Die Arbeit wurde durch die Grundfinanzierung von der Medical Research Council unterstützt. Wir sind dankbar, dass Craig Nicol für die Herstellung von technischen Zeichnungen. Wir sind dankbar, dass Matthew Pearson und Paul Perry für ihre Imaging-Unterstützung.

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter Lizenz von der britischen Home Office (Projektlizenznummer PPL 60/3785 und 60/4424) durchgeführt. 1. Vorbereitung <ol><li> Beschriften Sie die Melanoblasten in der Entwicklung von Haut durch die Kombination eines geeigneten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie mit einem fluoreszierenden Reportermauslinie. :: CreA Tyr, Tyr :: CREB 8 und Wnt1 :: Cre 14 erfolgreich als Cre-exprimierenden Linien eingesetzt und R26YFPR 9 als Reporter Linie. </li><li> Bereiten Sie das Kulturmedium in einer Steril; Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit (1% v / v Penicillin / Streptomycin), 10% v / v fötales Kälberserum und 0,584 g / l L-Glutamin. </li><li> Die Live-Bildgebungsgerät ist in Abbildung 1 skizziert Sterilisieren Sie die Imaging-Kammer Basis durch Abwischen mit 70% Ethanol. Sterilisieren Sie die Einsätze, Imaging-Clips und O-Ringe durch Einweichen overnight in 70% Ethanol. Eine sterile Abdeckung aus einer Platte mit 6 Vertiefungen, wenn der Deckel der Kammer. </li><li> Die Bodenfläche des Bilderzeugungskammer aus einem lummox Membran anstelle von einem O-Ring (1) gehalten wird. Beginnen Sie mit einer 35-mm-gasdurchlässige lummox Gericht. Die Schale über den Imaging-Kammer und schneiden Sie die gasdurchlässige Membran mit einer einzigen Rasierklinge. Schieben Sie den O-Ring über der Membran, um es in der bildgebenden Kammer zu sichern. </li><li> Die bildgebenden Clips (6 insgesamt), klemmen die embryonalen Haut statt (Abbildung 1) vor dem Gebrauch müssen sie mit 1% Agarose gefüllt werden. Vorbereitung einer 2% igen Lösung von Agarose mit sterilem dH 2 O durch Mikrowellenbehandlung und Abkühlen auf 60 ° C. Mischung 1:1 mit 10 ml Kulturmedium (siehe Schritt 2) auf 60 ° C vorgewärmt Stehen die sechs Bildclips in eine sterile 6-Well-Platte. Drip der 1% igen Lösung in der Mitte jeder Clip mit einem feinen pastette und abkühlen lassen. 1 ml kaltem sterilem PBS in jede Vertiefung, die ein zu verhinderngarose Austrocknen. Die Abbildungs ​​Clips kann mehrere Stunden in PBS gelagert werden. </li><li> Zur Durchführung der Trennung von empfindlichen embryonalen Haut und in der Handhabung der sezierten Gewebe verwenden Sie den &quot;Haar-Stick-Methode &#39;, wie in Kashiwagi et al. 3 Statt mit einem Ess-Stäbchen eine Bambus-Kebab-Spieß kann verwendet werden, beschrieben. Machen Sie einen kleinen Schlitz in dem flachen Ende des Spießes mit einer einzigen Rasierklinge und legen Sie eine weiche Zahnbürste Borsten. Schneiden Sie den Spieß, so dass es etwa 15 cm in der Länge. </li><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einer vollständigen Klimakammer oder inszenieren oberen Kammer bietet 5% CO 2 in der Luft. Vorwärmen des Mikroskoptisches auf 37 ° C für mindestens 1 Stunde vor der Bilderzeugung. Dies hilft, Probe Drift durch Erweiterung der Bühne Komponenten zu vermeiden, wie sie aufzuwärmen. </li><li> Bereiten Sie eine Multi-Positions-Satz über die Steuerungssoftware des Mikroskops, so dass man schnell und einfach zu zentrieren auf der Mitte einer jeden Kultur die Einrichtung eines Versuchst. </li></ol> 2. Vorgehen <ol><li> Kamerad die Mäuse und bezeichnen den ersten Tag post coitum als Tag E0.5. Am Tag E14.5, filtern das Weibchen durch Genickbruch und setzen die Körperhöhle mit einem kleinen Mittellinienschnitt, Auseinanderziehen der Haut in Richtung Kopf und Schwanz und dann schneiden die zugrunde liegende Bauchfell und läuten wieder auf beiden Seiten des Körpers. Präparieren Sie die Gebärmutter in kalte sterile PBS durch Halten mit einer Zange fest und schnippeln entlang der Mesometrium Verwendung von chirurgischen Schere. Halten Sie die Gebärmutter auf Eis, bis sie benötigt. Für eine detaillierte Beschreibung siehe Shea et al. (2007) 15. </li><li> Dissect Embryonen aus der Gebärmutter, indem zuerst die Länge der Gebärmutterwand mit chirurgischer Schere, um die Decidua freizugeben und dann sezieren die Embryonen aus der Dezidua, indem Sie sie heraus mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Bildschirm fluoreszierenden Reporter-Expression (falls erforderlich). </li><li> Cull Embryonen durch Enthauptung vor der Dissektion. Subsequently entfernen Sie den Schwanz und Hinterbeine und dann die Vorderbeine mit einer einzigen Rasierklinge. Bewahren Gewebe zur Genotypisierung, wenn erforderlich. </li><li> Einen Einschnitt in der ventrum in einer rostro-kaudale Richtung nahe der Mittellinie. Mit Hilfe der in Schritt 1.6 beschrieben Haar-Sticks, sorgfältig zu necken entfernt die Haut vor dem Drehen des Embryo in der gleichen Zeit zugrunde liegenden Bindegewebe. Sie die Haut vollständig entfernen nicht, sondern lassen Sie es entlang der ventralen Rand weitesten vom ersten Schnitt angebracht. </li><li> Es ist wichtig, die Haut wird oben geschraubt, wie es ist dann sehr schwierig zu montieren zu lassen. Um dies zu verhindern, glätten die Haut mit Hilfe der Haar-Sticks (Hautseite nach oben) auf der Oberfläche eines trockenen Petrischale und dann schneiden Sie aus dem Embryo Stamm mit einer einzigen Rasierklinge. Die dermale Seite von der epidermalen Seite durch sorgfältige Beobachtung der Verbindung zwischen dem sezierten Gewebe und der Embryo unterscheiden, bevor der Haut entfernt werden. Die Fläche des sezierten Gewebeca. 0,5 mm 2, wenn Sezieren eines E14.5 Embryos. </li><li> Platzieren eines Abbildungs ​​Clip auf der Haut, so daß die Agarose Berühren der dermalen Seite des Gewebes. Lassen Sie für 60 Sekunden stehen gelassen und dann sorgfältig zu necken die Kanten des Gewebes an den Seiten des Clips. Kehren Sie den Clip und verwenden Sie das Haar klebt zu glätten die Haut und entfernen Sie alle Luftblasen, kümmert sich um die Oberfläche des Gewebes (in dem Bereich, der abgebildet wird), so wenig wie möglich zu berühren. </li><li> Verwenden Seide Faden, um die Haut auf die Abbildungs ​​Clip binden mit zwei einfachen Daumen Knoten auf beiden Seiten des Bildclip, so dass sie zu straffen und ziehen Sie die Haut in die Nut der Nähe der Spitze des Clips. Kehren Sie den Clip, Push innerhalb des Abbildungseinsatz und in der Basis. Füllen des Einsatzes mit ~ 5 ml Kulturmedium (siehe Schritt 1.2). Abbildung 1 beschreibt den Aufbau der Abbildungskammer. </li><li> Wiederholen Protokoll für die verbleibenden 5 Proben. </li></ol> 3. LebenImaging <ol><li> Die Abbildungskammer hat die gleichen Abmessungen wie ein Standard-6-Well-Platte. Verwenden Sie eine geeignete Platteneinsatz, um die Kammer auf der Bühne des konfokalen Mikroskops befestigen. </li><li> Eine automatisierte Stufe ist mit Bild die Kulturen parallel erforderlich. Definieren Sie die sechs Positionen, um Bild in der konfokalen Software. Die genauen Einstellungen werden auf der Fähigkeit des verwendeten Mikroskops ab. Typischerweise ein kleiner Z-Stapel (3-5 z-Positionen, für jede Stufe Drift zu berücksichtigen) ist in jedem der 6-Stellung verwendet wird und eine z-Stapel wird alle 2 min für 18-24 h erfasst. Für Live-Abbildungsanwendungen in der Regel ist es vorteilhaft, eine größere als optisch optimale Lochblende Einstellung verwenden, um Laserleistung und die Anzahl von Z-Profilen zu reduzieren. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. 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S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut, die Besonderheit zugänglich Live-Cell-Imaging auf invertierten konfokalen Mikroskopen ist. Das Verfahren umfasst die jüngsten Verbesserungen, die sechs Kulturen parallel abgebildet werden und beseitigt die Abhängigkeit von Matrigel und Nuclepore Membranen der ursprünglichen Methode 6 ermöglichen. Der entscheidende technische Unterschied von ähnlichen Techniken ist die Verwendung einer gasdurchlässigen Membran lummox, eine Luftschnittstelle Flü...

Traditionell embryonalen Haut durch Sezieren von der Maus Embryo und die Montage auf einem Polycarbonat Nuclepore Membran kultiviert. Die Membran wird dann auf Kulturmedium schwimmen, damit die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf der Oberfläche der Entwicklungs Gewebe 3,4. Diese Technik wurde verwendet, um Melanoblasten Verhalten durch Fixieren des Gewebes und der Beurteilung Melanoblasten Verteilung mit β-Galactosidase als Markierungs 7 testen. Wir haben eine Methode, die Live-Imaging von fluoreszenzmarkierten Melanoblasten in ex vivo Hautkultur 6 ermöglicht. Hier beschreiben wir die Methode im Detail von der Dissektion zu gründen, um die konfokale Bildgebung und umfassen einige der jüngsten Verbesserungen. Melanoblasten sind die embryonalen Vorstufen der Melanozyten, die Zellen, die Pigment im Haar und Haut. Melanoblasten entstehen in der Neuralleiste neben dem Neuralrohr bei rund embryonalen Tag 9 (E9) in der Entwicklung von e-Mausmbryo. Anschließend wandern sie entlang einer dorsolateralen Weg zwischen Ektoderm und den Entwicklungs Somiten. Bei E12.5 sie aus der Dermis zu bewegen, um die Epidermis, wo sie sich vermehren und setzen ihre Migration. Der primäre Haarfollikel Muster beginnt in der Epidermis bei E14.5 und E15.5 durch Melanoblasten werden, um die Lokalisierung dieser Follikel zu bilden. Für einen Überblick über Melanoblasten / Melanozyten-Entwicklung zu sehen Thomas &amp; Erickson (2008) ein. Um die Bevölkerung Melanoblasten beschriften wir Tyr kombiniert :: CREB Tiere, die Cre-Rekombinase-von der Maus Tyrosinase-Promotor mit 8 R26YFPR Tiere, die gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bedingt von der ROSA26 Locus 9 auszudrücken angetrieben auszudrücken. Wir beschreiben ein Verfahren zur Kultur embryonaler Haut und die Aufnahmen mit einem inversen konfokalen Mikroskop. Es wird in der Form angepasst Mort et al ursprünglichen Methode. (2010) 6. Die vorliegendeVerfahren ermöglicht die Abbildung in einer 6-Well-Format und entfernt die Abhängigkeit von Nuclepore Membranen und auf Matrigel, um die Kultur zu unterstützen. Statt mit einem kleinen Block von 1% Agarose, um die embryonale Haut zu stabilisieren. Entfernen der Abhängigkeit von Matrigel ist besonders in Situationen, in denen die Reaktion der embryonalen Haut löslichen Wachstumsfaktoren im Mittelpunkt der Untersuchung wichtig. Unsere ursprüngliche Methode wurde bereits verwendet worden, um neue Einblicke in die Entwicklung Melanoblasten 10-13 zu gewinnen, und wir erwarten, dass die Verbesserungen, die wir hier beschreiben, wird es stärker als experimentelle Technik vor allem, wenn mehrere parallele Kulturen sind eine Voraussetzung zu machen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasten sind die Neuralleiste Vorläufer von Melanozyten; die Zellen zur Herstellung des Pigments in Haut-und Haar verantwortlich. Melanoblasten wandern durch die Epidermis des Embryos, wo sie anschließend besiedeln die Entwicklungs Haarfollikel 1,2. Neuralleiste Zellmigration wird weitgehend in vitro untersucht, aber in vivo-Methoden sind immer noch nicht gut entwickelt, vor allem in Säugetiersystemen. Eine Alternative ist die ex vivo organotypischen Kultur 6.3 zu verwenden. Kultur von embryonalen Maus-Haut erfordert die Aufrechterhaltung eines Luft-Flüssigkeits-Interface (ALI) über die Oberfläche des Gewebes 3,6. Hochauflösende Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Haut hat sich durch den Mangel an einer guten Methode, die nicht nur unterhält diese ALI, sondern ermöglicht auch die Kultur umgekehrt werden und daher mit kurzen Arbeitsabstand und die meisten Objektive konfokalen Mikroskopen behindert. Dieser Artikel beschreibt die jüngsten Verbesserungen an einen Method dass verwendet eine gasdurchlässige Membran, diese Probleme zu überwinden und hochauflösenden konfokalen Imaging der embryonalen Haut in Ex-vivo-Kultur 6. Durch die Verwendung eines spezifischen Melanoblasten Cre-Rekombinase exprimierenden Mauslinie in Kombination mit der R26YFPR Reporter Linie sind wir in der Lage, innerhalb dieser Hautkulturen fluoreszenz beschriften Sie die Melanoblasten Bevölkerung. Die Technik ermöglicht Live-Bildgebung von Melanoblasten und der Beobachtung ihres Verhaltens und ihrer Wechselwirkungen mit dem Gewebe, in dem sie sich entwickeln. Repräsentative Ergebnisse sind enthalten, um die Fähigkeit zu leben-Bild 6 Kulturen parallel zu demonstrieren.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus einer Zeitraffer-Experiment mit embryonalen Haut von Tyr :: CREB x R26YFPR Embryonen E14.5. 6 embryonale Hautkulturen wurden durch konfokale Mikroskopie 18 Stunden abgebildet alle 2 min. Die Freeware-Bildanalyse-Software ImageJ wurde verwendet, um das Verhalten der YFP-markierte Melanoblasten in den sechs Filmen zu analysieren. Die Melanoblasten waren mit der wrMTrck Plugin von Jesper Pedersen entwickelt Søndergaard (automatisch verfolgt <a href...

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Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K Aufrufe.  University of Edinburgh.  Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden. 