העבודה נתמכה על ידי מימון ליבה מהמועצה למחקר הרפואי. אנו מודים לקרייג ניקול להכנת שרטוטים טכניים. אנו מודים למתיו פירסון ופול פרי על תמיכת ההדמיה שלהם.

כל העבודה בבעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות מוסדיות ברישיון על ידי המשרד בבריטניה הבית (מספר רישיון פרויקט PPL 60/3785 ו60/4424). 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית melanoblasts בעור הפיתוח על ידי שילוב של שורה מתאימה Cre-recombinase להביע עכבר עם קו עכבר כתב ניאון. Tyr :: Crea, Tyr :: CREB 8 וWnt1 :: 14 Cre שימש בהצלחה כקווי Cre-לבטא ו 9 R26YFPR כקו כתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התרבות בזרימה למינרית; להשלים הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) עם (פניצילין 1% v v / / סטרפטומיצין), 10% v / v בסרום עוברי עגל ו.584 L-גלוטמין GM / L. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון ההדמיה החיה מתואר באיור 1 לעקר את בסיס חדר הדמיה ידי ניגוב עם 70% אתנול. לעקר מוסיף, סרטוני הדמיה, וטבעות אטימות על ידי השרייה overnight ב70% אתנול. השתמש במכסה סטרילי מצלחת 6 גם את המכסה של התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשטח התחתון של חדר ההדמיה מורכב מקרום טמבל שנערך במקום על ידי O-טבעת (איור 1). התחל עם צלחת טמבלית 35 מ&quot;מ גז חדיר. מניחים את הצלחת על פני חדר ההדמיה ולחתוך את הקרום החדיר הגז בסכין גילוח להב אחד. דחוף את טבעת O על הממברנה כדי לאבטח אותו לחדר ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטוני ההדמיה (6 בסך הכל) מהדקים את העור העוברי במקום (איור 1) לפני השימוש הם חייבים להיות מלאים עם agarose 1%. הכן פתרון 2% agarose עם סטרילי DH 2 O על ידי במיקרוגל וקירור ל60 ° C. מיקס 01:01 עם 10 מדיום תרבות מיליליטר (ראה שלב 2) שחומם מראש ל 60 ° C. לעמוד סרטוני ההדמיה 6 בצלחת 6 היטב סטרילי. לטפטף 1% פתרון agarose למרכז של כל קליפ באמצעות pastette קנס ולאפשר לו להתקרר. הוסף 1 מיליליטר סטרילי PBS הקר היטב כל אחד כדי למנוע אתgarose מהתייבשות. סרטוני ההדמיה יכולים להיות מאוחסנים במשך מספר שעות ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע את ההפרדה העדינה של עור עוברי ולטפל הרקמה גזור להשתמש &quot;שיטת מקל שיער&quot; כפי שמתוארת בKashiwagi et al. 3 במקום להשתמש במקל שיפוד קבאב במבוק יכול לשמש. הפוך חריץ קטן בקצה השטוח של השיפוד באמצעות סכין גילוח להב אחד ולהכניס את מברשת שיניים רכות זיפים. חתוך את השיפוד כך שזה כ 15 סנטימטר באורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ confocal עם תא סביבתי מלא או שלב קאמרי עליון מתן 5% CO 2 באוויר. Prewarm הבמה מיקרוסקופ ל37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני ההדמיה. זה עוזר למנוע סחף מדגם שנגרם על ידי התרחבות של רכיבי הבמה כפי שהם להתחמם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סט רב עמדה באמצעות תוכנת השליטה של ​​מיקרוסקופ כדי שתהיינה אפשר למרכז במהירות ובקלות באמצע של כל תרבות להקים ניסיונילא. </li></ol> 2. נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mate העכברים ולייעד את פוסט יום coitum הראשון כE0.5 יום. בE14.5 היום, לברור את הנקבה על ידי נקע בצוואר הרחם ולחשוף את חלל הגוף על ידי ביצוע חתך קו האמצע קטן, קרע לגזרים את העור לכיוון הראש והזנב ולאחר מכן חיתוך הצפק הבסיסי ומקלף חזרה לכל צד של הגוף. לנתח את הרחם לסטרילי PBS הקר על ידי מחזיק בחוזקה עם מלקחיים וגזרו לאורך mesometrium באמצעות מספריים כירורגיות. שמור הרחם על קרח עד נדרשת. לתיאור מפורט לראות שיאה et al. (2007) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עובר מן הרחם על ידי החיתוך הראשון אורכו של קיר הרחם עם מספריים כירורגיות כדי לשחרר את decidua ולאחר מכן לנתח את העוברים מdecidua ידי קרעת לגזרים אותם עם שני זוגות מלקחיים בסדר. מסך לביטוי כתב ניאון (במידת צורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לברור עוברים על ידי עריפת ראש לפני לנתיחה. Subsequently להסיר את הזנב וגפיים אחורי ולאחר מכן forelimbs באמצעות סכין גילוח להב אחד. לשמור על רקמה לgenotyping אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך בventrum בסמוך לקו האמצע לכיוון rostro-הזנב. שימוש במקלות השיער המתואר בשלב 1.6, להקניט בזהירות את העור מרקמות חיבור הבסיסית מסתובבות העובר באותו הזמן. אל תסיר את העור לחלוטין, אלא להשאיר אותו מחובר יחד רחוק קצה הגחון מהחתך הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חשוב לא לתת לעור להיות דפוק כאז זה מאוד קשה לעלות. כדי למנוע זאת, מיישר את העור באמצעות מקלות שיער (צד עור כלפי מעלה) על פני השטח של צלחת פטרי יבשה ולאחר מכן לחתוך משם מתא המטען העובר באמצעות סכין גילוח להב אחד. צד עורי ניתן להבחין מהצד באפידרמיס על ידי התבוננות זהירה של הצומת בין הרקמה גזור ואת העובר לפני העור הוסר. האזור של הרקמה גזור הואכ 0.5 מ&quot;מ 2 כאשר לנתח עובר E14.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סרטון הדמיה על גבי העור כך שagarose נוגע בצד עורי של הרקמה. אפשר לעמוד ל60 שניות ולאחר מכן בזהירות להקניט את הקצוות של הרקמה עד הצדדים של קליפ. הפוך את הסרטון ולהשתמש בשיער מקלות כדי לשטח את העור ולהסיר את כל בועות אוויר, מקפיד לגעת במשטח של הרקמה (באזור שיהיה צילם) מעט ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט תפר משי לקשור את העור לסרטון ההדמיה באמצעות שני קשרים אצבע פשוטים משני צדדיו של סרטון ההדמיה, כך שהם להדק ולמשוך את העור בחריץ קרוב לחלק העליון של הסרטון. הפוך את הסרטון, לדחוף פנימה את הכנס ההדמיה והמקום בבסיס. מלא להכניס את עם ~ 5 מיליליטר של מדיום התרבות (ראה שלב 1.2). איור 1 מתאר את ההרכבה של חדר ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול ל5 דגימות שנותרו. </li></ol> 3. בשידור חיהדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש חדר ההדמיה אותם הממדים כמו צלחת 6 היטב סטנדרטית. השתמש להוסיף צלחת מתאימה להר קאמרי על הבמה של מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב אוטומטי נדרש לתמונת התרבויות במקביל. הגדר את שש עמדות לתמונה בתוכנת confocal. ההגדרות המדויקות יהיו תלויות ביכולת של מיקרוסקופ בשימוש. בדרך כלל Z-מחסנית קטנה (3-5 Z-עמדות לדין וחשבון על כל להיסחף במה) משמשת בכל אחד מ6 העמדות וZ-מחסנית הוא נתפס על כל 2 דקות ל18-24 שעה. עבור יישומים חי הדמיה זה בדרך כלל יתרון לשימוש רחב יותר מאשר הגדרת חריר אופטי אופטימלית לצמצום כוח הלייזר ומספר Z-החלקים הנדרשים. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים שיטה לעור עוברי תרבות שהיא ייחוד נוח הדמיה לחיות תאים במיקרוסקופי confocal הפוכים. השיטה כוללת שיפורים אחרונים שמאפשרים 6 תרבויות להיות צילמו במקביל ומסירה את ההסתמכות על matrigel וקרומים Nuclepore של השיטה המקורית 6. ההבדל הטכני החיוני מטכניקות דומות הוא השימו?...

עור באופן מסורתי עוברי כבר בתרבית על ידי לנתח מן עובר העכבר וגובר על קרום Nuclepore פוליקרבונט. הקרום אז ריחף במדיום התרבות, ובכך שמירה על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של רקמת פיתוח 3,4. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי assay התנהגות melanoblast ידי תיקון הרקמות והערכת הפצת melanoblast באמצעות β-galactosidase כסמן 7. פיתחנו שיטה המאפשרת melanoblasts כותרת חי הדמיה של fluorescently בvivo לשעבר תרבות עור 6. כאן אנו מתארים את השיטה בפירוט מנתיחה, להתקנה, לחיות confocal הדמיה וכוללים כמה שיפורים אחרונים. Melanoblasts הם המבשרים העובריים של המלנוציטים, התאים המייצרים פיגמנט בשיער ועור. Melanoblasts להתעורר ברכס העצבי הסמוך לצינור העצבי סביב היום עוברי 9 (E9) בשעה בדואר עכבר הפיתוחmbryo. כתוצאה מכך הם נודדים לאורך מסלול dorsolateral בין האאקטודרם וsomites המתפתח. בE12.5 הם עוברים מהדרמיס לאפידרמיס שבו הם מתרבים וממשיכים ההגירה שלהם. דפוס זקיק השיער הראשוני מתחיל להיווצר באפידרמיס ובE14.5 ידי melanoblasts E15.5 הם לוקליזציה לזקיקים אלה. לסקירה של התפתחות melanoblast / מלנוציט לראות תומאס ואריקסון (2008) 1. כדי לתייג אוכלוסיית melanoblast יש לנו שילוב Tyr :: בעלי החיים CREB המבטאים Cre-recombinase מונעת על ידי האמרגן טירוסינאז העכבר 8 עם חיות R26YFPR המבטאות חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) על תנאי מלוקוס ROSA26 9. אנו מתארים שיטה לתמונות עור ולכידה עוברית תרבות באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך. הוא מותאם צורת השיטה המקורית שתוארה במורט et al. (2010) 6. העכשווישיטה מאפשרת הדמיה בפורמט 6 היטב ומסירה את ההסתמכות על ממברנות Nuclepore ועל matrigel לתמוך בתרבות. במקום באמצעות בלוק קטן של 1% agarose כדי לייצב את העור העוברי. הסרת ההסתמכות על matrigel חשוב במיוחד במצבים שבם התגובה של העור העוברי לגורמי גדילה מסיסים היא המוקד של מחקר. השיטה המקורית שלנו כבר הייתה בשימוש כדי להשיג תובנות חדשות פיתוח melanoblast 10-13 ואנו צופים כי השיפורים שאנו מתארים כאן יעשו את זה חזק יותר כטכניקה ניסויית במיוחד שבו תרבויות מקבילות מרובות הן דרישה.

<table><tbody><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Biochrom AG</td><td>F0475</td><td>without phenol red</td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live imaging chamber</td><td>Custom made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lummox dishes</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Single edged razor blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>1244-3170</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biogene</td><td>300-300</td><td></td></tr><tr><td>Fine pastette</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kebab skewers</td><td>Waitrose</td><td></td><td>Bamboo BBQ skewers 30 cm</td></tr><tr><td>Toothbrush</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td>Look</td><td>SP115</td><td>Black silk suture thread</td></tr></tbody></table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasts הוא הרכס העצבי נגזר מבשרים של מלנוציטים; התאים אחראים לייצור הפיגמנט בעור ושיער. Melanoblasts נודדים דרך האפידרמיס של העובר שבו הם לאחר מכן ליישב את השיער מתפתח זקיקי 1,2. נדידת תאי רכס עצבית היא נחקרה בהרחבה במבחנה, אך בשיטות vivo עדיין לא מפותחות היטב, במיוחד במערכות של יונקים. חלופה אחת היא להשתמש vivo לשעבר תרבות organotypic 3-6. תרבות של עור העוברי של עכבר דורשת התחזוקה של ממשק אוויר נוזלי (עלי) על פני השטח של 3,6 הרקמות. רזולוציה גבוהה לחיות הדמיה של עור העוברי של עכבר כבר הקשתה על ידי חוסר שיטה טובה שלא רק שומרת עלי זה, אלא גם מאפשר לתרבות להיות הפוכה ולכן תואמת עם עדשות אובייקטיביות מרחק עבודה קצר ומיקרוסקופים confocal ביותר. מאמר זה מתאר שיפורים אחרונים לספידOD המשתמש בקרום חדיר גז כדי להתגבר על הבעיות אלה ולאפשר הדמיה confocal ברזולוציה גבוהה של עור עוברי in vivo התרבות לשעבר 6. באמצעות melanoblast Cre-recombinase הספציפית המבטאת קו עכבר בשילוב עם קו כתב R26YFPR אנו יכולים לתייג fluorescently אוכלוסיית melanoblast בתוך תרבויות עור אלה. הטכניקה מאפשרת לחיות הדמיה של melanoblasts והתבוננות בהתנהגות והאינטראקציות עם הרקמה בה הן לפתחם. נציג תוצאות כלולות כדי להדגים את היכולת לחיות תמונת 6 תרבויות במקביל.

איור 2 מציג תוצאות נציג מניסוי זמן לשגות באמצעות עור עוברי מTyr :: CREB x עוברי R26YFPR בE14.5. 6 תרבויות עור עובריים היו הדמיה ידי מיקרוסקופיה confocal כל 2 דקות ל18 שעה. ImageJ חבילת תוכנת ניתוח תמונת התוכנה החופשית היה בשימוש כדי לנתח את ההתנהגות של melanoblasts כותרת YFP בס?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

ex-vivo-culture-mouse-embryonic-skin-live-imaging-melanoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K Views.  University of Edinburgh.  אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצ...

Video: Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Bioengineering

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Cancer Research

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented with increasing depth, the incidence rate of cutaneous melanoma has shown a rapid and continuous increase during recent decades. In order to find effective preventative methods, it is important to understand the early steps of melanoma initiation in the skin. Previous data has demonstrated that follicular melanocyte stem cells (MCSCs) in the adult skin tissues can act as melanoma cells of origin when expressing oncogenic mutations and genetic alterations. Tumorigenesis arising from melanoma-prone MCSCs can be induced when MCSCs transition from a quiescent to active state. This transition in melanoma-prone MCSCs can be promoted by the modulation of either hair follicle stem cells&#39; activity state or through extrinsic environmental factors such as ultraviolet-B (UV-B). These factors can be artificially manipulated in the laboratory by chemical depilation, which causes transition of hair follicle stem cells and MCSCs from a quiescent to active state, and by UV-B exposure using a benchtop light. These methods provide successful spatial and temporal control of cutaneous melanoma initiation in the murine dorsal skin. Therefore, these in vivo model systems will be valuable to define the early steps of cutaneous melanoma initiation and could be used to test potential methods for tumor prevention.

The following procedure describes a method for spatial and temporal control of melanocytic tumor initiation in murine dorsal skin, using a genetically engineered mouse model. This protocol describes macroscopic as well as microscopic cutaneous melanoma initiation.

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo הדמיה חיה של חלוקות תא יחיד בNeuroepithelium מאוס

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Neuroscience

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

הר הדמיה שטוחה של עור העכבר ויישומו לניתוח של שיער זקיק דפוסים וחושי אקסון מורפולוגיה

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Immunology and Infection

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

הדמיה חיה של אבות לב מוקדמים בעובר העכבר

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Developmental Biology

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

הדמיה של נדידת נויטרופילים בעור העכבר כדי לחקור עיצוב מחדש של קרום תת-תאי בתנאים פיזיולוגיים

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...