העבודה נתמכה על ידי מימון ליבה מהמועצה למחקר הרפואי. אנו מודים לקרייג ניקול להכנת שרטוטים טכניים. אנו מודים למתיו פירסון ופול פרי על תמיכת ההדמיה שלהם.

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיות ברישיון על ידי המשרד בבריטניה הבית (מספר רישיון פרויקט PPL 60/3785 ו60/4424). 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית melanoblasts בעור הפיתוח על ידי שילוב של שורה מתאימה Cre-recombinase להביע עכבר עם קו עכבר כתב ניאון. Tyr :: Crea, Tyr :: CREB 8 וWnt1 :: 14 Cre שימש בהצלחה כקווי Cre-לבטא ו 9 R26YFPR כקו כתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התרבות בזרימה למינרית; להשלים הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) עם (פניצילין 1% v v / / סטרפטומיצין), 10% v / v בסרום עוברי עגל ו.584 L-גלוטמין GM / L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון ההדמיה החיה מתואר באיור 1 לעקר את בסיס חדר הדמיה ידי ניגוב עם 70% אתנול. לעקר מוסיף, סרטוני הדמיה, וטבעות אטימות על ידי השרייה overnight ב70% אתנול. השתמש במכסה סטרילי מצלחת 6 גם את המכסה של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח התחתון של חדר ההדמיה מורכב מקרום טמבל שנערך במקום על ידי O-טבעת (איור 1). התחל עם צלחת טמבלית 35 מ&quot;מ גז חדיר. מניחים את הצלחת על פני חדר ההדמיה ולחתוך את הקרום החדיר הגז בסכין גילוח להב אחד. דחוף את טבעת O על הממברנה כדי לאבטח אותו לחדר ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטוני ההדמיה (6 בסך הכל) מהדקים את העור העוברי במקום (איור 1) לפני השימוש הם חייבים להיות מלאים עם agarose 1%. הכן פתרון 2% agarose עם סטרילי DH 2 O על ידי במיקרוגל וקירור ל60 ° C. מיקס 01:01 עם 10 מדיום תרבות מיליליטר (ראה שלב 2) שחומם מראש ל 60 ° C. לעמוד סרטוני ההדמיה 6 בצלחת 6 היטב סטרילי. לטפטף 1% פתרון agarose למרכז של כל קליפ באמצעות pastette קנס ולאפשר לו להתקרר. הוסף 1 מיליליטר סטרילי PBS הקר היטב כל אחד כדי למנוע אתgarose מהתייבשות. סרטוני ההדמיה יכולים להיות מאוחסנים במשך מספר שעות ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע את ההפרדה העדינה של עור עוברי ולטפל הרקמה גזור להשתמש &quot;שיטת מקל שיער&quot; כפי שמתוארת בKashiwagi et al. 3 במקום להשתמש במקל שיפוד קבאב במבוק יכול לשמש. הפוך חריץ קטן בקצה השטוח של השיפוד באמצעות סכין גילוח להב אחד ולהכניס את מברשת שיניים רכות זיפים. חתוך את השיפוד כך שזה כ 15 סנטימטר באורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ confocal עם תא סביבתי מלא או שלב קאמרי עליון מתן 5% CO 2 באוויר. Prewarm הבמה מיקרוסקופ ל37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני ההדמיה. זה עוזר למנוע סחף מדגם שנגרם על ידי התרחבות של רכיבי הבמה כפי שהם להתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סט רב עמדה באמצעות תוכנת השליטה של ​​מיקרוסקופ כדי שתהיינה אפשר למרכז במהירות ובקלות באמצע של כל תרבות להקים ניסיונילא. </li></ol> 2. נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mate העכברים ולייעד את פוסט יום coitum הראשון כE0.5 יום. בE14.5 היום, לברור את הנקבה על ידי נקע בצוואר הרחם ולחשוף את חלל הגוף על ידי ביצוע חתך קו האמצע קטן, קרע לגזרים את העור לכיוון הראש והזנב ולאחר מכן חיתוך הצפק הבסיסי ומקלף חזרה לכל צד של הגוף. לנתח את הרחם לסטרילי PBS הקר על ידי מחזיק בחוזקה עם מלקחיים וגזרו לאורך mesometrium באמצעות מספריים כירורגיות. שמור הרחם על קרח עד נדרשת. לתיאור מפורט לראות שיאה et al. (2007) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עובר מן הרחם על ידי החיתוך הראשון אורכו של קיר הרחם עם מספריים כירורגיות כדי לשחרר את decidua ולאחר מכן לנתח את העוברים מdecidua ידי קרעת לגזרים אותם עם שני זוגות מלקחיים בסדר. מסך לביטוי כתב ניאון (במידת צורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור עוברים על ידי עריפת ראש לפני לנתיחה. Subsequently להסיר את הזנב וגפיים אחורי ולאחר מכן forelimbs באמצעות סכין גילוח להב אחד. לשמור על רקמה לgenotyping אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך בventrum בסמוך לקו האמצע לכיוון rostro-הזנב. שימוש במקלות השיער המתואר בשלב 1.6, להקניט בזהירות את העור מרקמות חיבור הבסיסית מסתובבות העובר באותו הזמן. אל תסיר את העור לחלוטין, אלא להשאיר אותו מחובר יחד רחוק קצה הגחון מהחתך הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חשוב לא לתת לעור להיות דפוק כאז זה מאוד קשה לעלות. כדי למנוע זאת, מיישר את העור באמצעות מקלות שיער (צד עור כלפי מעלה) על פני השטח של צלחת פטרי יבשה ולאחר מכן לחתוך משם מתא המטען העובר באמצעות סכין גילוח להב אחד. צד עורי ניתן להבחין מהצד באפידרמיס על ידי התבוננות זהירה של הצומת בין הרקמה גזור ואת העובר לפני העור הוסר. האזור של הרקמה גזור הואכ 0.5 מ&quot;מ 2 כאשר לנתח עובר E14.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סרטון הדמיה על גבי העור כך שagarose נוגע בצד עורי של הרקמה. אפשר לעמוד ל60 שניות ולאחר מכן בזהירות להקניט את הקצוות של הרקמה עד הצדדים של קליפ. הפוך את הסרטון ולהשתמש בשיער מקלות כדי לשטח את העור ולהסיר את כל בועות אוויר, מקפיד לגעת במשטח של הרקמה (באזור שיהיה צילם) מעט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט תפר משי לקשור את העור לסרטון ההדמיה באמצעות שני קשרים אצבע פשוטים משני צדדיו של סרטון ההדמיה, כך שהם להדק ולמשוך את העור בחריץ קרוב לחלק העליון של הסרטון. הפוך את הסרטון, לדחוף פנימה את הכנס ההדמיה והמקום בבסיס. מלא להכניס את עם ~ 5 מיליליטר של מדיום התרבות (ראה שלב 1.2). איור 1 מתאר את ההרכבה של חדר ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול ל5 דגימות שנותרו. </li></ol> 3. בשידור חיהדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש חדר ההדמיה אותם הממדים כמו צלחת 6 היטב סטנדרטית. השתמש להוסיף צלחת מתאימה להר קאמרי על הבמה של מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אוטומטי נדרש לתמונת התרבויות במקביל. הגדר את שש עמדות לתמונה בתוכנת confocal. ההגדרות המדויקות יהיו תלויות ביכולת של מיקרוסקופ בשימוש. בדרך כלל Z-מחסנית קטנה (3-5 Z-עמדות לדין וחשבון על כל להיסחף במה) משמשת בכל אחד מ6 העמדות וZ-מחסנית הוא נתפס על כל 2 דקות ל18-24 שעה. עבור יישומים חי הדמיה זה בדרך כלל יתרון לשימוש רחב יותר מאשר הגדרת חריר אופטי אופטימלית לצמצום כוח הלייזר ומספר Z-החלקים הנדרשים. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים שיטה לעור עוברי תרבות שהיא ייחוד נוח הדמיה לחיות תאים במיקרוסקופי confocal הפוכים. השיטה כוללת שיפורים אחרונים שמאפשרים 6 תרבויות להיות צילמו במקביל ומסירה את ההסתמכות על matrigel וקרומים Nuclepore של השיטה המקורית 6. ההבדל הטכני החיוני מטכניקות דומות הוא השימוש בקרום טמבל גז חדיר להקמת ממשק נוזל אוויר וגם לפעול כcoverslip. יש לנו נשמרו בהצלחה התרבויות עם ההדמיה confocal רציפה עד 48 שעה. ברזולוציה הגבוהה ואות מצוינת יחס רעש של תמונות confocal מאפשר מעקב תא אוטומטי כדי לנתח את התנהגות melanoblast בזמן לשגות סרטים וכתוצאה מכך. באמצעות טכניקה זו ניתן לחקור את הדינמיקה של פיזור melanoblast ולחקור את האינטראקציה שלהם עם העור וזקיקי שיער המתפתח. St הקריטיEPS בפרוטוקול הוא לבצע נתיחה זהירה שלא לפגוע באפידרמיס הפיתוח ולעגן את צד עורי דגימות עור מפני agarose ללא פיתולים או מתיחות. ההליך המתואר במאמר זה עובד הכי טוב בין E13.5 וE15.5. לפני E13.5 העור הוא מאוד שביר ואחרי E15.5 זה הוא יחסית עבה וקשה לחדור ידי מיקרוסקופיה confocal. היכולות של מערכת מיקרוסקופ המשמשת הן גם מאוד חשובות. אנחנו בדרך כלל להשתמש במיקרוסקופ confocal ניקון A1R מצויד במערכת של ניקון הקניינית מושלמת פוקוס (PFS). שימוש PFS מקטין באופן משמעותי את מספר הסרטים גרועים שנגרמו על ידי סחיפת במה, מערכות דומות זמינות לפלטפורמות אחרות. אחד חסרונות של שיטה זו הוא הדרישה לציוד תרבות מיוחדת. עם זאת העיצוב הוא פשוט וקאמרי, אפשר להרכיב בקלות על ידי כל סדנה טכנית קטנה. לסיכום אנו מציגים שיטה פשוטה שצריכה להיות בשימוש רחב לstudieים של פיתוח עור עוברי והתנהגות melanoblast. זה צפוי כי הטכניקה יכולה גם להיות שונה לתרחישים אחרים שבם ממשק אוויר נוזלי הוא דרישה לתרבות מוצלחת.

עור באופן מסורתי עוברי כבר בתרבית על ידי לנתח מן עובר העכבר וגובר על קרום Nuclepore פוליקרבונט. הקרום אז ריחף במדיום התרבות, ובכך שמירה על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של רקמת פיתוח 3,4. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי assay התנהגות melanoblast ידי תיקון הרקמות והערכת הפצת melanoblast באמצעות β-galactosidase כסמן 7. פיתחנו שיטה המאפשרת melanoblasts כותרת חי הדמיה של fluorescently בvivo לשעבר תרבות עור 6. כאן אנו מתארים את השיטה בפירוט מנתיחה, להתקנה, לחיות confocal הדמיה וכוללים כמה שיפורים אחרונים. Melanoblasts הם המבשרים העובריים של המלנוציטים, התאים המייצרים פיגמנט בשיער ועור. Melanoblasts להתעורר ברכס העצבי הסמוך לצינור העצבי סביב היום עוברי 9 (E9) בשעה בדואר עכבר הפיתוחmbryo. כתוצאה מכך הם נודדים לאורך מסלול dorsolateral בין האאקטודרם וsomites המתפתח. בE12.5 הם עוברים מהדרמיס לאפידרמיס שבו הם מתרבים וממשיכים ההגירה שלהם. דפוס זקיק השיער הראשוני מתחיל להיווצר באפידרמיס ובE14.5 ידי melanoblasts E15.5 הם לוקליזציה לזקיקים אלה. לסקירה של התפתחות melanoblast / מלנוציט לראות תומאס ואריקסון (2008) 1. כדי לתייג אוכלוסיית melanoblast יש לנו שילוב Tyr :: בעלי החיים CREB המבטאים Cre-recombinase מונעת על ידי האמרגן טירוסינאז העכבר 8 עם חיות R26YFPR המבטאות חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) על תנאי מלוקוס ROSA26 9. אנו מתארים שיטה לתמונות עור ולכידה עוברית תרבות באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך. הוא מותאם צורת השיטה המקורית שתוארה במורט et al. (2010) 6. העכשווישיטה מאפשרת הדמיה בפורמט 6 היטב ומסירה את ההסתמכות על ממברנות Nuclepore ועל matrigel לתמוך בתרבות. במקום באמצעות בלוק קטן של 1% agarose כדי לייצב את העור העוברי. הסרת ההסתמכות על matrigel חשוב במיוחד במצבים שבם התגובה של העור העוברי לגורמי גדילה מסיסים היא המוקד של מחקר. השיטה המקורית שלנו כבר הייתה בשימוש כדי להשיג תובנות חדשות פיתוח melanoblast 10-13 ואנו צופים כי השיפורים שאנו מתארים כאן יעשו את זה חזק יותר כטכניקה ניסויית במיוחד שבו תרבויות מקבילות מרובות הן דרישה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasts הוא הרכס העצבי נגזר מבשרים של מלנוציטים; התאים אחראים לייצור הפיגמנט בעור ושיער. Melanoblasts נודדים דרך האפידרמיס של העובר שבו הם לאחר מכן ליישב את השיער מתפתח זקיקי 1,2. נדידת תאי רכס עצבית היא נחקרה בהרחבה במבחנה, אך בשיטות vivo עדיין לא מפותחות היטב, במיוחד במערכות של יונקים. חלופה אחת היא להשתמש vivo לשעבר תרבות organotypic 3-6. תרבות של עור העוברי של עכבר דורשת התחזוקה של ממשק אוויר נוזלי (עלי) על פני השטח של 3,6 הרקמות. רזולוציה גבוהה לחיות הדמיה של עור העוברי של עכבר כבר הקשתה על ידי חוסר שיטה טובה שלא רק שומרת עלי זה, אלא גם מאפשר לתרבות להיות הפוכה ולכן תואמת עם עדשות אובייקטיביות מרחק עבודה קצר ומיקרוסקופים confocal ביותר. מאמר זה מתאר שיפורים אחרונים לספידOD המשתמש בקרום חדיר גז כדי להתגבר על הבעיות אלה ולאפשר הדמיה confocal ברזולוציה גבוהה של עור עוברי in vivo התרבות לשעבר 6. באמצעות melanoblast Cre-recombinase הספציפית המבטאת קו עכבר בשילוב עם קו כתב R26YFPR אנו יכולים לתייג fluorescently אוכלוסיית melanoblast בתוך תרבויות עור אלה. הטכניקה מאפשרת לחיות הדמיה של melanoblasts והתבוננות בהתנהגות והאינטראקציות עם הרקמה בה הן לפתחם. נציג תוצאות כלולות כדי להדגים את היכולת לחיות תמונת 6 תרבויות במקביל.

איור 2 מציג תוצאות נציג מניסוי זמן לשגות באמצעות עור עוברי מTyr :: CREB x עוברי R26YFPR בE14.5. 6 תרבויות עור עובריים היו הדמיה ידי מיקרוסקופיה confocal כל 2 דקות ל18 שעה. ImageJ חבילת תוכנת ניתוח תמונת התוכנה החופשית היה בשימוש כדי לנתח את ההתנהגות של melanoblasts כותרת YFP בסרטים 6. Melanoblasts היו באופן אוטומטי מעקב באמצעות תוסף wrMTrck שפותח על ידי Jesper Søndergaard פדרסן <a href="http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html">(http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html)</a> תוצאות המעקב מוצגות באיור 2. סרטי 1-3 הוא נציג של הניסוי ו מתאימות ללוחות וג&#39; הם מראים את האור מסור, YFP ונוף מרוכבים בהתאמה. אוכלוסיית melanoblast הנודדת היא יוצא דופן פעילה. תאים לנוע כמעט כל הזמן, ורק להשהות כאשר הם עומדים להתחלק על ידי mitosis. כמו כן ניתן לצפות בהתפתחות של דפוס זקיק השיער העיקרי על פני תקופת התרבות בערוץ האור המועבר (איורים 3A-3X וסרט 1). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51352/51352fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51352/51352fig1.jpg" /> .. איור 1 ציוד והתקנה: בסיס חדר ההדמיה החי מורכב מדיור פרספקס ברור עם ממדים חיצוניים זהים למנת תרבות 6 באר. הוא מכיל שישה חורים שבו 6 מכלולי התא בודדים יכולים חריץ ב &#39;:. להכניס כל אחד כולל 4 רכיבים; סרטון הדמיה, הוספת הדמיה, קרום טמבל, וטבעת O-. קליפ ולהכניס אותם lathed מפלסטיק אצטיל שחור, מצאנו את זה כדי לקבל את autofluorescence הנמוך ביותר של הפלסטיק שבדקנו. O-הטבעת עשויה PVCד משמש כדי לצבוט את הקרום הטמבל על החלק התחתון של להכניס את יצירת ממשק נוזל האוויר (עלי). סרטון ההדמיה (אצטיל השחור) יש כמה חורים כדי לאפשר זרימת של התרבות בינונית C:. הפיר של קליפ המרכזי מתמלא agarose 1% לפני השימוש כדי לספק משטח שטוח מוצק להר העור. העור מחובר לקליפ עם חוט תפר לפני נדחף לתוך להוסיף, הרבדה את העור בין agarose והקרום טמבל. להוסיף לאחר מכן מלא במדיום תרבות D:. כדי לנתח ולטפל בעור העוברי מברשת שיניים אחת זיפים הוא רכוב לתוך חריץ בקצה השטוח של שיפוד קבאב במבוק. זוג מקלות שיער יכול לשמש בשילוב עם מלקחיים בסדר לנתח עור עוברי ולעגן בחדר ההדמיה E:.. תצלומים של הרכיבים המפורטים בAC <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51352/51352fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ</a><html> כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51352/51352fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51352/51352fig2.jpg" /> איור 2. נציג תוצאות של 6 סרטים שהוקלטו במקביל. AF: מעקב אחר תוצאות מ6 סרטים שהוקלטו במקביל ללהדגים את היכולות של המערכת. כל סרט נרשם בנקודות זמן של 2 דקות עבור סכום כולל של 18 שעה (ראה סרטים 1-3 לסרט המקביל של פנלים ו-G). עמדותיהם של התאים במסגרת אחת של הסרט מוצגות ותוצאות המעקב הן על גבי עליון GL:. סיכום של תוצאות המעקב זמם כהתביית מעקב נתונים. &quot;/&gt; D/51352/51352fig3.jpg איור 3 נציג תמונות מהזמן לשגות סרטים של התפתחות זקיק שיער ושל מיטוזה melanoblast עובר AX:.. נבחרת, שנחתך מסגרות מהסרט 1 זקיקי שיער ראשיים להיות גלויים על פני התקופה של תרבות עור 0-18 שעה.. LUT היה מוחל על תמונות A&#39;-X. &#39;: נבחרים, שנחתך מהסרט 2 מסגרות נציג תמונות של melanoblasts הנודד באפידרמיס בפיתוח ובתא בודד (ראה חץ ב.&#39; מיטוזה עוברת) (חץ בT &#39;) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51352/51352fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51352/o_Movie1_YFP.avi" target="_blank">סרט 1:</a> תוצאת נציג של ערוץ האור מועבר מניסוי הזמן לשגות 18-HR. &lt;/ Strong&gt; דפוס שיער הזקיק העיקרי, אם כי לא ברור בתחילת הסרט, הופך בולט יותר ככל שהתרבות מתקדמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51352/o_Movie2_BRIGHT.avi" target="_blank">סרט 2:.</a> תוצאת נציג של ערוץ YFP מניסוי הזמן לשגות 18-HR אוכלוסיית melanoblast היא אוכלוסייה דינמית ונוהגת לנדוד. תאים נייחים נדירים בדרך כלל עוברים מיטוזה (ראו איור 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51352/o_Movie3_COMP.avi" target="_blank">סרט 3:.</a> תוצאת נציג של הערוץ המורכב מ ניסוי הזמן לשגות 18-HR אוכלוסיית melanoblast ניתן לראות להגר בתוך האפידרמיס בפיתוח ובאינטראקציה עם זקיקי שיער המתפתחים.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

ex-vivo-culture-mouse-embryonic-skin-live-imaging-melanoblast

Google

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K Views.  University of Edinburgh.  אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצ...

Video: Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...