עובר C.elegans לוקח בערך 13 שעות, והוא מנוטר בדרך כלל על ידי צילום עובר אחד בכל פעם. הפרוטוקול שלנו, לעומת זאת, מאפשר הדמיה בו זמנית זמן לשגות תלת מימד של 80 עד 100 עוברים. היכולת לאסוף נתונים עבור מספר רב של עוברי C.elegans מתפתחים פותחת מגוון חדש של ניסויים, כולל ניתוח כמותי של אירועים התפתחותיים ומסכים בקנה מידה גדול.
פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות כדי ללכוד תהליכים התפתחותיים שונים או עוברי תמונה המבטאים כל שילוב של סמנים ברקמות מעניינות. זה מאתגר לפזר כראוי את העוברים בתוך בארות. הם צריכים להיות קרובים זה לזה כדי לאפשר לכידה של עוברים מרובים לכל שדה מבלי להצתב במישורי Z שונים.
אנו ממליצים להשתמש בשני חוקרים לצורך ניתוח זה לצד זה, על קרח וחסימת בארות שאינן בשימוש. אנו גם להדגים כמה טריקים שימושיים להגדרת במהירות צלחת מבוים היטב 384 היטב. התחל על ידי איטום צלחת 384 היטב עם תחתית זכוכית עם נייר דבק PCR כדי להסוות בארות שאינן שימוש.
השתמש סכין גילוח או אזמל כדי לחתוך את רדיד כדי לחשוף תת קבוצה של בארות לשימוש. מוסיפים 70 מיקרוליטרים של TMHC טרי מוכן לתוך כל באר ולשמור את הצלחת על קרח. אל תכלול את שתי השורות החיצוניות של הלוח כדי למנוע אפקטי קצה.
להכנת מדגם מהיר, ניתוח זה לצד זה על ידי שני חוקרים מומלץ. כאשר כל הפתרון כבר מצופה, להשתמש פינצטה בסדר מיקרוסקופ ניתוח להעביר כ 10 מבוגרים gravid לתוך 150 microliters של פתרון TMHC קר כקרח בתוך שקופית דיכאון אחת לכל מצב. באמצעות פינצטה ואזמל, לנתח את התולעים כדי לשחרר את העוברים ולהעמיס פיפטה נימי משך לתוך שאפתן הפה.
השתמש פיפטה הפה להעביר את כל שני עד שמונה תאים בשלב עוברים לתוך בארות בודדות של הצלחת מוכנה ולבחון את הצלחת כדי לאשר כי אין אגרגטים נמצאים בתוך כל בארות. כאשר כל העוברים נאספו, ליישב את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולהשתמש לנגב ספוג אתנול כדי להסיר כל שאריות מתחתית הצלחת. מניחים את הצלחת במחזיק הצלחת של מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בסביבה מבוקרת טמפרטורה ולהשתמש במטרה 10X לבצע סריקה מראש של כל באר כדי לזהות שדות עם עוברים מתאימים.
בסיום הסריקה, עבור למטרה 60X, להתאים את מישור המוקד בכל נקודה לתמונה אחד עד ארבעה שדות ל הבאר ולרכוש 18 Z-sections בשני מרווחי מיקרומטר כל 20 דקות במשך 10 שעות. כאשר כל התמונות נרכשו, לבצע נמוך, סריקה שדה בהיר היטב, כ 20 עד 24 שעות לאחר תחילת הדמיה לילה כדי להעריך את הקטלניות העוברית. לחיתוך אוטומטי באמצעות קובץ הפעלה embryoCropUI, הורד תחילה את התוכנית זינודו ואת האשכים.
zip כדי לקבוע אם התוכנית מתפקדת כראוי על הפלטפורמה. לאחר ההורדה, לפתוח ולנווט כדי למצוא את קובץ ההפעלה embryoCropUI ולחץ פעמיים כדי להפעיל את התוכנית. בחרו 'פתח' לטעינת שדה התצוגה הדו-מימדי הספציפי הראשון לחיתוך.
בעת חיתוך סידרת TIFF עם ממדים מרובים, טען רק את התמונה הראשונה בסדרה שבתוכו. לאחר שכל התמונות נטענו, ציינו את פרמטרי ההדמיה, בחרו חיסור רקע ותיקון ההתשה, והגדירו את סדר איסוף התמונות ואת המיקרונים לפיקסל. לאחר מכן בחר הפעלה, ייווצר חיתוך חדש עם תווית של תיקיית משנה באותו נתיב שבו תיווצר התיקיה שלא נחתכה והגירסאות החתוכה יישמרו במיקום זה.
לפריטים חזותיים, הורד את התוסף הפתוח והמשולב MSV2 ImageJ ואת הוראות ממשק המשתמש הגרפי Zenodorepov2. docx מ Zenodo ולפתוח את התוסף ב- IMageJ. אתר את קווים 3 ו- 4 והקלט את המיקום שבו יאוחסנו תיקיות התמונות לאחר החיתוך.
שמות תיקיית התמונות של התנאים שיש לעבד והמזהה האלפאנומרי הייחודי עבור כל ניסוי בן לילה. לאחר הזנת כל המידע, לחץ על הפעל. יופיע חלון שי להפעיל בקשה לנווט לתיקיה החיצונית המכילה את תיקיות התמונות שנחתכה.
לאחר שנבחר חלון אחר יופיע אשר יאפשר מפרט של פרמטרי ההדמיה. לחץ על אישור. הקובץ המורכב יתחיל להתאסף.
כאשר נוצר ללא הפרדות צבע, סקור את הקבצים שנותרו פתוחים. כאשר תמונה בשילוב זני כתב מותאם אישית לספק readouts אינפורמטיבי עבור רוב האירועים ההתפתחותיים העיקריים. כולל מפרט סולפט, אינטרקלציה הגבית, מארז אפידרמיס, התארכות ונוירוגנזה.
24 שעות לאחר ההזרקה היא נקודת זמן אופטימלית להדמיה. נכון לזמן זה דלדול חלבון אימהי ועיכוב של ביטוי גנים זיגוטיים הם שניהם יעילים מניבים ייחודי, פנוטיפים חתימה מאוד להתרבות על פני קשת רחבה של גנים המעורבים מפרט סולפט ומורפוגנזה. חשוב להיות סבלניים במהלך שלבי הניתוח ובחירת העוברים.
מזעור הגושים ובחירת מישורי המוקד המתאימים חיוניים גם להבטחת נתונים באיכות גבוהה. הפרוטוקול שלנו יכול להתבצע עם מגוון רחב של זנים סמן פלואורסצנטי בשילוב עם RNAi או מוטציות. כלי העיבוד שלנו מאפשרים ניתוח נתונים יעיל, אוטומטי או ידני.
באמצעות הזנים, השיטות וה הכלים המתוארים כאן הקבוצה שלנו ביצעה מסך תוכן גבוה מבוסס RNAi המכוון לכ-2,000 גנים הדרושים להתפתחות עוברית. שיטות תפוקה גבוהות למחצה היו חיוניות לפרויקט זה.
