Bu araştırma Simon Fraser Üniversitesi başlangıç ​​fonu tarafından desteklenmiştir.

1.. Hasat Membranlar <ol><li> Bir hücre peleti (~ 10 8 hücreleri) üzerine proteaz inhibitör kokteyli ile, hipotonik tampon maddesi (10 mM Tris-HCI, 10 mM KCI, 1.5 mM MgCl2, pH 8.0) ilave edilir ve buz üzerinde 15-30 dakika boyunca inkübe edin. Lyse şırınga iğneleri (5-10 geçiş) ile örnek geçen ya da bir Dounce homojenleştirici (15-30 vuruş) ile homojenize ile hücreler. Lisisin verimliliğini kontrol etmek Hemasitometre ve tripan mavi boya kullanın. </li><li> 3000 gx 15 dk lizatının bir diferansiyel santrifüjleme ile mikrozomal fraksiyonu elde edilir ve daha sonra da 100,000 gx 2 hr. İlk santrifüj nükleer fraksiyonu olan bir pelet alır ve süpernatan daha sonra santrifüj plazma membranı hem de zara bağlı organelleri 8 içerir, mikrozom kısmı olan bir ikinci pelet, oluşturur. Nihai süpernatan, sitosolik fraksiyonu. Daha fazla analizana için -80 ° C dondurucu içinde mikrozomal fraksiyonlar saklayınaşağıda gösterildiği gibidir. </li></ol> 2.., Çözülür denatüre ve Digest Membran Proteinleri <ol><li> Denatürasyon tampon maddesi (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP,% 0.5 Rapigest, pH 8) &#39;de mikrozomal fraksiyonu çözündürülür ve daha sonra 10 dakika boyunca 100 ° C&#39;de çözelti inkübe edin. </li><li> , Oda sıcaklığına kadar ısıtılmış çözeltisini 8 M nihai konsantrasyona kadar çözelti içinde çok yüksek saflıkta üre toz ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe örnek. </li><li> 15 mM nihai konsantrasyona kadar numuneye iyodoasetamid stok solüsyonu ekleyin ve numune içinde serbest tioller alkillemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe çözeltisi. 10 mM nihai konsantrasyona kadar numuneye DTT stok solüsyonu ilave edin ve aşırı iodoasetamid söndürmek için oda sıcaklığında diğer bir 10 dakika için çözelti inkübe edin. </li><li> PH 8 40 mM Tris tampon maddesi ile elde edilen çözelti 10x seyreltilir, ve daha sonra trypsi bir 01:20 oranında numuneye tripsin eklemektoplam proteine ​​n. Reaksiyon tamamlandıktan emin olmak için bir 37 ° C fırın içinde gece boyunca reaksiyonu sindirim koruyun. </li><li> Yani Rapigest HCI, aynı zamanda deterjan bozulduğu bir durum ile pH 1&#39;e numune solüsyonu asitleştirilerek sindirim iptal eder. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de Rapigest düşürebilir ve santrifüjleme ile geliştirilen çökelmesini çıkarın. </li><li> Bir C-18 katı faz ekstraksiyonu (SPE) kartuşlardan örnek peptidleri içeren ve hızlı vakumla ile elde edilen numunenin kuru süpernatantı temizlemek. </li><li> Önce ve sindirim etkinliğini doğrulamak için ise tripsin hazmından sonra numune SDS-PAGE analizi yapın. </li></ol> 3.. Glikopeptid Yakalama <ol><li> Bağlama tamponu (100 mM sodyum asetat, pH 5.5) &#39;de temizlenmiş peptidler çözülür. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 30 dakika için bir 10 mM nihai konsantrasyonda en peptit çözeltisi içine sodyum periodat ekleyin. Bu aldehitlere glikanlarında cis-diol grubu oksitlenir, Burada hidrazid kimya aracılığıyla reçineye bağlanması için glikanlar izin verir. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 20 mM nihai konsantrasyona ve pH 5 sodyum sülfit ile aşırı periodat söndürülür. </li><li> Reçineye çift glikopeptidlere 01:04 (çözeltiye reçine) bir oranda peptit çözeltisi içine hidrazid türevlendirilmemiş reçine tanıtılması. , Tam bağlanma için uç uca rotasyon ile 1-2 gün boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyonu inkübe edin. </li><li> Aşağıdaki her bir kez 1 ml reçine yıkanarak bağlanmamış peptidleri kaldırın: DI su, 1.5 M NaCl, metanol ve% 80 asetonitril. Son olarak, 100 mM NH4 HCO 3 sistemin tampon alışverişi için pH 8, 100 mM NH4 HCO 3 1 ml reçine, 3 kez yıkayın. <ol><li> (Isteğe bağlı) bağlı olmayan peptidlerin analizi için supernatant toplamak ve yıkar. </li></ol></li><li> Bir 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübasyona PNGase F ile reçineden N-peptidi bırakınn sonuna kadar uç dönme. Santrifüj ve% 80 asetonitril yıkama tarafından yayımlanan peptidler toplayın. LC-MS analizi için hızlı vakumla elde edilen çözelti kurutun. </li></ol> 4.. Ayrıca Fraksiyonu (İsteğe bağlı) Daha fazla örnek karmaşıklığını basitleştirmek için, elde edilen N-glıkopeptıtlerı ayırımlamak. Örneğin, 10 mM amonyak format,% 20 asetonitril ile pH 3&#39;e kurutuldu peptidler içinde yeniden çözülür ve peptidleri fraksiyonlanması güçlü katyon alışveriş (SCX) kromatografisi kullanır. Elde edilen yıkama sıvısı kurutun ve daha sonra, ters fazlı LC-MS ile 8,17,18 Elde edilen peptid fraksiyonları analiz. Çıkış N-glıkopeptıtlerın 5. Temizleme (İsteğe bağlı) Endişeler peptidlerin potansiyel kirlenme artış ise,% 0.1 formik asit içine kurutuldu peptidleri yeniden çözünmesine ve daha fazla ters fazlı LC-MS analizi, önceki peptidleri temizlemek için bir MCX SPE kolon. <strong&gt; Not: Veritabanı arama parametreleri. Reçine N-glıkopeptıtlerın seçici olarak ayrılması sırasında, PNGase F bir aspartik asit N-glikan bağlantılı asparagin dönüştürür. Bu nedenle, serbest N-glıkopeptıtlerın bir 0,9840 Da kütle kayma yoktur. Doğru bu peptidleri belirlemek için, bu değişiklik bu metionin ve sistein oksidasyon karbamido gibi ortak değişikliklerle birlikte, arama parametre ilave edilmesi gerekmektedir.

<ol>
	<li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking.">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li><li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane:+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function.">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+dissection+of+membrane+proteins.">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li><li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-protein+topology.+.">Membrane-protein topology. .</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology.">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li><li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+(PROSPECTS).">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li><li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis.">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics.">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li><li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation,+immunity,+and+autoimmunity.">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li><li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions.">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li><li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin+affinity+capture,+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins.">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li><li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation.">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li><li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery.">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li><li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells.">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li><li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins.">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells.">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+(gagQP)+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome.">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada hücre yüzey proteinleri profil için bir glikopeptid-yakalama stratejisini tanıtmak. Yöntem, bu tür salgılanmış kan gibi proteinler, yanı sıra diğer vücut sıvılarında veya hücre kültür ortamı içinde incelemek için uygulanabilir. Yöntemin başarısı numunelerin tam sindirim dayanır; bu nedenle, sindirim bir verimlilik SDS-PAGE karakterizasyonu, özellikle numunenin ilk kez analizi için, gereklidir. Tam bir sindirim zar proteinleri için zor olabilir ve sadece m...

Hücre yüzey proteinleri, hücre dışı çevre ile etkileşim ve bir hücrenin içine dışarıdan gelen sinyalleri iletir. Bu nedenle, hücre dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere, bu proteinler, hücre biyolojisi ve çoğalma, büyüme, göç, farklılaşmadan benzeri yaşlanma ve fizyoloji kadar tüm yönleriyle kritik roller oynar. Yüzey proteinleri diğer hücrelerin, proteinler ve küçük moleküller 1-3 etkileşerek çalışır. Ilaçların fazla% 60 hücre yüzeyi proteinleri 4 hedeflenir gibi hücre yüzeyi proteinlerinin moleküler karakterizasyonu, biyologlar için değil, aynı zamanda farmasötik şirketler için sadece büyük bir ilgi çekmektedir. Üstün duyarlılık, ve protein ve peptitlerin tanımlanması için verim ile tandem kütle spektrometrisi (MS), küresel, proteomik 5,6 çalışmalar için güçlü bir araç olmuştur. Oysa, yüzey proteinleri gibi, MS tabanlı Proteomikte için önemli sorunlar teşkilÇoğu yüzey proteinleri düşük miktarlarda ve ağır değişiklikler ile mevcut. Yüzey proteinleri membran-yayılan bölgeleri bunları hidrofobik hale getirmek; Bu, özellikle çok pasolu zar proteinleri için geçerlidir. Bir deterjan yardımı olmadan, sulu çözeltiler içinde zar proteinleri çözmek için olan, böylece zordur; Bununla birlikte deterjanların kullanımı genellikle protein tanımlama HPLC ve MS 1,7,8 performansını engeller. Bu nedenle, membran proteinleri zayıf doğrudan LC-MS tabanlı proteomik karakterize edilmiştir. Glikozilasyon hücre yüzey proteinleri 9 içinde yer alan en önemli ve bol post-translasyonel modifikasyonlar biridir. Glikanların muazzam karmaşıklığı ve heterojenite peptidin MS sinyali 10 engelleyebilir. Bununla birlikte, pek çok yöntem proteomik yüzey proteinlerini zenginleştirmek ve önceki LC-MS analizi için proteinlerden şeker bölümlerine kaldırmak için bu tek değişiklik kullandık. Bu yöntems lektin bazlı afinite yakalama 11 ve hidrazid bazlı ya da borik asit bazlı kimyasal yakalama 12 hem de hidrofilik kromatografisi ayrımı 8,13 içerir. Glikanların kaldırılması normal proteinlere dönüştüren zar proteinleri ve büyük ölçüde MS karakterizasyonu kolaylaştırır. Glikosilasyon da zar proteinleri aksine, yüksek çözünürlüğe sahip olan salgılanmış proteinler yer alır, çünkü birçok glycoproteomic yöntem çözünür proteinler için optimize edilmiş, ve daha düşük seçicilik ve glikopeptid proteinleri 8,14 zar konuşlandırılmış olan duyarlılığı sahip olma eğilimi vardır. Başka yöntemler de ettirecek vardır, özellikle de, bu tür ultrasantrifüjleme 15 ve markalama stratejileri 16 kullananlar gibi hücre yüzeyi proteinleri. Membran proteinleri karakterize bizim yöntem ve diğer mevcut yöntemler arasında ayrıntılı bir karşılaştırma son zamanlarda 17 yürütülen ve sonuçları bizim yöntem eşit derecede iyi gerçekleştirebilirsiniz belirtti, eğer değildiTüm karşılaştırıldığında membran proteomiks yöntemlere göre daha iyi, ancak daha yüksek sadeliği ile. Araştırmacılar bu yöntemi kullanmak yardımcı olmak için, burada detay genel bir protokol. Bu yöntem, mevcut Glycoproteomics stratejileri çeşitli avantajları entegre ve zar glikoproteinlerinin için özel olarak tasarlanmış olan, ancak yöntem salgılanan proteinler için de aynı derecede iyi çalışır. Bu yöntemin özellikleri şunlardır: 1) zar proteinlerinin tam bir çözünmesi, 2) kullanılarak bir katı madde yakalama alt katmanını kullanırken, potansiyel sterik engellemeyi ortadan kaldırmak için glikoproteinlerin glıkopeptıtlerın bir zenginleştirme, 3) hidrazid kimyası kullanımı ile kovalent bağlar oluşturmak için glikopeptidler ve yakalama alt-tabaka, bağlı glikopeptitler yüksek glycoselectivity için sıkı yıkama tolere edebilir, ve 4) yeteneği azalır örnek kaybı ve daha kısa işlem süresi için, bir tüp içinde tüm yakalama işlemi yapmak için bu gibi. Bir değişken okuyan için bu yöntemi uyguladıktan sonrahücreler ve dokular dahil olmak üzere, biyolojik örneklerin ety biz glikoproteinler 8,17,18 için yüksek seçicilik (&gt; 90%) gözlenmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DTT</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TCEP</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">646547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rapigest SF</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186001860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium periodate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">311448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PNGase F</td>
			<td style="width:199px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">P0704S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Affi-Gel Hz Hydrazide gel</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">153-6047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Worthington Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">LS02115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sep-Pak C-18 cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">WAT054955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oasis MCX cartridge</td>
			<td style="width:199px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease inhibitor coctail</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:199px;">Amersco</td>
			<td style="width:119px;">568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium sulphite</td>
			<td style="width:199px;">Caledon</td>
			<td style="width:119px;">8360-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Invertase</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I0408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alpha-1 trypsin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ribonulease B</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R7884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Avidin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Conalbumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glycopeptide capture for cell surface proteomics

Hücre-dışı matris proteinleri de dahil olmak üzere hücre yüzeyi proteinleri, örneğin büyümesi, farklılaşması ve proliferasyonu gibi tüm önemli hücresel süreçleri ve fonksiyonlar, katılabilir. Bu proteinlerin kapsamlı bir karakterizasyonu biomarker keşif, hücre tipi belirlenmesi ve ilaç-hedef seçimi yanı sıra, hücre biyolojisi ve fizyolojisi anlayışımızı ilerletmek için yardımcı olmak için zengin bilgi sağlar. Yüzey proteinleri Ancak nedeniyle doğal olarak düşük yoğunlukta, yüksek hidrofobik ve ağır post-translasyonel modifikasyonlar, önemli analitik zorluklar oluşturmaktadır. Yüzey proteinleri üzerinde yaygın glikolizasyon yararlanarak, biz burada birkaç mevcut N-Glycoproteomics araçlarının avantajlarını entegre bir yüksek verimli glikopeptit yakalama yaklaşımını tanıtmak. Bizim yöntem yüzey proteinleri elde glıkopeptıtlerı zenginleştirmek ve LC-MS kullanılarak uyduruk Proteomikte için kendi glikanları kaldırabilirsiniz. Çözülmüş N-glycoproteome inf içerirprotein kimlik ve miktarı gibi glycoslasyonun sitelerinin ormation. Bu yöntem, kanser, kök hücreler ve ilaç zehirlenmesi gibi alanlarda bir dizi çalışma uygulanmıştır. Bu yöntemin örnekleri sınırlama nispeten büyük bir miktarı, sitosolik proteinler merkezli çalışmalara göre bu analiz için gerekli olan şekilde, bir yüzey zar proteinleri, en düşük yoğunlukta yer alır.

Deneysel prosedür temsili bir akış şeması Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. Etiketleme ve daha fazla fraksinasyon adımlar isteğe bağlıdır ve bilgilerini yeni yayın 18 tarif edilmiştir. Başka bir seçenek reçine ile reaksiyona girmeyen, değiştirilmemiş peptidleri, analiz etmektir. Değiştirilmemiş peptidleri analiz avantajları bu sıkı birleşme bölgesindeki klaudin gibi glikosile edilmemiş peptidler ve proteinler, potansiyel belirlemek; Ek bir avantaj daha doğru kantit...

Watch this Scientific Journal Video about Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics at JoVE.com

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak.

Hücre Yüzey Proteomics için glikopeptiddir Yakalama

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Görüntüleme.  Simon Fraser University.  Hücre yüzey proteinleri biyolojik olarak önemli ve yaygın olarak glikosile bulunmaktadır. Biz kolay LC-MS tabanlı Proteomik analizler için bu proteinleri, çözünür hale zenginleştirmek ve deglycosylate burada bir glikopeptid-yakalama yaklaşımını tanıtmak. 

Video: Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Hücre Yakalama mikroakışkan Cihaz Kullanımı

Biyoloji

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Düşük afiniteli Ekstrasellüler Reseptör-ligand Etkileşimlerinin Ölçeklenebilir Algılama için Avidite tabanlı Ekstrasellüler Etkileşim Gösterimi (AVEXIS)

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...