Cette recherche a été soutenue par le fonds de démarrage de l&#39;Université Simon Fraser.

1. Récolte membranes <ol><li> Ajouter un tampon hypotonique (10 mM Tris-HCl, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, pH 8,0) avec un cocktail inhibiteur de protease sur un culot de cellules (~ 10 8 cellules) et incuber pendant 15 à 30 min sur de la glace. Lyse des cellules par l&#39;échantillon au travers des aiguilles de seringues (5-10 passes) ou l&#39;homogénéisation de l&#39;échantillon par un homogénéisateur Dounce (15-30 coups). Utilisez un hématimètre et coloration au bleu trypan pour vérifier l&#39;efficacité de la lyse. </li><li> Obtenir la fraction microsomale par une centrifugation différentielle du lysat à 3000 gx 15 min puis à 100 000 gx 2 h. La première centrifugation obtient un culot qui est la fraction nucléaire, et la centrifugation subséquente du surnageant génère une deuxième pastille, qui est la fraction microsomale qui contient la membrane plasmique ainsi que des organelles liées à la membrane 8. Le surnageant final est la fraction cytosolique. Stocker les fractions microsomales dans le congélateur à -80 ° C pour de plus amples analysest comme indiqué ci-dessous. </li></ol> 2. Dissoudre, Dénaturer, et Digest protéines membranaires <ol><li> Dissoudre la fraction microsomale dans le tampon de dénaturation (Tris 40 mM, EDTA 10 mM, TCEP 10 mM, 0,5% Rapigest, pH 8) et ensuite incuber la solution à 100 ° C pendant 10 min. </li><li> On refroidit la solution chauffée à température ambiante, ajouter à ultra-haute pureté de l&#39;urée en poudre dans la solution à une concentration finale de 8 M et incuber l&#39;échantillon à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter la solution mère de l&#39;iodoacétamide à l&#39;échantillon à 15 mM de concentration finale, et incuber la solution à l&#39;obscurité pendant 30 min à température ambiante pour alkyler les thiols libres dans l&#39;échantillon. Ajouter du DTT solution mère de l&#39;échantillon à une concentration finale de 10 mM et incuber la solution pendant encore 10 min à température ambiante pour étancher l&#39;iodoacétamide excessive. </li><li> Diluer la solution obtenue de 10x avec un tampon Tris 40 mM à pH 8, et à la suite de la trypsine à l&#39;échantillon dans un rapport de 01:20 trypsin de la protéine totale. Maintenir la réaction de digestion à 37 ° C un four pendant une nuit pour s&#39;assurer que la réaction est terminée. </li><li> Mettre fin à la digestion par l&#39;acidification de la solution d&#39;échantillon à pH 1 avec HCl, une condition qui décompose également le détergent, à savoir Rapigest. Dégrader la Rapigest à 37 ° C pendant 1 heure, et enlever la précipitation développé par centrifugation. </li><li> Nettoyer le surnageant qui contient les peptides échantillon par une cartouche C-18 d&#39;extraction en phase solide (SPE) et sécher l&#39;échantillon obtenu par speedvac. </li><li> Effectuer une analyse SDS-PAGE des échantillons avant et après digestion à la trypsine afin de confirmer l&#39;efficacité de la digestion. </li></ol> 3. Glycopeptides capture <ol><li> Dissoudre les peptides nettoyés dans le tampon de couplage (acétate de sodium 100 mM, pH 5,5). Ajouter le periodate de sodium dans la solution de peptide à une concentration finale de 10 mM pendant 30 min à l&#39;obscurité, à température ambiante. Cela permettra d&#39;oxyder les groupes cis-diol dans les glycanes en aldéhydes, Qui permettent de coupler les glycanes de la résine à travers la chimie hydrazide. Étancher le periodate excessive par le sulfite de sodium à une concentration finale de 20 mM et à pH 5 pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Introduire la résine transformée en dérivé hydrazide dans la solution de peptide à un rapport de 1:4 (solution de résine) pour coupler des glycopeptides à la résine. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 1 à 2 jours avec la rotation de bout en bout pour le couplage complet. </li><li> Éliminer les peptides non liés par lavage de la résine à deux reprises avec 1 ml de chacun des éléments suivants: l&#39;eau DI, 1,5 M de NaCl, de méthanol et 80% d&#39;acétonitrile. Enfin, le lavage de la résine avec 3 x 1 ml de 100 mM de NH 4 HCO 3 à pH 8 pour échanger le tampon du système à 100 mM de NH 4 HCO 3. <ol><li> Recueillir le surnageant et les lavages à l&#39;analyse des peptides non liés (en option). </li></ol></li><li> Libérer les N-glycopeptides à partir de la résine par la PNGase F à une incubation pendant une nuit à 37 ° C avec unn bout-à-bout rotation. Recueillir les peptides libérés par centrifugation et un lavage à l&#39;acétonitrile 80%. Sécher la solution obtenue dans l&#39;speedvac pour l&#39;analyse LC-MS. </li></ol> 4. Fractionnement supplémentaire (en option) Pour simplifier encore plus la complexité de l&#39;échantillon, fractionner les N-glycopeptides obtenus. Par exemple, les peptides séchés redissoudre dans 10 mM de formiate de l&#39;ammoniac, un pH de 3 avec 20% d&#39;acétonitrile et en utilisant une forte échangeuse de cations (SCX) de chromatographie pour fractionner les peptides. Sécher l&#39;éluant obtenu, puis analyser les fractions peptidiques obtenues par phase inverse LC-MS 8,17,18. 5. Nettoyage des N-glycopeptides libérés (Facultatif) Si les préoccupations augmentent pour la contamination potentielle des peptides, dissoudre les peptides secs dans de l&#39;acide formique à 0,1% et d&#39;utiliser une colonne MCX SPE pour nettoyer en outre les peptides avant l&#39;analyse de phase inverse LC-MS. <strong&gt; Remarque: les paramètres de la base de données Searching. Lors de la coupure sélective de N-glycopeptides au large de la résine, PNGase F convertit l&#39;asparagine N-glycane lié à un acide aspartique. Par conséquent, il existe un décalage 0,9840 Da masse des N-glycopeptides libérées. Pour identifier avec précision ces peptides, cette modification doit être ajouté à des paramètres de recherche ainsi que des modifications communes telles que la carbamidomethylation de la cystéine et de l&#39;oxydation de la méthionine.

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. 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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ici, nous introduisons une stratégie glycopeptides capture pour le profilage des protéines de surface cellulaire. Le procédé peut être appliqué pour étudier les protéines sécrétées, tels que ceux dans le sang, ainsi que dans d&#39;autres liquides corporels ou dans des milieux de culture cellulaire. Le succès de la méthode repose sur la digestion complète d&#39;échantillons; Par conséquent, une SDS-PAGE, la caractérisation de l&#39;efficacité de la digestion est nécessaire,...

les protéines de surface cellulaire interagissent avec l&#39;environnement extracellulaire et transmettent des signaux à partir de l&#39;extérieur vers l&#39;intérieur d&#39;une cellule. Ainsi, ces protéines, comprenant des protéines de la matrice extracellulaire, jouent un rôle essentiel dans tous les aspects de la biologie cellulaire et la physiologie allant de la prolifération, la croissance, la migration, la différenciation au vieillissement et ainsi de suite. les protéines de surface fonctionnent en interaction avec d&#39;autres cellules, des protéines et des petites molécules 3.1. La caractérisation moléculaire des protéines de surface cellulaire est d&#39;un grand intérêt non seulement pour les biologistes, mais aussi pour les sociétés pharmaceutiques, comme plus de 60% ​​des médicaments sont destinées aux protéines de surface cellulaire 4. Spectrométrie de masse en tandem (MS), avec sa sensibilité supérieure, la précision et débit pour l&#39;identification des protéines et des peptides, a été un outil puissant pour les études protéomiques mondiaux 5,6. Pourtant, les protéines de surface posent des défis importants à la protéomique MS, commela plupart des protéines de surface existent en faibles quantités et avec des modifications lourdes. Les régions transmembranaires des protéines de surface rendent hydrophobe; ce qui est particulièrement le cas pour les protéines transmembranaires multipass. Il est donc difficile de dissoudre les protéines membranaires dans des solutions aqueuses, sans l&#39;aide d&#39;un détergent; toutefois, l&#39;utilisation de détergents supprime généralement la performance de HPLC et MS 1,7,8 dans l&#39;identification des protéines. Par conséquent, les protéines membranaires ont été mal caractérisé en protéomique basées directs LC-MS. La glycosylation est l&#39;une des modifications post-traductionnelles plus importantes et abondantes qui ont lieu dans les protéines de surface cellulaire 9. L&#39;énorme complexité et l&#39;hétérogénéité des glycanes entravent MS signal de peptides 10. Néanmoins, plusieurs procédés protéomiques ont utilisé cette modification unique pour enrichir les protéines de surface et d&#39;éliminer les fragments de sucre à partir de protéines avant l&#39;analyse LC-MS. Ces procédés comprennent basé lectine capture par affinité 11 et à base d&#39;acide capture chimique ou borique base hydrazide-12 ainsi que des séparations chromatographiques hydrophiles 8,13. La suppression des glycanes transforme les protéines membranaires des protéines réguliers et radicalement simplifie la caractérisation MS. Parce que la glycosylation a également lieu dans les protéines sécrétées qui ont une forte solubilité contrairement aux protéines membranaires, de nombreuses méthodes glycoproteomic sont optimisés pour les protéines solubles, et ont tendance à avoir plus faible sélectivité des glycopeptides et sensibilité lorsqu&#39;il est déployé aux protéines membranaires 8,14. D&#39;autres procédés existent également à enrichir, en particulier, des protéines de surface cellulaire, tels que ceux utilisant une ultracentrifugation 15 et stratégies de marquage 16. Une comparaison détaillée entre notre méthode et d&#39;autres méthodes existantes pour caractériser les protéines membranaires a été menée récemment 17, et les résultats ont indiqué que notre méthode peut effectuer aussi bien, si pasmieux, que toutes les méthodes de protéomique de la membrane par rapport, mais avec simplicité supérieur. Pour aider les chercheurs utilisent cette méthode, nous détaillons ici un protocole général. Cette méthode intègre plusieurs avantages de stratégies de glycoprotéomique existantes et est conçu spécifiquement pour les glycoprotéines membranaires, encore la méthode fonctionne aussi bien pour des protéines sécrétées. Les caractéristiques de ce procédé comprennent: 1) une solubilisation complète de protéines membranaires, 2) l&#39;enrichissement du glycopeptides au lieu de glycoprotéines pour éliminer l&#39;encombrement stérique potentiel lors de l&#39;utilisation d&#39;un substrat solide de capture, 3) l&#39;utilisation de la chimie de l&#39;hydrazide pour former des liaisons covalentes entre glycopeptides et le substrat de capture, telles que des glycopeptides liés peuvent tolérer des lavages strictes pour haute glycoselectivity, et 4) la capacité d&#39;effectuer la procédure de capture dans l&#39;ensemble de tube pour une perte réduite de l&#39;échantillon et de la durée de la procédure raccourcie. Après l&#39;application de cette méthode à l&#39;étude d&#39;une variableciété d&#39;échantillons biologiques, y compris les cellules et les tissus, nous avons observé une sélectivité élevée (&gt; 90%) à des glycoprotéines 8,17,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

les protéines de surface cellulaire, y compris les protéines de la matrice extracellulaire, de participer à tous les processus et les fonctions cellulaires importantes, telles que la croissance, la différenciation et la prolifération. Une caractérisation complète de ces protéines fournit de l&#39;information riche pour la découverte de biomarqueurs, l&#39;identification du type de cellule, et la sélection cible thérapeutique, ainsi que d&#39;aider à faire progresser notre compréhension de la biologie cellulaire et physiologie. protéines de surface, toutefois, posent des défis analytiques importantes, en raison de leur nature faible abondance, hydrophobie élevée, et des modifications post-traductionnelles lourds. Profitant de la glycosylation répandue sur les protéines de surface, nous présentons ici une approche glycopeptides capture à haut débit qui intègre les avantages de plusieurs moyens N-glycoprotéomique existants. Notre méthode peut enrichir les glycopeptides dérivés des protéines de surface et de retirer leurs glycanes pour la protéomique faciles à l&#39;aide de LC-MS. La N-glycoproteome résolu comprend l&#39;information de l&#39;identité de la protéine et la quantité ainsi que de leurs sites de glycosylation. Cette méthode a été appliquée à une série d&#39;études dans des domaines tels que le cancer, les cellules souches, et la toxicité des médicaments. La limitation de la méthode réside dans la faible abondance des protéines membranaires de surface, de telle sorte qu&#39;une quantité relativement importante d&#39;échantillons est nécessaire pour cette analyse par rapport à des études ont porté sur des protéines cytosoliques.

Un organigramme représentant la procédure expérimentale est résumée sur la figure 1. L&#39;étiquetage et d&#39;autres étapes de fractionnement sont facultatifs et les détails sont décrits dans une publication récente 18. Une autre option est d&#39;analyser les peptides non modifiés, qui ne réagissent pas avec la résine. Les avantages de l&#39;analyse des peptides non modifiés comprennent l&#39;identification potentielle des peptides et des protéines non glycosylées, telles que...

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Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

les protéines de surface cellulaire sont biologiquement importantes et largement glycosylée. Nous présentons ici une approche glycopeptides capture pour solubiliser, enrichir et deglycosylate ces protéines pour les analyses protéomiques faciles à base LC-MS.

Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vues.  Simon Fraser University.  les protéines de surface cellulaire sont biologiquement importantes et largement glycosylée. Nous présentons ici une approche glycopeptides capture pour solubiliser, enrichir et deglycosylate ces protéines pour les analyses protéomiques faciles à base LC-MS. 