Questa ricerca è stata finanziata dal fondo di avvio della Simon Fraser University.

1. Harvest Membrane <ol><li> Aggiungere tampone ipotonico (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) con cocktail inibitore di proteasi su un pellet di cellule (~ 10 8 cellule) e incubare per 15-30 min in ghiaccio. Lisare le cellule di passare il campione attraverso aghi da siringa (5-10 passaggi) o omogeneizzare il campione da un omogeneizzatore Dounce (15-30 colpi). Utilizzare un emocitometro e trypan colorazione blu per controllare l&#39;efficienza della lisi. </li><li> Ottenere la frazione microsomiale da una centrifugazione differenziale del lisato a 3.000 gx 15 min e poi a 100.000 gx 2 hr. La prima centrifugazione ottiene un pellet che è la frazione nucleare, e la successiva centrifugazione del supernatante genera una seconda pellet, che è la frazione microsomiale che contiene la membrana plasmatica e membrana organelli 8. Il supernatante finale è la frazione citosolica. Conservare le frazioni microsomiali a -80 ° C freezer per ulteriori analysè come di seguito indicato. </li></ol> 2. Sciogliere, Denaturare, e digerire proteine ​​di membrana <ol><li> Sciogliere la frazione microsomiale nel buffer di denaturazione (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, TCEP 10 mM, 0,5% Rapigest, pH 8) e poi incubare la soluzione a 100 ° C per 10 min. </li><li> Raffreddare la soluzione riscaldata a temperatura ambiente, aggiungere ultra-elevata purezza urea polvere nella soluzione 8 M concentrazione finale e incubare il campione a 37 ° C per 30 min. </li><li> Aggiungere iodoacetamide soluzione madre al campione di 15 mM concentrazione finale, e incubare la soluzione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente per alchilare i tioli liberi nel campione. Aggiungere soluzione madre DTT al campione a una concentrazione finale 10 mM e incubare la soluzione per altri 10 min a temperatura ambiente per estinguere l&#39;eccessiva iodoacetamide. </li><li> Diluire la soluzione 10x ottenuto con tampone Tris 40 mM a pH 8, e successivamente aggiungere tripsina al campione con un rapporto 1:20 trypsin di proteine ​​totali. Mantenere la reazione di digestione a 37 ° C per una notte forno per garantire la reazione è completa. </li><li> Terminare la digestione acidificando la soluzione del campione a pH 1 con HCl, una condizione che rompe anche il detersivo, cioè Rapigest. Degradare la Rapigest a 37 ° C per 1 ora, e rimuovere la precipitazione sviluppato da centrifugazione. </li><li> Pulire il surnatante contenente peptidi campione da una cartuccia di estrazione C-18 in fase solida (SPE) e asciugare il campione ottenuto da speedvac. </li><li> Effettuare una analisi SDS-PAGE di campioni prima e dopo digestione con tripsina per confermare l&#39;efficienza digestione. </li></ol> 3. Glycopeptide Capture <ol><li> Sciogliere i peptidi puliti nel buffer di accoppiamento (acetato di sodio 100 mM, pH 5,5). Aggiungere periodato di sodio nella soluzione peptide ad una concentrazione finale di 10 mM per 30 minuti al buio, a temperatura ambiente. Questo si ossida i gruppi cis-diolo nei glicani ad aldeidi, Che permettono ai glicani ad accoppiarsi con la resina attraverso la chimica idrazide. Quench l&#39;eccessiva periodato da solfito di sodio ad una concentrazione finale di 20 mM e pH 5 per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Introdurre resina idrazide derivatizzato nella soluzione peptide ad un rapporto di 1:4 (resina di soluzione) per accoppiare glicopeptidi alla resina. Incubare la reazione a 37 ° C per 1-2 giorni con rotazione end-to-end per l&#39;accoppiamento completo. </li><li> Rimuovere i peptidi non legati mediante lavaggio della resina due volte con 1 ml di ciascuno dei seguenti: acqua deionizzata, 1,5 M NaCl, metanolo e 80% acetonitrile. Infine, lavare la resina con 3x 1 ml di 100 mM NH 4 HCO 3 a pH 8 per scambiare il buffer del sistema a 100 mM NH 4 HCO 3. <ol><li> Raccogliere il surnatante e lavaggi per l&#39;analisi dei peptidi non legati (opzionale). </li></ol></li><li> Rilasciare N-glicopeptidi dalla resina mediante PNGase F in una notte di incubazione a 37 ° C con unn end-to-end di rotazione. Raccogliere i peptidi rilasciati da centrifugazione e lavaggio acetonitrile 80%. Essiccare la soluzione ottenuta nello speedvac per l&#39;analisi LC-MS. </li></ol> 4. Ulteriore frazionamento (facoltativo) Per semplificare ulteriormente la complessità dei campioni, frazionare N-glicopeptidi ottenuti. Ad esempio, i peptidi ridisciogliere secchi in 10 mM ammonio formiato, pH 3 con 20% acetonitrile e utilizzare forte scambio cationico (SCX) cromatografia di frazionare i peptidi. Essiccare il eluente ottenuto, e quindi analizzare le frazioni peptidiche ottenute dalla fase inversa LC-MS 8,17,18. 5. Pulizia di N-glicopeptidi Rilasciato (facoltativo) Se preoccupazioni aumentano per il potenziale contaminazione dei peptidi, scioglierla peptidi secchi in 0,1% di acido formico e utilizzare una colonna MCX SPE per pulire ulteriormente i peptidi prima fase inversa analisi LC-MS. <strong&gt; Nota: parametri di ricerca del database. Durante la scissione selettiva di N-glicopeptidi largo della resina, PNGase F converte l&#39;asparagina collegato N-glicani di un acido aspartico. Pertanto, vi è una massa 0,9840 Da spostamento dei liberate N-glicopeptidi. Per identificare accuratamente questi peptidi, questa modifica deve essere aggiunto ai parametri di ricerca insieme con modifiche comuni come il carbamidometilazione della cisteina e ossidazione della metionina.

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui vi presentiamo una strategia glicopeptide-capture per il profiling di proteine ​​della superficie cellulare. Il metodo può essere applicato per studiare le proteine ​​secrete, come quelle presenti nel sangue, così come in altri fluidi corporei o in cellule di coltura. Il successo del metodo si basa sulla digestione completa di campioni; Pertanto, una caratterizzazione SDS-PAGE dell&#39;efficienza digestione è necessario, in particolare per l&#39;analisi prima volta di un campi...

Proteine ​​di superficie cellulare interagiscono con l&#39;ambiente extracellulare e trasmettere i segnali dall&#39;esterno verso l&#39;interno di una cella. Così, queste proteine, incluse le proteine ​​della matrice extracellulare, giocano ruoli critici in tutti gli aspetti della biologia e fisiologia vanno dalla proliferazione, crescita, migrazione, differenziazione all&#39;invecchiamento e così via cellulare. Proteine ​​di superficie funzionano interagendo con altre cellule, proteine ​​e piccole molecole 1-3. Caratterizzazione molecolare di proteine ​​della superficie cellulare è di grande interesse non solo per i biologi ma anche per le aziende farmaceutiche, come più del 60% dei farmaci sono mirati alle proteine ​​della superficie cellulare 4. Spettrometria di massa tandem (MS), con la sua straordinaria sensibilità, precisione e velocità per l&#39;identificazione di proteine ​​e peptidi, è stato un potente strumento per studi di proteomica globali 5,6. Eppure, proteine ​​di superficie pongono sfide significative proteomica basati su MS, comeesistono maggior parte delle proteine ​​di superficie in piccole quantità e con modifiche pesanti. Le regioni membrane-spanning delle proteine ​​di superficie li rende idrofobo; questo è particolarmente il caso per le proteine ​​transmembrana multipass. Perciò è difficile da sciogliere proteine ​​di membrana in soluzione acquosa senza l&#39;aiuto di un detersivo; tuttavia l&#39;uso di detergenti generalmente sopprime le prestazioni di HPLC e MS 1,7,8 nella identificazione delle proteine. Pertanto, proteine ​​di membrana sono stati mal caratterizzato proteomica diretti basati LC-MS. La glicosilazione è una delle più importanti e abbondanti modificazioni post-traduzionali che avvengono nelle proteine ​​della superficie cellulare 9. L&#39;enorme complessità e l&#39;eterogeneità dei glicani ostacolano segnale peptidi &#39;MS 10. Tuttavia, diversi metodi di proteomica hanno utilizzato questa modifica unica per arricchire proteine ​​di superficie e per rimuovere le frazioni di zucchero da proteine ​​prima analisi LC-MS. Questi metodos comprendono basato lectina affinità cattura 11 e acido borico-based o basati hydrazide-capture chimica 12 così come separazioni cromatografiche idrofili 8,13. La rimozione di glicani trasforma proteine ​​di membrana alle proteine ​​regolari e semplifica drasticamente la caratterizzazione MS. Poiché glicosilazione avviene anche in proteine ​​secrete che hanno elevata solubilità in contrasto con proteine ​​di membrana, molti metodi glicoproteomica sono ottimizzati per le proteine ​​solubili, e tendono ad avere minore selettività glicopeptidi e sensibilità quando viene distribuito proteine ​​di membrana 8,14. Esistono anche altri metodi per arricchire, in particolare, le proteine ​​di superficie cellulare, come quelli che usano ultracentrifugazione 15 e strategie di etichettatura 16. Un confronto dettagliato tra il nostro metodo e altri metodi esistenti per la caratterizzazione di proteine ​​di membrana è stata condotta recentemente 17, ei risultati hanno indicato che il metodo può eseguire altrettanto bene, se nonmeglio, di tutti i metodi rispetto proteomica membrana, ma con una maggiore semplicità. Per aiutare i ricercatori utilizzano questo metodo, i dettagli qui un protocollo generale. Questo metodo integra diversi vantaggi di strategie glycoproteomics esistenti ed è stato ideato specificamente per glicoproteine ​​di membrana, ma il metodo funziona ugualmente bene per proteine ​​secrete. Le caratteristiche di questo metodo includono: 1) una completa solubilizzazione delle proteine ​​di membrana, 2) un arricchimento di glicopeptidi invece di glicoproteine ​​per eliminare il potenziale sterico quando si usa un substrato solido cattura, 3) l&#39;uso della chimica idrazide per formare legami covalenti tra glicopeptidi e il substrato di cattura, in modo che i glicopeptidi legati possono tollerare lavaggi stringenti per alta glycoselectivity, e 4) la capacità di condurre l&#39;intera procedura di cattura in una provetta per la perdita di campione ridotto e durata procedura abbreviata. Dopo aver implementato questo metodo per studiare una variabileety di campioni biologici comprese le cellule e tessuti, abbiamo osservato una selettività elevata (&gt; 90%) di glicoproteine ​​8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Proteine ​​di superficie delle cellule, tra cui proteine ​​della matrice extracellulare, partecipano a tutti i principali processi e le funzioni cellulari, come la crescita, la differenziazione e la proliferazione. Una caratterizzazione completa di queste proteine ​​fornisce informazioni ricche per la scoperta di biomarcatori, identificazione del tipo cellulare, e la selezione della droga-obiettivo, oltre a contribuire ad avanzare la nostra comprensione della biologia e fisiologia cellulare. Proteine ​​di superficie, tuttavia, presentano notevoli difficoltà analitiche, a causa della loro intrinsecamente bassa abbondanza, elevata idrofobicità e pesanti modificazioni post-traduzionali. Approfittando della glicosilazione prevalente sulle proteine ​​di superficie, vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture high-throughput che integra i vantaggi di diversi esistenti mediante N-glycoproteomics. Il nostro metodo può arricchire i glicopeptidi derivati ​​da proteine ​​di superficie e rimuovere i loro glicani per proteomica facili con LC-MS. La N-glycoproteome risolto comprende le informazione di identità proteine ​​e quantità nonché i loro siti di glicosilazione. Questo metodo è stato applicato a una serie di studi in settori quali cancro, cellule staminali, e tossicità da farmaci. La limitazione del metodo risiede nella scarsa abbondanza di proteine ​​di membrana di superficie, tale da richiedere una relativamente grande quantità di campioni per questa analisi rispetto agli studi centrati sulle proteine ​​citosoliche.

Un diagramma di flusso rappresentante della procedura sperimentale è riassunto nella Figura 1. L&#39;etichettatura e ulteriori fasi di frazionamento sono opzionali e dettagli sono descritti in una recente pubblicazione 18. Un&#39;altra opzione è quella di analizzare i peptidi modificati, che non reagiscono con la resina. I vantaggi di analisi dei peptidi modificati includono una possibile identificazione di peptidi e proteine ​​non glicosilati, come claudine in giunzioni strette; Un ult...

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Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS.

Glicopeptide Capture per Proteomica cellulari di superficie

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Simon Fraser University.  Proteine ​​di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine ​​per facili analisi proteomica basati LC-MS. 