מחקר זה נתמך על ידי הקרן הזנק של אוניברסיטת סיימון פרייזר.

1. ממברנות הקציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ hypotonic (10 מ&quot;מ טריס-HCl, 10 מ&quot;מ KCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, pH 8.0) עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על תא גלולה (~ 10 8 תאים) ו דגירה של 15-30 דקות על קרח. Lyse התאים על ידי העברת הדגימה באמצעות מחטי מזרק (5-10 עובר) או שמאחד את המדגם על ידי homogenizer Dounce (15-30 שבץ). השתמש hemocytometer וכתמי כחולי trypan כדי לבדוק את היעילות של תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את שבריר microsomal ידי צנטריפוגה ההפרש של lysate ב3,000 דקות 15 GX ולאחר מכן ב100,000 GX 2 שעות. צנטריפוגה הראשונה משיגה גלולה שהוא שבריר הגרעיני, וצנטריפוגה הבאה של supernatant מייצרת גלולה שנייה, המהווה את חלק microsomal המכיל קרום הפלזמה, כמו גם האברונים קרום הנכנס 8. Supernatant הסופי הוא שבריר cytosolic. אחסן את השברים microsomal במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך analys נוסףהוא כמפורט להלן. </li></ol> 2. ממיסים, לפגל, וחלבונים בממברנה Digest <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את חלקיק microsomal במאגר denaturation (40 מ&quot;מ טריס, 10 mM EDTA, 10 מ&quot;מ TCEP, 0.5% Rapigest, pH 8) ולאחר מכן דגירה הפתרון ב100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את הפתרון המחומם לטמפרטורת חדר, להוסיף אבקת אוריאה גבוהה במיוחד טוהר לפתרון ל8 ריכוז סופי M ודגירה המדגם ב37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פתרון מניות iodoacetamide למדגם ל15 מ&quot;מ ריכוז סופי, ודגירת הפתרון בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לalkylate thiols בחינם במדגם. הוספת פתרון מניות DTT המדגם לריכוז סופי 10 מ&quot;מ ודגירת הפתרון עוד 10 דקות בטמפרטורת חדר כדי להרוות את iodoacetamide המוגזמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את 10x הפתרון שהושג עם 40 חיץ מ&quot;מ טריס ב-pH 8, ולאחר מכן להוסיף טריפסין לדוגמא ביחס 1:20 של trypsin לחלבון בסך הכל. שמור את תגובת מערכת העיכול בלילה בתנור 37 ° C כדי להבטיח התגובה הושלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את מערכת העיכול על ידי acidifying פתרון המדגם ל-pH 1 עם HCl, מצב זה גם מפרק את חומרי הניקוי, כלומר Rapigest. לבזות את Rapigest ב-C ° 37 עבור שעה 1, ולהסיר את המשקעים שפותחו על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את supernatant המכיל פפטידים מדגם על ידי מחסנית C-18 מיצוי שלב מוצק (SPE) ולייבש את הדגימה המתקבלת על ידי speedvac. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח SDS-PAGE של דגימות לפני ואחרי טריפסין עיכול כדי לאשר את יעילות העיכול. </li></ol> 3. לכידת glycopeptide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את פפטידים ניקו בחיץ הצימוד (אצטט 100 מ&quot;מ נתרן, pH 5.5). הוספת periodate נתרן לתוך תמיסת פפטיד בריכוז 10 מ&quot;מ סופי ל30 דקות בחושך, בטמפרטורת חדר. זה יהיה לחמצן קבוצות cis-דיאול בglycans לאלדהידים, המאפשרת glycans לבני זוג השרף דרך הכימיה hydrazide. להרוות את periodate המופרז על ידי סולפיט נתרן בריכוז 20 מ&quot;מ סופי וה-pH 5 ל10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את שרף derivatized hydrazide לתוך תמיסת פפטיד ביחס של 1:4 (שרף לפתרון) לזוג glycopeptides לשרף. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עם סיבוב מקצה לקצה עבור צימוד שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פפטידים מאוגדים על ידי שטיפת השרף פעמיים עם 1 מיליליטר של כל אחד מאלה: המים DI, 1.5 M NaCl, מתנול ואצטוניטריל 80%. לבסוף, לשטוף 3x השרף עם 1 מיליליטר של 100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3 ב-pH 8 להחליף את החיץ של המערכת ל100 מ&quot;מ NH 4 HCO 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את supernatant והשוטף לניתוח של פפטידים מאוגדים (אופציונליים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את N-glycopeptides מהשרף על ידי PNGase F בדגירת לילה בשעה 37 ° C עםn מקצה לקצה רוטציה. לאסוף את הפפטידים שפורסמו על ידי צנטריפוגה ולשטוף אצטוניטריל 80%. ייבש את הפתרון שהתקבל בspeedvac לניתוח LC-MS. </li></ol> 4. היפוך חלוק נוסף (אופציונאלי) כדי לפשט את מורכבות מדגם נוסף, fractionate N-glycopeptides מתקבל. לדוגמא, redissolve פפטידים המיובשים לתוך formate האמוניה 10 מ&quot;מ, pH 3 עם אצטוניטריל 20% ולהשתמש בתמורת קטיון חזקה כרומטוגרפיה (SCX) לfractionate פפטידים. ייבש את eluent שהושג, ולאחר מכן לנתח את שברי פפטיד מתקבלים על ידי הפוך השלב LC-MS 8,17,18. 5. ניקוי של N-glycopeptides פורסם (אופציונלית) אם חששות לעלות לזיהום הפוטנציאלי של פפטידים, redissolve פפטידים המיובשים לתוך 0.1% חומצה פורמית ולהשתמש בעמודת MCX SPE לנקות עוד יותר את פפטידים לפני ניתוח LC-MS להפוך שלב. <strong&gt; הערה: פרמטרים חיפוש מסד נתונים. במהלך המחשוף סלקטיבית של N-glycopeptides את השרף, PNGase F ממיר asparagine מקושר N-סוכרים לחומצה אספרטית. לכן, יש שינוי מסת דה 0.9840 של N-glycopeptides המשוחרר. כדי לזהות במדויק את הפפטידים האלה, שינוי זה צריך להוסיף לפרמטרי החיפוש יחד עם שינויים נפוצים כגון carbamidomethylation של ציסטאין והחמצון של מתיונין.

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+dissection+of+membrane+proteins.">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li><li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.+.">Membrane-protein topology. .</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology.">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li><li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו מציגים אסטרטגית glycopeptide ללכוד לאפיון חלבונים על פני קרום תא. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד חלבונים מופרשים, כגון אלה בדם, כמו גם בנוזלי גוף אחרים או בתקשורת תרבות תא. ההצלחה של השיטה מסתמכת על העיכול של דגימות המלאה; ...

חלבונים בתא שטח באינטראקציה עם הסביבה תאית ולהעביר אותות מבחוץ לחלק הפנימי של תא. לפיכך, חלבונים אלה, כוללים חלבוני מטריצת חוץ תאיים, ממלאים תפקידים קריטיים בכל ההיבטים של ביולוגיה ופיזיולוגיה, החל שגשוג, צמיחה, הגירה, בידול להזדקנות וכן הלאה סלולריות. חלבוני פני השטח לתפקד על ידי אינטראקציה עם תאים אחרים, חלבונים ומולקולות קטנות 1-3. אפיון מולקולרי של חלבונים על פני קרום התא הוא עניין רב לא רק לביולוגים, אלא גם לחברות תרופות, שכן יותר מ -60% מתרופות ממוקדים לחלבונים על פני קרום תא 4. ספקטרומטריית טנדם מסה (MS), עם הרגישות שלה מעולה, דיוק, ותפוקה לזיהוי של חלבונים ופפטידים, כבר כלי רב עוצמה למחקרים proteomic הגלובליים 5,6. עם זאת, חלבוני פני השטח להוות אתגר משמעותי לפרוטאומיקה מבוססת MS, כפירוב חלבוני פני השטח קיימים בכמויות נמוכות ועם שינויים כבדים. האזורים פורש הקרום של חלבוני פני השטח לעבד אותם הידרופובי; זה נכון במיוחד במקרה של חלבונים הטרנסממברני multipass. זה קשה ובכך לפזר חלבוני קרום בתמיסות מימיות ללא העזרה של חומרי ניקוי; עם זאת השימוש בחומרי הניקוי, בדרך כלל מדכא את הביצועים של HPLC ו-MS 1,7,8 בזיהוי חלבון. לכן, חלבוני קרום היו מאופיינים בצורה גרועה בפרוטאומיקה מבוססת LC-MS הישירה. Glycosylation הוא אחד לאחר translational השינויים החשובים והנפוצים ביותר המתרחשים בחלבונים על פני קרום תא 9. מורכבות ואת ההטרוגניות עצומות של glycans לעכב MS אות &#39;פפטידים 10. עם זאת, במספר שיטות proteomic השתמשו השינוי הזה ייחודי להעשרת חלבוני פני השטח ולהסיר את moieties הסוכר מחלבונים לפני ניתוח LC-MS. שיטה אלהים כולל לכידה מבוססת קטיני זיקת 11 ולכידה כימית המבוסס על חומצה בורית או מבוסס hydrazide 12 כמו גם פרידות כרומטוגרפיה הידרופילי 8,13. הסרת glycans הופכת חלבונים בממברנה לחלבונים רגילים ומפשטת באופן דרסטי את אפיון הטרשת הנפוצה. בגלל glycosylation גם מתרחש בחלבונים מופרשים שיש מסיסות גבוהה בניגוד לחלבוני קרום, שיטות רבות glycoproteomic מותאמות לחלבונים מסיסים, ונוטות להיות סלקטיביות glycopeptide נמוכה ורגישות כשנפרס קרום חלבונים 8,14. שיטות אחרות קיימות גם להעשיר, בפרט, חלבונים על פני קרום תא, כגון אלה באמצעות ultracentrifugation 15 ואסטרטגיות תיוג 16. השוואה מפורטת בין השיטה שלנו ושיטות קיימות אחרות לאפיון חלבוני קרום נערכה לאחרונה 17, והתוצאות הצביעו על כך שהשיטה שלנו יכולה לבצע באותה מידה, אם לא, אבל עם יותר טובים, יותר מכל שיטות פרוטאומיקה הקרום לעומת פשטות גבוהה יותר. כדי לסייע לחוקרים להשתמש בשיטה זו, אנו נפרט כאן פרוטוקול כללי. שיטה זו משלבת מספר יתרונות של אסטרטגיות glycoproteomics קיימות והוא המציא במיוחד עבור גליקופרוטאינים קרום, אך השיטה עובדת פחות טובה לחלבונים מופרשים. המאפיינים של שיטה זו כוללים: 1) solubilization של חלבונים בממברנה מלא, 2) העשרת glycopeptides במקום גליקופרוטאינים לחסל את הפרעה סטרית הפוטנציאלית בעת שימוש במצע הלכידה מוצק, 3) השימוש בכימית hydrazide ליצירת קשרים קוולנטיים בין glycopeptides ומצע לכידה, כך שglycopeptides מלוכד יכול לסבול שוטף מחמיר לגבוה glycoselectivity, ו -4) את היכולת לנהל את ההליך כולו ללכוד בצינור אחד לאובדן מדגם מופחת ומשך הליך מקוצר. לאחר יישום שיטה זו ללימוד ואריאתי של דגימות ביולוגיות כוללים תאים ורקמות, ראה סלקטיביות גבוהה (&gt; 90%) לגליקופרוטאינים 8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

חלבונים פני תא, כוללים חלבונים תאיים מטריקס, משתתפים בכל התהליכים העיקריים הסלולריים ופונקציות, כגון צמיחה, בידול, ושגשוגם. אפיון מקיף של חלבונים אלו מספק מידע עשיר לגילוי סמן ביולוגי, זיהוי סוג התא, ובחירת תרופות יעד, כמו גם לעזור לקדם את ההבנה של ביולוגיה ופיזיולוגיה סלולריות שלנו. חלבוני פני השטח, לעומת זאת, מציבים אתגרים משמעותיים אנליטיים, בגלל השפע שלהם מטבע הנמוך, גבוהה הידרופוביות, ולאחר translational שינויים כבדים. ניצול של glycosylation הנפוץ בחלבוני פני השטח, אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד תפוקה גבוהה, המשלבת את היתרונות של כמה אמצעי N-glycoproteomics קיימים. השיטה שלנו יכולה להעשיר glycopeptides נגזר מחלבונים פני השטח ולהסיר glycans לפרוטאומיקה הקלילה באמצעות LC-MS. N-glycoproteome נפתר כולל information זהות חלבון וכמות כמו גם באתריהם של glycosylation. שיטה זו יושמה לסדרה של מחקרים בתחומים שונים, לרבות סרטן, תאי גזע, ורעילויות תרופה. המגבלה של השיטה טמונה בשפע הנמוך של חלבוני קרום פני השטח, כך שכמות גדולה יחסית של דגימות הנדרשות לניתוח זה בהשוואה למחקרים התמקדו בחלבוני cytosolic.

תרשים זרימת נציג של הליך הניסוי מסוכם באיור 1. התיוג וצעדי חלוקה נוספים הם אופציונליים ופרטים מתוארים בפרסום האחרון 18. אפשרות נוספת היא לנתח את פפטידים ללא שינוי, שאינו מגיבים עם השרף. היתרונות של ניתוח פפטידים ללא שינוי כוללים את זיהוי הפוטנציאל של פפ?...

Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Simon Fraser University.  חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל. 

Video: Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Cell Capture Using a Microfluidic Device

תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

אינו אנזימטית, תרבות רקמות סרום ללא נגעי שד טרום פולשני לדור ספונטני של Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

ניתוח Cell Surface שיפוץ הדבקה בתגובה מתח מכני באמצעות חרוזים מגנטיים

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...