לוח מציג 5 פרוסות הראשונות של אותה הערימה. לוח ב &#39;מציג את אותו פרוסה כל 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של מיקרוסקופ גיליון אור ויישומה לin vivo הדמיה של ג elegans עוברים.

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em&gt; בטוטו</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; פיתוח

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Views.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של מיקרוסקופ גיליון אור ויישומה לin vivo הדמיה של ג elegans עוברים. 

Video: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Developmental Biology

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscience

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually leave their food source and prefer to remain outside the bacterial lawn. The assay is an easy way to test the worms' ability to sense external or internal cues to properly respond to harmful conditions. Though a simple assay, counting is time consuming, particularly with multiple samples, and assay durations that span overnight are inconvenient for researchers. An imaging system that can image many plates over a long period is useful but costly. Here, we describe a smartphone-based imaging method to record lawn avoidance in C. elegans. The method requires only a smartphone and a light emitting diode (LED) light box, to serve as a transmitted light source. Using free time-lapse camera applications, each phone can image up to six plates, with sufficient sharpness and contrast to manually count worms outside the lawn. The resulting movies are processed into 10 s audio video interleave (AVI) files for every hourly time point, then cropped to show each single plate to make them more amenable for counting. This method is a cost-effective way for those looking to examine avoidance defects and can potentially be extended to other C. elegans assays.

Author Spotlight: שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay  

This article describes a simple, low-cost method of recording the lawn avoidance behavior of Caenorhabditis elegans, using readily available items such as a smartphone and a light emitting diode (LED) light box. We also provide a Python script to process the video file into a format more amenable for counting.

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

Behavior

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans has emerged as one of the best models for studying development. From an optical point of view, its size and transparent body make this nematode an ideal specimen for DIC (Differential Interference Contrast or Nomarski) microscopy. This article illustrates a protocol for growing C. elegans nematodes, preparing and mounting their embryos, performing 4D microscopy and cell lineage tracing. The method is based on multifocal time-lapse records of Nomarski images and analysis with specific software. This technique reveals embryonic developmental dynamics at the cellular level. Any embryonic defect in mutants, such as problems in spindle orientation, cell migration, apoptosis or cell fate specification, can be efficiently detected and scored. Virtually every single cell of the embryo can be followed up to the moment the embryo begins to move. Tracing the complete cell lineage of a C. elegans embryo by 4D DIC microscopy is laborious, but the use of specific software greatly facilitates this task. In addition, this technique is easy to implement in the lab. 4D microscopy is a versatile tool and opens the possibility of performing an unparalleled analysis of embryonic development.

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Here, we present a protocol for preparing and mounting Caenorhabditis elegans embryos, recording development under a 4D microscope and tracing cell lineage.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

שיטת הדמיה מבוססת סמארטפון עבור C. elegans Lawn Avoidance Assay

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans