המחברים מבקשים להודות לתמיכה מקרן ריוחה סאלוד (Fondos FEDER) ומהשר הספרדי דה סיאנסיה, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). כריסטינה רומרו ארנדה ממומנת על ידי מלגה מה-AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. לגדל C. elegans על צלחות פטרי
<ol><li>הכינו צלחות NGM וזרעו אותן עם E. coli OP50 כמקור המזון (איור 1). לגדל ולתחזק את C. elegans כמתואר17. אחסן צלחות נזרעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.</li>
	<li>התאימו את הצלחות לטמפרטורה הרצויה לפני הוספת התולעים.<ol>
<li>כדי להעביר את התולעים, מוציאים נתח אגר מצלחת ישנה ומניחים אותו על צלחת טרייה.</li>
		<li>לחלופין, תפסו בעלי חיים בודדים עם קוטף תולעים סטרילי (חתיכה בקוטר 1 אינץ' של חוט פלטינה בעל 32 מדים עם קצה שטוח, המותקנת על קצה פיפטה של פסטר) והניחו אותן על הצלחת החדשה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לגדל את התולעים בטמפרטורה הרצויה.<ol>
<li>לגדל תולעי C. elegans בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה הסטנדרטית. עם זאת, כדי לנתח את הפיתוח של מוטנטים רגישים לתרמו, לבצע דגירה לילה, בדרך כלל ב 25 מעלות צלזיוס. התאם את משך והטמפרטורה של דגירה זו לפי הצורך, בהתאם למוטנט הספציפי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכינו את הקלטת המיקרוסקופיה הארבע-ממדית לפני הרכבת העוברים (איור 2)
<ol><li>הגדר את המיקרוסקופ ואת בקרות הטמפרטורה לפני הכנת העובר. C. elegans העוברים מתחלקים מהר מאוד. היו מוכנים להתחיל להקליט מיד לאחר הרכבת העוברים.</li>
	<li>התאם את טמפרטורת ההקלטה ל- 15 ° C, 20 ° C או 25 ° C.<ol>
<li>תעדו באופן שגרתי את העוברים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. תעדו מוטנטים רגישים לתרמו בטמפרטורה המגבילה כדי להראות את הפנוטיפים שלהם. הקלט בקרת WT (אם נעשתה בהכנה אחרת) באותה טמפרטורה כמו המוטנטים. הערה: עוברי WT מתפתחים מהר יותר ב-25 מעלות צלזיוס ואיטיים יותר ב-15 מעלות צלזיוס ללא הבדלים נוספים בשושלת התאים. מקם את המיקרוסקופים בחדר מבוקר טמפרטורה. שליטה נוספת על ידי קירור או חימום המגלשה רצויה מאוד. ניתן להשיג זאת על ידי זרימת מים בטמפרטורה מסוימת באמצעות טבעת מתכת סביב מטרת המיקרוסקופ והעיבוי. המטרה וההכנה נמצאים במגע ישיר דרך שמן הטבילה והעברת הטמפרטורה יעילה. מערכת זו מאפשרת שליטה מדויקת על טמפרטורת הרישום ועל ביצוע שינויי טמפרטורה במהלך התפתחות העובר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את פרמטרי הרשומה בתוכנת המיקרוסקופיה.<ol>
<li>להקלטה סטנדרטית של C. elegans (ללא סריקות פלואורסצנטיות), בחר: z-ערימות של 30 מישורי מוקד, במרחק של 1 מיקרון כל אחת. מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל z-stack. 1500 z-stacks (12.5 שעות שיא). הערה: ניתן להשתמש הן בתוכניות בקרה מסחריות והן בקוד פתוח של מיקרוסקופ כדי להגדיר זרימת עבודה זו ללכידת תמונות. עכשיו המיקרוסקופ מוכן להקליט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. להכין ולהרכיב את העוברים
<ol><li>הכינו כרית אגר דקה והומוגנית כצעד ראשון בהשגת תמונה יפה (איור 3).<ol>
<li>מכינים 50 מ"ל של תמיסת אגר של 4.5% במים שעברו דה-יוניזציה. מחממים לרתיחה במיקרוגל ויוצקים 0.5 – 1 מ"ל לתוך צינורות זכוכית 3 מ"ל.</li>
		<li>אטמו בזהירות את הצינורות עם סרט שעווה כדי למנוע ייבוש. צינורות אגר אטומים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד חודשיים.</li>
		<li>על ספסל המעבדה, יש בלוק חום ב 80 °C (80 °F) עם: מבחנה של ג'לי נפט טהור (מומס), עם מברשת צבע עדינה בפנים. מבחנה עם מים מזוקקים המכילים פיפטה של פסטר. הערה: זה מבטיח שכל החומרים הנדרשים יהיו חמים, והאגר לא יתמצק בתהליך הכנת הפד.</li>
		<li>הסירו את סרט השעווה מראש אחד מצינורות האגר, וחממו אותו בזהירות מעל מבער אלכוהול כדי להמיס את האגר. יש לנקוט משנה זהירות, שכן אגר חם שנפלט מצינור הזכוכית עלול לגרום לכוויות.</li>
		<li>לאחר שהאגר נמס, הניחו את הצינור בגוש החום כדי לשמור על האגר בצורה נוזלית.</li>
		<li>לחלופין, מניחים את צינורות האגר לתוך גוש החום 1 שעה לפני הניסוי כדי להמיס אותם מבלי להשתמש במבער. יש להשליך את האגר המומס לאחר יום אחד.</li>
		<li>הניחו שקופית מיקרוסקופ (שקופית A) בין שניים אחרים על פיסת פלסטיק.</li>
		<li>קח שקופית נוספת (שקופית B) והחזק אותה עם האצבעות ביד אחת.</li>
		<li>עם היד השנייה, מניחים טיפה קטנה של אגר מומס במרכז שקופית A באמצעות פיפטת הפסטר החמה.</li>
		<li>לחץ מיד על שקופית B על טיפת האגר כדי ליצור כרית דקה מאוד בין שקופיות A ו- B. שמור את השקופיות האלה דחוקות זו לזו עד שלב 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הר את העוברים.<ol>
<li>אספו 5-10 הרמפרודיטים גרבידיים עם הקוטף והניחו אותם בכוס שען מלאה במים.</li>
		<li>השתמשו באזמל כדי לפתוח את הנמטודות ההרמפרודיט ולחלץ ביצים מוקדמות (1-4 תאים) מהרחם, מתחת לסטריאומיקרוסקופ.</li>
		<li>קח את השקופית משלב 3.1.10 והחליק בעדינות את שקופית B כדי לחשוף את כרית האגר בשקופית A.</li>
		<li>מניחים ביצה מוקדמת במרכז כרית האגר על ידי צנרת עם צינור נימי.</li>
		<li>לחלופין, פיפטו טיפה המכילה סט של עוברים על כרית האגר ולאחר מכן חפשו עוברים בשלב מוקדם. בצע שלב זה תחת הסטריאומיקרוסקופ.</li>
		<li>במידת הצורך, הזיזו את הביצה על ידי הצמדתה עם ריס המודבק לקצה הקיסם.</li>
		<li>יש להסיר עודפי מים עם הפיפטה הנימית. הערה: ניתן להכין פיפטה נימית בקלות על ידי חימום פיפטה של פסטר מעל מבער אלכוהול ומשיכתו משני הקצוות.</li>
		<li>בזהירות לכסות את ההכנה עם כיסוי. כדי להימנע מבועות אוויר, הניחו קצה אחד של הכיסוי על המגלשה והחליקו בעדינות אזמל לאורך הקצה הסמוך כדי לעטוף באיטיות ובאופן אלכסוני את הכיסוי על ההכנה.</li>
		<li>השתמשו בפיפטה כדי למלא 3/4 מהחלל המקיף את כרית האגר במים. השאירו 1/4 מהחלל עם אוויר.</li>
		<li>אטמו את מכסה הכיסוי בג'לי נפט כדי למנוע ייבוש במהלך תקופות הקלטה ארוכות.</li>
		<li>השתמשו במברשת העדינה כדי להרחיב שכבה דקה של ג'לי נפט מומס סביב קצה הכיסוי. הערה: כעת ההכנה מוכנה להקלטה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. התאימו את ה-DIC והתחילו את הקלטת המיקרוסקופיה הארבע-ממדית
<ol><li>הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ. מקד את העובר באמצעות מטרת ההגדלה הנמוכה (פי 5 או 10x).</li>
	<li>שנה ליעד הטבילה פי 100.</li>
	<li>התאם את הרכיבים האופטיים של המיקרוסקופ כדי לקבל תמונת נומרסקי.<ol>
<li>מקד את המעבה.</li>
		<li>לפתוח לחלוטין את הצמצם של המעבה ולסגור את הסרעפת שדה (זה יספק צמצם מספרי גבוה יותר ולכן, רזולוציה גדולה יותר).</li>
		<li>בדקו ששני המקטבים במיקרוסקופ מכוונים לגרום להכחדת האור המרבית.</li>
		<li>סובבו את מנסרת וולאסטון כדי לקבל תמונה תלת-ממדית נחמדה של העובר, מוארת בצד אחד. סובבו את המנסרה לכיוון השני כדי לקבל את האפקט של הארת העובר בצד השני. הערה: ניתן לבצע שלבים אלה על דגימת בדיקה לפני ההקלטה, כך שנדרש רק כוונון עדין בדגימה המנותחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את לכידת התמונה במיקרוסקופ.</li>
</ol>5. נתחו את סרט ה-4D (איור 4).
הערה: לאחר השלמת ההקלטה, השתמש בתוכנת מעקב אחר שושלת תאים כדי לשחזר ולנתח שושלת תאים.
תוכנה למעקב אחר שושלת תאים היא כלי רב עוצמה לביצוע ניתוחים מפורטים של התפתחות עוברית או דינמיקה בתרביות תאים או שברי רקמות. התוכנית מחלצת ומכמתת מספר מערכי נתונים על הדינמיקה התאית של הדגימה הכוללים יצירת שושלת התאים השלמה של כל תא ותא מתועד, כולל חלוקות תאים, אורך מחזור התא, נדידה או אפופטוזיס וכן הקינטיקה שלו. בנוסף, התמיינות תאים יכולה להיות ניקוד על ידי שינויים מורפולוגיים של התא או על ידי ביטוי של סמנים ספציפיים. בעיקרון, מסך התוכנה מציג שני חלונות: בחלון השמאלי, ניתן להפעיל את הסרט הארבע-ממדי קדימה ואחורה או למעלה ולמטה לרמות העליונות או התחתונות, כך שניתן יהיה לעקוב אחר כל תא בזמן ובמרחב לאורך ההקלטה. על האלמנה הימנית נוצרת שושלת התאים. לחיצה על גרעין התא בסרט הארבע-ממדי יוצרת נקודה בחלון השושלת המאחסנת את המידע של שם התא, גורלו וקואורדינטות מרחביות. שושלת התאים של תא מסוים נוצרת על ידי השמעת הסרט הארבע-ממדי קדימה ולחיצה מעת לעת על הגרעין כדי לסמן את המיטוזה של אותו תא ספציפי לאורך זמן. חזרה על תהליך זה עבור כל אחד מהתאים המתועדים יוצרת את שושלת התאים השלמה של העובר או הדגימה. המידע המאוחסן עבור קואורדינטות מרחביות של כל תא משמש מאוחר יותר לשחזור מודלים תלת-ממדיים של עוברים ונתיבי נדידת תאים.
<ol><li>פתח את תוכנת איתור השושלת וצור פרויקט חדש על ידי מעבר לתפריט הסרגל העליון ובחירה: | קבצים פרויקט חדש.</li>
	<li>בחר את תבנית שושלת התאים בהתאם לטמפרטורת ההקלטה: DB08 להקלטה ב- 25 °C, DB10 להקלטה ב- 20 °C ו- DB12 להקלטה ב- 15 °C.</li>
	<li>הגדר את פרמטרי ההקלטה בחלון המתהווה: ספירת סריקות (בדרך כלל 1500), זמן בין סריקות (30 שניות), ספירת רמות (30) ומרחק בין רמות (1 מיקרון).</li>
	<li>בחר את קובץ התמונה ואת העיצוב.<ol>
<li>בחר את ספריית התמונות שבה נשמרו התמונות.</li>
		<li>בחר אם יש לשמור תמונות כתמונות בודדות (תמונה אחת לכל רמה וזמן) או כערימות z מרובות תמונות.</li>
		<li>קבע את שמות הקבצים ואת תבנית התמונה. באופן שגרתי, תמונות בודדות נשמרות תחת השמות הבאים: X0000L00C1 (לסריקה 0, רמה 0, ערוץ 1) X0000L01C1 (לסריקה 0, רמה 1, ערוץ 1) X0000L02C1 (לסריקה 0, רמה 2, ערוץ 1) ... X0001L00C1 (לסריקה 1, רמה 0, ערוץ 1) X0001L01C1 (לסריקה 1, רמה 1, ערוץ 1) ... X0300L04C1 (לסריקה 300, רמה 4, ערוץ 1) ... הערה: שמירת התמונות בתבנית דחוסה חוסכת מקום בדיסק הקשיח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את ערוצי האור: 1 עבור אופטיקת DIC, 2 עבור GFP, 3 עבור RFP וכו '. הוסף את אלה ששימשו בהקלטת 4D. לחץ על "עיבוד ערוצים מופעל" כדי לזהות אותם.</li>
	<li>התחילו להתחקות אחר שושלת התאים של העובר. המסך מכיל כעת שני חלונות עיקריים: חלון הווידאו וחלון שושלת התאים.<ol>
<li>בחלון השושלת, בחר ענף שושלת והשתמש בעכבר כדי ללחוץ על גרעין התא המתאים לתא זה בחלון הווידאו.</li>
		<li>עקוב אחר התא באופן מרחבי ולאורך זמן על-ידי הפעלת סרט 4D קדימה, אחורה או למעלה או למטה ברמה, באמצעות מקשי הסמן.</li>
		<li>לחץ מעת לעת על גרעין התא. זה יוצר נקודה בענף השושלת ורושם את הקואורדינטות המרחביות של התא בשלב זה. כתוצאה מכך, שושלת התאים מתקדמת, ושחזורים תלת-ממדיים של העובר אפשריים.</li>
		<li>סמן מיטוזה על ידי לחיצה על מקש ההחזרה. לאחר מכן בחר אחד מתאי הבת ועקוב אחריו כמו קודם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על התהליך (שלבים 5.6.1 עד 5.6.4) כדי לעקוב אחר שאר התאים העובריים כדי להתחקות אחר שושלת התאים השלמה, או כדי לעקוב אחר תאים ספציפיים בעלי עניין כגון אלה העוברים אפופטוזיס.</li>
	<li>השווה את השושלת המוטנטית עם שושלת התאים הסטריאוטיפית WT C. elegans .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אחד האתגרים הגדולים בביולוגיה המודרנית הוא הבנת ההתפתחות של אורגניזמים רב-תאיים. C. elegans התגלה כאחד המודלים המתאימים ביותר לחקר התיאום העדין בין התפשטות תאים לבין התמיינות תאים בעובר המתפתח. מנקודת מבט אופטית, גופו השקוף וגודלו הקטן הופכים את הנמטודה הזו לדגימה אידיאלית למיקרוסקופ DIC. אורגניזמים אחרים בעלי מאפיינים דומים עברו גם הם ניתוח מיקרוסקופיה 4D 11,12,13,14,15,16.
עבור אותם מחקרים התפתחותיים, השבתת גנים על ידי גנטיקה קדימה או לאחור מספקת רמז למעורבותה באמבריוגנזה. לאחר שהוכח כי גן ממלא תפקיד בהתפתחות, השלב הבא הוא להגדיר את תפקידו המדויק בביסוס תוכנית הגוף הנכונה. חיסון היא הגישה שנבחרה עבור רוב הדגמים. טכניקה זו מבהירה בעיות בהתמיינות תאים או בביטוי של סמנים ספציפיים. עם זאת, מגבלה מרכזית של גישה זו היא שהיא מספקת רק מבט סטטי על הביטוי של סמנים בודדים או יותר בנקודה קבועה בהתפתחות. תצוגה דינמית של סמנים אלה לאורך ההתפתחות יכולה להתקבל רק על ידי צביעת עוברים שונים בנקודות זמן שונות. בנוסף, שחזור שושלת תאים אינו אפשרי בדגימות קבועות כאלה.
מיקרוסקופיה 4D היא גישה משלימה לחקר ההתפתחות העוברית. טכניקה זו חושפת דינמיקת התפתחות ברזולוציה ברמת התא. כל פגם בעובר כגון בעיות בכיוון הציר, נדידת תאים, אפופטוזיס, מפרט גורל התא וכו' יופיע בסרט 4D שניתן לדמיין קדימה ואחורה, לכמת אותו ולהבקיע אותו על ידי החוקר. באמצעות טכניקה זו, כמעט כל תא ותא בעובר ניתן לעקוב עד לרגע שבו העובר מתחיל לנוע. עוברים שעברו מיקרוסקופיה 4D עם אור נראה בלבד ואופטיקה של נומרסקי אינם עוברים פוטו-דמה. סריקות פלואורסצנטיות יכולות גם להיות משולבות בתוך ההקלטה כדי לזהות מתי והיכן מתבטא גן. עוברים הסובלים מפוטודמאמג' משמעותי מזוהים על ידי הארכת מחזור התא שגורמת להקרנת UV חזקה בהשוואה לעובר שושלת WT סטנדרטי. במקרה כזה, ניתן להפחית את הפוטודמאג' על ידי הפחתת עוצמת מנורת ה-UV והגדלת הרגישות למצלמה או זמן החשיפה. מאפיינים מורפולוגיים וסמנים מולקולריים יכולים לעזור להבהיר את ההתפתחות העוברית של כל מוטציה.
הגדרת מערכת מיקרוסקופיה 4D קלה ליישום במעבדה, ולאחר תרגול מסוים, מאפשרת ניתוח ללא תחרות של דינמיקת תאים ומעקב אחר שושלות של תרביות תאים ודגימות שקופות חיות ברמת רזולוציה של כל תא ותא בשדה המיקרוסקופ. מעקב אחר שושלת תאים בתמונות DIC עדיין מעובד ביד. זה גוזל זמן, ולמרות שהתוכנה מזהה שגיאות שושלת כגון ענפי שושלת שונים המסמנים את אותו תא, טעויות אפשריות. בעוד שזיהוי אוטומטי של תאים המסומנים ב-GFP מפותח היטב2, תוכנת מעקב שושלת משלימה המבוססת על תאים לא מסומנים ותמונות של אור נראה עדיין נמצאת בשלב מוקדם ולא ממש שימושית לניתוח עוברים מלא. ללא כל ספק, יישום של מערכות זיהוי תמונה בתחום המיקרוסקופיה של האור הנראה יביא להתקדמות רבה בתחום זה.

מיקרוסקופיה 4D היא מערכת הקלטה רב-פוקלית של קיטועי זמן המאפשרת לחוקרים לרשום ולכמת את הדינמיקה של התאים של דגימה ביולוגית הן מבחינה מרחבית והן לאורך זמן. תרביות תאים, שמרים או רקמות חיות יכולות להיות נתונות לניתוח 4D אך טכניקה זו מתאימה במיוחד לניתוח התפתחות העוברים החיים. הרזולוציה של ניתוח זה מגיעה לרמה של כל תא בודד של העובר. ניתן לזהות כל חלוקת תאים, ולעקוב אחר תנועות התאים לאורך זמן. גורלות התאים נבחנים על פי המיקום והצורה שהתאים רוכשים. השימוש באופטיקה של נומרסקי מגביר את הניגודיות של דגימות שקופות לא מוכתמות באמצעות אלומות אור מקוטבות אורתוגונליות המפריעות למישור המוקד. התמונות המתקבלות נראות תלת מימדיות, מוארות בצד אחד.
שיטות אחרות המבוססות על שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ובבעלי חיים מהונדסים של GFP לזיהוי אוטומטי של גרעינים ויצירת שושלות תאים פותחו 1,2. היתרון של מערכות אלה ברור: התוכנה גוברת במידה רבה על הצורך בסימון ידני של כל גרעין לאורך פרק זמן (אם כי נדרש פיקוח ידני מסוים בשלבים המאוחרים). עם זאת, תהליכים תאיים הכוללים שינויים בצורת התא או בדינמיקה של הממברנה, כגון אלה המתרחשים במהלך התמיינות תאים, נדידה, אפופטוזיס או בליעת גופות, נשארים מוסתרים כרקע שחור בתמונות הגרעינים המסומנים בפלואורסצנט.
לעומת זאת, מיקרוסקופיית נומרסקי 4D (הנקראת גם מיקרוסקופיית DIC, מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית) מראה הן גרעינים והן שינויים בצורת התא המתרחשים במהלך התפתחותם של בעלי חיים מסוג בר או מוטציה. זה מאפשר מעקב אחר שושלות תאים באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים, תוך שימוש רק באור המועבר. אין צורך כללי להשתמש בבעלי חיים מהונדסים אלא כדי להראות דפוסי ביטוי ספציפיים, ובמקרה זה סריקות פלורסנטיות יכולות להיות משולבות. לכן, זו יכולה להיות הגישה האופטימלית עבור מעבדות רבות העובדות על תהליכים תאיים דינמיים כגון embryogenesis או אפופטוזיס שניתן להדגיש תחת מיקרוסקופיית DIC 3,4,5,6,7.
מספר תוכניות גמישות וידידותיות למשתמש זמינות ללכידת תמונות מיקרוסקופיות ולשחזור שושלות תאים, מודלים תלת-ממדיים, נתיבי נדידת תאים וכו 'במדגם המוקלט. בניסוי סטנדרטי, התמונות נרכשות בסדרה של מישורי מוקד, במרחק קבוע, שמספרם תלוי בעובי הדגימה. ניתן לייעל את הרזולוציה הטמפורלית של הניתוח על ידי הגדלת תדירות הסריקה. אין כמעט הגבלה על משך ההקלטה מלבד קיבולת האחסון של המחשב. לדוגמה, עבור ניתוח התפתחות עוברי C. elegans , אנו רוכשים באופן שגרתי תמונות על 30 מישורי מוקד (צעד של מיקרון אחד כל אחד), כל 30 שניות במשך 12 שעות.
מערכות אלה יושמו בניתוח של מספר עוברים של בעלי חיים כגון Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, עוברי נמטודה אחרים12,13, tardigrades14,15 ואפילו עוברי עכברים מוקדמים16. הדרישה היחידה היא שיהיה עובר שקוף המסוגל להתפתח על הכנת המגלשה מתחת למיקרוסקופ.
לסיכום, מיקרוסקופיה 4D מבוססת DIC שימושית במיוחד עבור 1) ניתוח התפתחות עוברית של בעלי חיים קטנים ושקופים: מעקב אחר שושלת תאים, נתיבי נדידת תאים, יצירת מודלים תלת-ממדיים וכו '; 2) הגדרת דפוסי ביטוי גנים; 3) חקר הדינמיקה של תרביות תאים, משמרים ועד תאים אנושיים; 4) ניתוח דינמיקה של רקמות או שברי עוברים; 5) כימות קינטיקה של מוות תאי ובליעת גופות; ו-6) ביצוע ניתוח פילוגנזה השוואתי המבוסס על מאפיינים התפתחותיים עובריים. אם יש עניין באחד מהנושאים הללו (או דומים להם), ניתן להשתמש במיקרוסקופיה 4D.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Cell Lineage Tracing software</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Motorized microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td></tr><tr><td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td></tr></tbody></table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב ערך לחשיפת תהליך ההתפתחות העוברי בבעלי חיים שונים. במהלך העשורים האחרונים, Caenorhabditis elegans התגלה כאחד המודלים הטובים ביותר לחקר הפיתוח. מנקודת מבט אופטית, גודלו וגופו השקוף הופכים את הנמטודה הזו לדגימה אידיאלית למיקרוסקופיית DIC (ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית או נומרסקי). מאמר זה ממחיש פרוטוקול לגידול נמטודות C. elegans , הכנה והרכבה של העוברים שלהם, ביצוע מיקרוסקופיה 4D ומעקב אחר שושלות תאים. השיטה מבוססת על רישומי קיטועי זמן מולטיפוקליים של תמונות נומרסקי וניתוח עם תוכנה ספציפית. טכניקה זו חושפת דינמיקה התפתחותית עוברית ברמה התאית. כל פגם עוברי במוטנטים, כגון בעיות בכיוון הציר, נדידת תאים, אפופטוזיס או אפיון גורל התא, ניתן לזיהוי ולניקוד יעילים. כמעט כל תא של העובר יכול להיות במעקב עד לרגע שבו העובר מתחיל לנוע. התחקות אחר שושלת התאים השלמה של עובר C. elegans על ידי מיקרוסקופיית DIC 4D היא מייגעת, אך השימוש בתוכנה ספציפית מקל מאוד על משימה זו. בנוסף, טכניקה זו קלה ליישום במעבדה. מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב תכליתי ופותחת את האפשרות לבצע ניתוח חסר תקדים של התפתחות עוברית.

כדי לאפיין התפתחות עוברית של מוטציה C. elegans עבור הגן gsr-1, המקודדת את האנזים גלוטתיון רדוקטאז, הנדרש לחידוש גלוטתיון מופחת (GSH) ומעורב בשמירה על הומאוסטזיס של חמצון-חיזור בנמטודה, ביצענו מיקרוסקופיה 4D של מוטציה למחיקה gsr-1 (tm3574) שהיא אובדן של אלל תפקודי הגורמת לפנוטיפ מעצר עוברי מוקדם18. גם נמטודות ה-WT וגם המוטציות המאוזנות של Gsr-1 (tm3574) C. elegans גדלו על צלחות NGM שנזרעו עם E. coli OP50 כמקור המזון17. תולעי gsr-1 (tm3574) גודלו כהטרוזיגוס בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס במשך שני דורות ולאחר מכן תולעים הומוזיגוטיות מופרדות (המסוגלות לגדול עד לבגרות הודות לעומס האימהי) הועברו ל -25 מעלות צלזיוס לדגירה של לילה לפני ניתוח העוברים. לוחות תולעים הודגמו בתוך קופסאות קרטון כדי למנוע עיבוי (איור 1). נמטודות גרבידיות נחתכו כדי לחלץ עוברים צעירים.
כדי להשוות את ההתפתחות העוברית של המוטאנט לעומת ה-WT הסטריאוטיפי בתנאים זהים, הוכנסו עובר WT (כבקרה) ועובר gsr-1 (tm3574) לאותה הכנה זה ליד זה. זרימת עבודה של מיקרוסקופיה 4D הופעלה על מיקרוסקופ זקוף ממונע סטנדרטי המצויד באופטיקה DIC. פרמטרי ההקלטה שנבחרו בתוכנית הבקרה של המיקרוסקופ היו: z-stacks של 30 מישורי מוקד במרחק של מיקרון אחד כל אחד, מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל z-stack ו-1500 z-stacks (12.5 שעות של הקלטה). טמפרטורת ההקלטה הותאמה ל-25 מעלות צלזיוס (הן בחדר והן על במת המיקרוסקופ) (איור 2).
לאחר השלמת ההקלטה, קובץ התמונות נפתח, ושושלת התאים שוחזרה באמצעות תוכנת מעקב אחר שושלת על ידי לחיצה על גרעיני תאים המוצגים בחלון הווידאו (איור 4). שושלת התאים העובריים המוטנטית gsr-1 (tm3574) הושוותה לשושלת C. elegans WT המתוארת ברקע. תוצאה מרכזית הייתה זיהוי של עיכוב הדרגתי במחזור התא במהלך ההתפתחות העוברית. כתוצאה מכך, עוברים מוטנטיים נעצרו בשלבי ביניים ואילו עוברי WT התקדמו ולבסוף בקעו כזחלים.
הכנה ותצפית ישירה על עוברים תחת המיקרוסקופ או תצפית חיסונית עם נוגדנים נגד סמנים עובריים מאוחרים יכולה לחשוף את נוכחותם של אחוז גבוה של עוברים צעירים במוטציה בהשוואה ל- WT. ניתן להסיק את מעצר העובר כהסבר הסביר ביותר. עם זאת, הוכחה ישירה וכימות מדויק של עיכוב מחזור התא ניתנים להצגה ולכימות באלגנטיות ובקלות רק באמצעות ניסוי מיקרוסקופיה 4D. ניתן גם לדמיין מאפיינים חשובים אחרים של התפתחות עוברית כגון התמיינות תאים או אפופטוזיס (איור 5) באופן דינמי באמצעות מיקרוסקופיה 4D המציעה ניתוח מפורט של היבטים מרובים של התפתחות בניסוי יחיד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> איור 1: נמטודות C. elegans גדלות בתנאי מעבדה. נמטודות גדלות על צלחות NGM עם זרעי E. coli, מאוחסנות בקופסאות קרטון ומדגרות בטמפרטורה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">של</a> 15 מעלות צלזיוס, 20 מעלות צלזיוס או 25 מעלות צלזיוס.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> איור 2: צילום מסך של תוכנת הקלטה למיקרוסקופיה 4D. דוגמה לשתי תוכנות שונות לבקרת מיקרוסקופים (A ו-B). תוכניות אלה יוצרות זרימות עבודה כדי לשלוט במיקרוסקופ ובלכידת התמונה במהלך הקלטת מיקרוסקופיה 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> איור 3: תצלומים סדרתיים של הכנת כרית אגר והרכבה של עובר C. elegans . א. צינורות אגר מוכנים. בי-סי. הכנת כרית האגר. ד. החלקה מלאה חלקית במים. ה. איטום המגלשה בג'לי נפט. ו. הכנה סופית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> איור 4: צילומי מסך טוריים של תוכנת מעקב אחר שושלת תאים. התוכנית מאפשרת שחזור של שושלת התאים העובריים של מוטציה לעיכוב מחזור התא (משמאל) ועובר WT (מימין) C. elegans . A. שלב מוקדם של ההתפתחות. בי-סי. התפתחות שני העוברים מתקדמת עם הזמן. ד. עובר WT מתפתח כראוי ומתחיל התארכות ואילו המוטאנטים נעצרים. בכל המקרים התוכנית מציגה את חלון הווידאו ואת חלון השושלת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> איור 5: צורת שבירה של עדשים של תאים אפופטוטיים בעובר C. elegans WT. ניתן להעריך את גורל התא, המוגדר על ידי מאפיינים מורפולוגיים, על ידי מיקרוסקופיה 4D. התמונה מראה עובר C. elegans בשלב השעועית. תאים חיים מראים גרעינים בעלי צורה חלקה המוקפים בציטופלסמה גרגירית. לעומת זאת, תאים אפופטוטיים (חצים צהובים) מתעבים ומאמצים צורה דמוית עדשים, מתפרקת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K Views.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.

Video: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

אחת אורך גל צל הדמיה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; נידות כולל כוח אומדנים

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Engineering

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך<em&gt; ג elegans</em&gt; עובר

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neuroscience

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אחת אורך גל צל הדמיה של

מבוסס-פורייה עקיפה ניתוח של חיים Caenorhabditis elegans

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

חזותי neuroblast cytokinesis במהלך

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

בסיסי

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב