פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה ליצירת תרבויות מלנוציטים ופיברובלסט ראשוניות מעכברים. מכיוון שטכניקה זו אינה דורשת שהאפידרמיס והדרמיס מופרדים, ניתן לבצע אותה במהירות ובעקביות עם אימון מינימלי. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מלנוציטים עוריים וביולוגיה פיברובלסט.
ניסויים בתרבויות אלה יכולים לספק תובנות הרלוונטיות לסרטן, ריפוי פצעים ומומים בפיגמנטציה. לפני תחילת, הקפד להכין את כל reagents הדרושים ולבדוק את הטמפרטורה של אמבט המים. אם בכוונתך לעבד דוגמאות מרובות, עיין במדריך שינוי קנה המידה של הריג'נט בטבלה 1.
הוכחת הליך זה יהיה ברנדון מרפי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. בארון זרימה למינארי, מגלגלים לזמן קצר את תא המטען של כל עכבר בהמתת דם בצלחת פטרי סטרילית המכילה 70% אתנול. מוציאים את העכבר מהאתנול ומניחים אותו בצלחת פטרי סטרילית ריקה.
לאחר מכן, לעקר מספריים כירורגיים ב 70% אתנול. השתמש במספריים אלה כדי לבצע חתך בעור בצד הגחוני של תא המטען, החל מהצוואר וממשיך לזנב. באמצעות מלקחיים סטריליים, לקלף את העור מן תא המטען של העכבר, ולהסיר רקמת שומן עודף מהצד העורי של העור.
מניחים את העור, צד הדרמיס למטה, לתוך צלחת שש גם המכיל שלושה מיליליטר של פתרון אנטימיקוטי אנטיביוטי 1X. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, הפעל את מסוק הרקמות ולהתאים את ההגדרות לאלה המוצגים כאן.
הקפד לנקוט זהירות בעת התקנת להב מסוק הרקמות וכאשר מפעילים את המכונה. מעבירים את העור, צד הדרמיס כלפי מטה, לצלחת מסוק רקמה סטרילית ומעבירים את העור לחלוטין דרך מסוק הרקמות שלוש פעמים. לאחר מכן, להעביר את העור הומוגנית לצינור חרוט סטרילי 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של חיץ עיכול העור.
באמצעות P1000 מיקרו פיפטה, לערבב את ההשעיה וכתוצאה מכך על ידי צינור למעלה ולמטה במרץ 10 עד 15 פעמים. מכסים את הצינור חרוט להדגיר את המדגם באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, הקפד להפוך את הצינור כל שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור רוטור דלי מתנדנד ב 750 פעמים G בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה התאים בעור הומוגנית.
השתמש P1000 מיקרו פיפטה כדי להסיר לאט לחלוטין את מאגר עיכול העור, נזהר לא להפריע גלולה. הקפד שאף את כל מאגר עיכול העור. אם אתה נתקל בבעיות, לשטוף את גלולת התא עם שניים עד שלושה מילים של מדיה melanocyte ולחזור צנטריפוגה ולהסיר עודף חיץ עיכול העור.
ואז ביסודיות resuspend גלולת התא במיליליטר אחד של מדיה melanocyte על ידי צינור למעלה ולמטה 15 עד 20 פעמים עם פיפטה P1000. העבר את הפתרון התא וכתוצאה מכך טיפה חכם ל הבאר לא צותת בצלחת שש גם המכיל מיליליטר אחד של מדיה melanocyte. אין לארוב את העור מצופה הומוגניט באינקובטור תרבות רקמות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 40 דקות.
לאחר מכן, מעבירים את תרבות העל-טבעית מהמנה הלא מצופה ל באר אחת של קולגן מצופה שש היטב. הוסף G-418 לתקשורת, כך הריכוז הסופי הוא 100 ננוגרם למיליליטר. הוסף שני מיליליטר של מדיה fibroblast לבא אחד של המנה לא צותת עכשיו המכיל fibroblasts חסידים.
הדגירה שתי התרבויות לילה באינקובטור תרבות רקמות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 16 עד 24 שעות של דגירה, בנפרד שאפו את התקשורת ואת כל הפסולת מכל תרבות. לשטוף כל מנה פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של PBS עבור כל לשטוף.
לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מדיה מלנוציטים טריים לתרבות המלנוציטים והוסיפו שני מיליליטר של מדיה פיברובלסטית טרייה לתרבות הפיברובלסט. במחקר זה, תרבויות פיברובלסט ומלנוציטים נוצרות בו זמנית מאותה דגימת עור. כאשר העור הומוגני מצופה לראשונה, התקשורת נראית מעוננת.
עם זאת, לאחר הדגירה קונצרנים תא גדול יותר fibroblasts תא חסידים להיות גלוי בצלחת. תאים שאינם חסידים מהתרבות מועברים לצלחת מצופה קולגן ומטופלים ב-G-418. פיברובלסטים שנהרגו על ידי G-418 נראים צפים במדיום תרבות המלנוציטים במשך חמשת הימים הבאים.
לאחר ארבעה עד חמישה ימים בתרבות, המלנוציטים מצופים מתחילים לקחת על פנוטיפ דנדריטי עם גרגירי מלנוציטים. פנוטיפ זה נמשך עם המעבר, בעוד אשכולות של קרטינוציטים מזהמים הולכים לאיבוד. הטוהר של תרבויות המלנוציטים והפיברובלסטים שנוצרות מאושר באמצעות ציטומטריית זרימה.
ביטוי של סמן מלנוציטים GP100 הוא ספציפי לתרבויות melanocyte, בעוד הסמן fibroblast, FSP1, נמצא אך ורק פיברובלסטים העיקריים. תאי בקרה C59 קרטינוציטים הם התרבויות היחידות שמכתימים חיובי עבור סמן קרטינוציטים, K14. ניתוחים נוספים מבוצעים כדי לקבוע כמה זמן לוקח להקים תרבויות מלנוציטים מועשרות.
תאים חיוביים GP100 מתחילים להופיע ביום הרביעי ואת השיא לאחר 10 ימים בתרבות. הליך זה יכול לשמש כדי ליצור במהירות מלנוציטים ותרבויות fibroblast עבור מגוון רחב של במבחנה ו assays תפוקה גבוהה.
