仕事は医学研究評議会からのコア資金によってサポートされていました。我々は技術的な図面を製造するためのクレイグニコルに感謝しています。我々は彼らのイメージングをサポートするためのマシュー·ピアソン、ポール·ペリーに感謝しています。

全ての動物作業は、英国内務省（プロジェクトライセンス番号PPL 3785分の60および4424分の60）によってライセンスの下で施設のガイドラインに準じて行った。 1。準備<ol><li> CREB 8とのWnt1 :: Creを 14は、Cre発現ラインとして成功裏に使用されている:: CREA、Tyrの:: Tyrの蛍光レポーターマウス系統との適切なのCreリコンビナーゼを発現するマウス系統を組み合わせて開発した皮膚におけるメラノブラストにラベルを付け、リポーターラインとしてR26YFPR 9。 </li><li>層流フード内の培養液を準備します。 （1％v / vのペニシリン/ストレプトマイシン）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補う、10％v / vのウシ胎児血清および0.584グラム/ LのL-グルタミン。 </li><li>ライブイメージング装置は70％エタノールで拭くことにより、撮像チャンバ·ベースを滅菌し、図1に概説されている。 OVを浸漬することによって挿入、撮像クリップ、およびO-リングを滅菌70％エタノール中ernight。チャンバーの蓋として6ウェルプレートから無菌の蓋を使用してください。 </li><li>撮像チャンバーの底面は、O-リング（ 図1）によって適所に保持不器用な人膜からなる。 35ミリメートルのガス透過性のろまディッシュで始まります。イメージングチャンバーの上の皿を置き、片刃かみそりの刃で気体透過膜をカット。イメージング室に固定した膜の上にOリングを押してください。 </li><li>画像クリップ（合計6）が所定の位置に胚性皮膚使用の前に、彼らは1％アガロースで満たされなければならない（ 図1）をクランプします。 60℃に電子レンジと冷却することにより、無菌のdH 2 Oでアガロースの2％溶液を準備しますを10mlの培地との混合1:1（ステップ2を参照）を60℃に予熱滅菌した6ウェルプレート中で6撮像クリップスタンド。微細pastetteを使用して、各クリップの中央に1％アガロース溶液を垂らし冷却する。 αを防止するために各ウェルに1ミリリットル冷滅菌PBSを追加乾燥からgarose。撮像クリップは、PBS中で数時間保存することができる。 </li><li>胚皮膚の繊細な分離を実施することとする代わりに竹のケバブ串を使用できる箸を使用するのでは、柏木ら 3で説明したように解剖し、組織が ​​「ヘアスティック方式&#39;を使用処理する。片刃カミソリの刃を使用して串の平らな端の小さなスリットを作り、毛柔らかい歯ブラシを挿入します。それは、長さが15cm程度になるように串をトリミング。 </li><li>空気中のCO 2 5％を提供する完全な環境室やステージトップ室と共焦点顕微鏡を使用してください。撮像前に、少なくとも1時間、37℃に顕微鏡ステージを予熱し。これは、ウォームアップ、ステージ構成要素の膨張によるサンプルのドリフトを防ぐことができます。 </li><li> 1は、迅速かつ容易にexperimenを設定するために、各文化の真ん中を中心にできるように、顕微鏡の制御ソフトウェアを使用してマルチポジションセットを準備しますT。 </li></ol> 2。手順<ol><li>マウスを嵌合させ、日E0.5として初日ポスト交尾を指定します。日E14.5で、頚椎脱臼により女性を間引くと、小さな正中切開を作る頭と尾に向けて皮を引き離すと、基になる腹膜を切断し、後身頃の両側に剥がすことで体腔を公開します。ピンセットでしっかりと保持し、外科はさみを使用して子宮間膜に沿って切り取ることで冷滅菌PBSに子宮を解剖。必要になるまで氷上で子宮を保つ。詳細については、シェイら （2007）15を参照してください。 </li><li>第一の微細鉗子二対でそれらを引き離すことによって脱落膜を解放するために、外科用ハサミで子宮壁の長さに切断し、次いで、脱落膜から胚を解剖することによって子宮から胚を解剖する。蛍光レポーター発現（必要な場合）のための画面が表示されます。 </li><li>解剖の前に断頭により胚を間引く。 SUBSequently尾を削除し、手足や片刃カミソリの刃を使用して、その後前肢後肢。必要に応じて、遺伝子型判定のための組織を保持します。 </li><li>吻側 - 尾側方向に正中線に近いventrumに切開する。ステップ1.6で説明した髪スティックを使用して、慎重に同時に胚を回転下にある結合組織から肌を離れていじめる。完全に皮膚を除去ではなく、最初の切開部から腹側のエッジ遠い沿って取り付け、それを放置しないでください。 </li><li>それはそれからマウントすることは非常に困難であるようになって肌がめちゃくちゃにさせないことが重要です。これを防ぐには、乾いたシャーレの表面に毛が付いています（真皮側を上にして）を使用して、肌を平らにしてから片刃カミソリの刃を使用して、離れて胚幹から切る。皮膚が除去される前に真皮側を切開し、組織および胚との間の接合部の注意深い観察により表皮側から区別することができる。切開した組織の領域である約0.5mm 2 E14.5胚を解剖。 </li><li>アガロースが組織の真皮側に触れているように、皮膚の上に画像クリップを配置します。 60秒間放置した後、慎重にクリップの側面まで組織の縁をいじめることができます。クリップを反転し、毛が肌を平らにし、極力（画像化される領域に）組織の表面に触れるように注意しながら、任意の気泡を除去するためにスティックを使用します。 </li><li>彼らは締めとクリップの上部に近い溝に皮膚を引っ張るように、イメージング·クリップの両側に二つの簡単な親指の結び目を用いた撮像クリップに肌を結ぶために絹の縫合糸を使用しています。クリップを反転、画像挿入とベース内の場所の中に押し込みます。 （ステップ1.2を参照）の培地〜5ミリリットルで挿入を埋める。 図1は、撮影室のアセンブリの概要を説明します。 </li><li>残りの5個のサンプルのプロトコルを繰り返します。 </li></ol> 3。ライブイメージング<ol><li>撮像チャンバは、標準的な6ウェルプレートと同じ寸法を有する。共焦点顕微鏡のステージ上のチャンバを取り付けるために、適切なプレートインサートを使用してください。 </li><li>自動化されたステージは、並行して培養物をイメージするために必要です。共焦点ソフトウェアイメージへの6つの位置を定義します。正確な設定は、使用される顕微鏡の能力に依存します。典型的には、小さなzスタックは、（3-5 z位置は、任意のステージのドリフトを考慮するため）6位のそれぞれで使用され、zスタックは、18〜24時間、2分毎に捕捉される。ライブイメージング用途のためには、レーザー出力と必要なz軸部の数を減らすために光学的に最適なピンホールよりも広く設定を使用することが一般に有利である。 </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

私たちは、倒立型共焦点顕微鏡をONに生細胞イメージング従順特殊性である文化、胚、皮膚への方法を記載している。この方法は、6文化が並行して画像化し、マトリゲルと元のメソッド6のヌクレポアメンブレンへの依存を削除することを可能にする最近の改善が含まれています。類似の技術からの重要な技術的違いは、空気液体界面を確立するとともに、カバースリップとして作用?...

伝統的に、胚皮膚は、マウスの胚から解剖し、ポリカーボネートヌクレポア膜上に搭載することによって培養されています。次いで、膜をこのように発達中の組織3,4の表面にわたって空気-液体界面を維持し、培養培地に浮遊される。この技術は、組織を固定し、マーカ7のようにβ-ガラクトシダーゼを用いたメラノブラスト分布を評価することによってメラノブラスト挙動をアッセイするために使用されている。私たちは、ex vivoで皮膚培養6における蛍光標識されたメラノブラストのライブイメージングを可能にする方法を開発した。ここでは、共焦点イメージングを生きるために、セットアップに、解剖から詳細に方法を説明し、いくつかの最近の改善が含まれています。 メラノブラストは、メラノサイトの胚性前駆体、髪や肌に色素を産生する細胞である。メラノブラストは、発達中のマウス（e）で胎生9（E9）付近で神経管に隣接した神経堤で発生mbryo。その後彼らは、外胚葉と発展体節間の背側の経路に沿って移動する。 E12.5で彼らは増殖し、その移行を続行表​​皮に真皮から移動する。主な毛包のパターンはE14.5で表皮に形成し始めるとE15.5のメラノブラストすることにより、これらの卵胞にローカライズされています。メラノブラスト/メラノサイト開発のレビューのためにトーマス·エリクソン（2008年）1を参照してください。メラノブラストの人口を標識するために、我々は、Tyrを組み合わせている::条件付きでROSA26遺伝子座 9から黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現R26YFPR動物とマウスチロシナーゼプロモーター8によって駆動のCre-リコンビナーゼを表現CREB動物。 私たちは、倒立型共焦点顕微鏡を用いて培養、胚、皮膚や撮影画像にする方法を説明します。それは、モートらに記載の元の方法。（2010年）6形に構成されている。現在この方法は、6 - ウェルフォーマットで画像化を可能にし、ヌクレポア膜上や文化を支援するマトリゲルへの依存を削除します。代わりに、胚の皮膚を安定させるために1％アガロースの小ブロックを用いた。マトリゲルへの依存を削除しても、特に水溶性の成長因子に対する胚の皮膚の応答が研究の焦点である状況では重要である。当社独自の方法では、すでにメラノブラスト開発10月13日に新たな洞察を得るために使用されており、我々は我々がここで説明する改善が複数の並列文化が要件で、特に実験手法として、それがより強力になると予想している。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

メラノブラストは、メラニン細胞の神経堤に由来する前駆体である;皮膚及び毛髪における顔料の製造に関与する細胞である。メラノブラストは、彼らはその後、発展途上毛包1,2にコロニーを形成する胚の表皮を通って移動。神経堤細胞の移動が盛んにin vitroで検討されているが、in vivo法でまだよく、特に哺乳動物系では、開発されていない。一つの選択肢は、ex vivoでの器官培養3-6を使用することです。マウス胎児の皮膚の培養組織3,6の表面を横切って気液界面（ALI）のメンテナンスを必要とします。マウス胎児の皮膚の高解像度ライブイメージングは​​、このALIを維持だけでなく、文化が反転し、したがって、短い作動距離の対物レンズと、ほとんどの共焦点顕微鏡と互換性があることを可能にするだけでなく、良い方法がないことによって妨げられてきた。この記事では、メタへの最近の改善について説明しますこれらの問題を克服し、ex vivoで培養中の胚の皮膚6の高分解能共焦点イメージングを可能にするガス透過性膜を使用して外径。 R26YFPRレポーターラインと組み合わせるメラノブラスト特定のCreリコンビナーゼ発現するマウスラインを使用して、我々は、蛍光これらの皮膚の培養内メラノブラストの人口にラベルを付けることができます。技術はメラノブラスト、彼らが開発している組織と彼らの行動や相互作用の観察のライブイメージングを可能にする。代表的な結果を並列に6の文化をイメージ生きる能力を実証するために含まれる。

図2は、Tyrからの胚性スキンを使用して時間経過の実験からの代表的な結果を示しています:: CREBは E14.5でR26YFPR胚をX。 6胚性皮膚培養物を18時間ごとに2分、共焦点顕微鏡で画像化した。フリーウェアの画像解析ソフトウェアパッケージImageJの6映画のYFP-標識メラノ​​ブラストの挙動を分析した。メラノブラストは自動的に（イェスパーSøndergaardペダー?...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

我々は、マウス胚の皮膚の切開およびex vivoでの文化について説明します。培養系は、組織表面を横切って気液界面を維持し、倒立顕微鏡でイメージングを可能にする。メラノブラスト、現像皮膚の成分は、それらの蛍光挙動は、共焦点顕微鏡を用いて観察することを可能に標識される。

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

ex-vivo-culture-mouse-embryonic-skin-live-imaging-melanoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K ビュー.  University of Edinburgh. 我々は、マウス胚の皮膚の切開およびex vivoでの文化について説明します。培養系は、組織表面を横切って気液界面を維持し、倒立顕微鏡でイメージングを可能にする。メラノブラスト、現像皮膚の成分は、それらの蛍光挙動は、共焦点顕微鏡を用いて観察することを可能に標識される。 