Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

המחברים תודה נדין Woitasky, פיטר וולק לקבלת סיוע טכני. בנוסף, המחברים מודים גב' קלאודיה לורנץ (הסופר רפואי, ACCEDIS) על עזרתה בהכנת כתב היד. כתב יד זה היה בתמיכתם מאת DFG (Schlu 324/7-1).

החקירה התנהלה על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה שפרסם את בנו המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). באופן כללי, חולדות wistar גברים בגילאי 3-4 חודשים, במשקל ממוצע של 250-350 גר' משמשים עבור פרוטוקול זה. לב עכברוש אחד מספיקה עבור 20 מנות התרבות (1 מ"ל לכל מאכל; הקוטר הפנימי: 35 מ מ) עם צפיפות תאים משוער של 1.5 x 10 4 תאים/1000 מ מ 2-
 1. הכנה של מדיה, ריאגנטים <ol><li>בינוני קריאטין-קרניטין-טאורין (CCT בינוני) הערה: CCT בינוני הוא מדיום מורכבות בהתבסס על בינוני 199 עם התוספת של קריאטין, קרניטין, טאורין.
	<ol><li>L להכין 1 בינוני 199: להוסיף 3.6 g Hepes ומיקס לשעה. לאחר מכן להוסיף מ"ג 655.5 קריאטין (5 מ מ), 395.4 mg קרניטין (2 מ מ) ו- 625.5 mg טאורין (5 מ מ). קרניטין טאורין שינוי ה-pH ל &#60; 7. על מנת לעכב את הצמיחה של תאים מזהמים, למשל תאי אנדותל או fibroblasts, להוסיף 10 מיקרומטר ציטוזין β-D-arabinofuranoside המדיום. להתאים את ה-pH עם NaOH (2 מ מ) למסנן 7.4 וסטרילי המדיום. לאחסן המדיום CCT ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>פאוול בינוני <ol><li>בינוני 1 L פאוול, להמיס 6.43 g NaCl (110 מ"מ) עם 0.19 גרם אשלגן כלורי (2.5 מ מ), 0.16 g ח' 2 PO 4 (1.2 מ מ), 0.3 g MgSO 4 7 שעות 2 O (1.2 מ מ), 5.96 g Hepes (25 מ מ), ו- 1.98 g D (+ )-גלוקוז monohydrate (10 מ מ) ב- Aqua סטרילי. להתאים את ה-pH עם NaOH (ז 2) למסנן 7.4 וסטרילי המדיום. חנות בינונית פאוול ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>סידן כלורי (2 CaCl) <ol><li>להכין פתרון 100 מ מ CaCl 2 (50 מ"ל) ולהכין aliquots המכיל 500 µL CaCl 2. להקפיא aliquots ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>הכנה של תרבות בינוני <ol><li>להכין שלוש תא תרבות מדיומים: מראש ציפוי בינוני ציפוי בינוני, בינוני כביסה. השתמש CCT בינוני כבסיס עבור כל שלושה מדיומים (טבלה 1). לחשב CCT בינוני עם 1 מ"ל לכל מאכל תרבות. לכן, להתכונן 20 מ"ל CCT בינוני 20 מנות תרבות (הקוטר הפנימי: 35 מ מ)-</li>
		<li>תא תרבות צלחות: מעיל שהלוח התרבות התא (הקוטר הפנימי: 35 מ מ) עם 1 מ"ל מראש ציפוי בינוני. חנות את הלוחיות מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או כבר לפחות שעתיים לפני השימוש.</li>
	</ol></li></ol> 2. בידוד של Cardiomyocytes למבוגרים <ol><li>מערכת זלוף הכנה של Langendorff <ol><li>תרמי יופיצ בינונית, כביסה בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס Defreeze שפופרת של 500 µL CaCl 2, שוקלים 25 מ ג של collagenase.</li>
		<li>מיושרות מערכת זלוף Langendorff עם אקווה סטרילי, לאחר מכן תן בינוני פאוול הפיצו את המערכת עבור 5 דק.</li>
		<li>למלא את המערכת זלוף Langendorff 80 מ ל פאוול בינונית ללא כל האוויר בועות גז המדיום עם 95% חמצן.</li>
		<li>להכין צינור (50 מ"ל) עם 40 מ"ל פאוול בינונית מחממים אותו ל- 37 ° C, גז זה עם 95% חמצן.</li>
		<li>להתכונן חוט של בערך 25 ס מ אורך הצמדת בלב מוסרים הצינורית.</li>
		<li>Degrease סכין גילוח עם אלכוהול (70% לפי נפח) ותחברי אותו למסוק. מלחציים דיסק מפלסטיק לתוך המסוק.</li>
	</ol></li> <li>החילוץ של הלב <ol><li>עזים ומתנגד חולדה זכר wistar עם 4-5% איזופלוריין, להקריב אותו עם נקע בצוואר הרחם. לפתוח את הבטן מאחורי הקשת costal עם הטיה הבטן, עם אותו זוג מספריים, לחתוך דרך הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה.</li>
		<li>להסיר את הלב, יחד עם ריאות של בלוטת התימוס, על ידי חיתוך מעל בלוטת התימוס הגולגולת מאוד בחלל בית החזה. להעביר את החומר תמיסת כקרח מיד.</li>
		<li>להסיר את הריאות ואת בלוטת התימוס מהלב עם מספריים ויבתר (גדול) ולהעביר על ידי קיבעון החומר עם מלקחיים קפסולה, לאחרון פתרון מלוחים חדש.</li>
	</ol></li> <li>בידוד <ol><li>להסיר עודפי רקמת, כמו שאריות של בלוטת התימוס, קנה הנשימה, שומן, רקמת חיבור מהלב באמצעות מלקחיים קפסולה מספריים ויבתר (גדול או קטן). לחשוף את העורקים ולסיים עם מספריים ויבתר (גדול או קטן) בין אדריכל הראשון ואת השני branchial</li>
		<li>מתחיל טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. מקום בלב-הצינורית של מערכת זלוף Langendorff, שמלמדות את זה קודם. עם מלחציים תנין ומאוחר יותר עם החוט מוכן. לשטוף את הלב עד שיתפנה דם.</li>
		<li>לפזר 25 מ ג Collagenase במדיום פאוול חמים 5-6 מ"ל ולהוסיף 12.5 µL CaCl 2 (30 מיקרומטר).</li>
		<li>לסגור את זרימת הדם על ידי הזזת משפך זכוכית, אשר מחובר עם מערכת זלוף Langendorff, על לבו טפטוף ולהוסיף collagenase פתור את המערכת זלוף. נתחיל את זלוף במשך 25 דקות מהירות ירידה של טיפה 1 לשניה. 
		הערה: במהלך זלוף, הלב להתנפח ולקבל מראה שעווה.</li>
		<li>לעצור את זלוף לאחר 25 דקות ולהסיר את הלב מתוך מערכת זלוף Langendorff. הסר את העורקים אטריה, רקמת חיבור מהלב ולפתוח החדרים ימינה ושמאלה.</li>
		<li>חותך את הלב פעמיים בזווית של 90 מעלות (רוחב החיתוך: 0.7 מ"מ; מהירות: 0.15 ס"מ/s). חזור על תהליך זה באופן ידני עם אזמלים שני 10 s בכל צד.</li>
		<li>להעביר 12 מ של המדיום זלוף לתוך צינור חדש (50 מ"ל). שופכים את slurry תא לתוך תאים זה בינוני ותקציר לעוד 5 דקות ב 37 ° C. לערבב הפתרון בכל דקה.</li>
		<li>לסנן את הפתרון עם הלב מתעכל דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר) לתוך צינור חדש (50 מ"ל).</li>
		<li>Centrifuge הפתרון המסוננות ב 29 g x עבור 3 מינימלית להשליך את תגובת שיקוע והוסף בינוני פאוול חמים 6 מ ל כולל 12.5 µL CaCl 2 (250 מיקרומטר) כדי בגדר התא. Resuspend בגדר באמצעות תנועות חזק חלקה. צנטריפוגה שוב ב 29 g x עבור 2 דק. להשליך תגובת שיקוע והוסף חמים 6 מ"ל פאוול בינוני שהוחלפו עם 25 µL CaCl 2 (500 מיקרומטר). להמיס בגדר תא דרך בתנועות עדינות חזק ומוסיפים 12 mL חמים פאוול בינונית הכוללת 120 µL CaCl 2 (1 מ"מ). צנטריפוגה בפעם השלישית ב 16 x g עבור 1 דקות. שוב, להסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לערבב בגדר תא עם המדיום ציפוי מראש ומחוממת.</li>
		<li>הסר בינוני ציפוי מראש צלחות תרבות. העברת 1 מ"ל ציפוי בינוני, כולל את cardiomyocytes מבודדים, כל צלחת תרבות. דגירה cardiomyocytes מבודד טריים ב 37 ° C עבור ה 1</li>
		<li>להסיר המדיום ציפוי לוחות תרבות. להוסיף 1 מ"ל שטיפה בינוניים עד שהלוח תרבות, לאחסן את הצלחות ב 37 ° C עד שישה ימים מבלי לשנות את המדיום.</li>
		<li>עבור חוקרים את השפעת כימיקלים שונים וטיפולים -ARVC, תחילה רענן בינוני ציפוי על-ידי שטיפת בינוני, לאחר מכן הוספת כימיקלים שונים. 
		הערה: הערכה עם מיקרוסקופ אור: עם כל הכנה תא, 150 ל-300 cardiomyocytes צריך לפקח ליום על ידי מיקרוסקופ אור. לסעף cardiomyocytes שנספר הכל לקבוצות על פי המראה שלהם (למשל, &#34; מוט בצורת &#34;, &#34; סיבוב למטה &#34;, &#34; מתפשט &#34;, ו &#34; מראה יוצא דופן &#34;). הקטגוריה &#34; הפצת &#34; כולל כל cardiomyocytes עם מבנים דמויי-pseudopodia. &#34; מראה יוצא דופן &#34; כולל כל ARVC עם משטח לא סדיר אין קרום התא שלם לזיהוי.</li>
	</ol></li></ol> 3. דוגמה ניסויים <ol><li>זריחה/Immunofluorescence כתמים cardiomyocytes למבוגרים <ol><li>ניתוח מורפולוגי ומבניים המרות של ARVC במהלך הטיפוח-תרגול על ידי מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. להשתמש Phalloidin-TRITC כדי לחקור מבנים F-אקטין &#34; מוט בצורת &#34;, &#34; סיבוב למטה &#34;, ו &#34; הפצת &#34; ARVC. לבצע צביעת לפי היצרן &#39; פרוטוקול s. דוגמא אישית Phalloidin-TRITC מכתים ניתנת בהפניה Nippert. et al. 11. עם זריחה/immunofluorescence מכתים, הבדלים ב דה - ו מחדש - differentiation של המנגנון כויץ ב cardiomyocytes למבוגרים מטופח בין ניסיוני טיפולים (למשל, עם Swiprosin-1, ionomycin) יכול ייחקרו.</li>
	</ol></li> <li>בזמן אמת כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR) <ol><li>לבצע לרביעיית-PCR לחקור שינויים בביטוי ה-mRNA של גנים שונים (למשל, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) במהלך הטיפוח-תרגול של ARVC. עבור גודל המדגם מספיק, השתמש מנות תרבות גדול (קוטר פנימי: 60 מ מ) עם 2 מ"ל נפח. ARVC של חמש מנות תרבות התשואות דוגמא אחת. לבצע בידוד של mRNA וטרנספורמציה של cDNA לפי היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	</ol></li> <li>Immunoblot טכניקות <ol><li>לבצע לחומה המערבית לחקור שינויים בביטוי חלבונים (למשל, עבור Swiprosin-1) במהלך הטיפוח-תרגול של ARVC. השתמש צלחת תרבות אחת (1 מ"ל) עבור דגימה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. D., Schreiber, D., Fabbro, D., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+ventricular+cardiomyocytes:+isolation+and+culture.">Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture.</a> Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. 290, 305-314 (2005).</li><li>Eppenberger, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+analysis+of+the+regeneration+of+myofibrils+in+long-term+cultures+of+adult+cardiomyocytes+of+the+rat.">Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat.</a> Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).</li><li>Burrows, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultivation+of+tissues+of+the+chick-embryo+outside+the+body.">The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body.</a> JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).</li><li>Cavanaugh, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsation,+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro.">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).</li><li>Muir, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+observation+on+the+cellular+structure+of+cardiac+muscle.">Further observation on the cellular structure of cardiac muscle.</a> J. Anat. 99, 27-46 (1965).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Schwarzfeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+development+in+cell+culture+of+myocardial+cells+of+the+adult+rat.">Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).</li><li>Kubin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncostatin+M+is+a+major+mediator+of+cardiomyocyte+dedifferentiation+and+remodeling.">Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+Swiprosin-1+on+the+formation+of+pseudopodia-like+structures+and+&#946;-adrenoceptor+coupling+in+cultured+adult+rat+ventricular+cardiomyocytes.">The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and &#946;-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes.</a> PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).</li><li>Moses, R. L., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+and+reestablishment+of+cardiac+muscle+cell+ultrastructure+in+cultured+adult+rat+ventricular+muscle+cells.">Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells.</a> J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).</li><li>Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexpression+of+&#945;-smooth+muscle+actin+isoform+in+cultured+adult+rat+cardiomyocytes.">Reexpression of &#945;-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes.</a> Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).</li><li>Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling+and+failure:+from+molecules+to+man+(Part+III).">Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III).</a> Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).</li><li>Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+myocardial+regeneration.">Mechanisms of myocardial regeneration.</a> Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+A+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>P&#246;ling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Janus+face+of+OSM-mediated+cardiomyocyte+dedifferentiation+during+cardiac+repair+and+disease.">The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease.</a> Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).</li><li>Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+evaluation+of+the+contractile+apparatus+in+primary+cultures+of+rabbit+cardiac+myocytes.">Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes.</a> Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).</li></ol>

התוצאות המוצגות הן חלק עבודת הדוקטורט של פרנציסקה Nippert.

ההתנהגות של cardiomyocytes למבוגרים ויוו מושפע על ידי אינטראקציות רבות עם תאים אחרים (למשל, נוירונים, תאי אנדותל, fibroblasts, תאים דלקתיים), את syncytium חשמל אשר הם יוצרים1. לכן, לימוד מתח עיבוד של cardiomyocytes למבוגרים באופן בלעדי דורש את הבידוד טיפוח של ARVC. ההשפעות העיקריות של בידוד ושל ?...

Cardiomyocytes למבוגרים ויוו לעבוד syncytium חשמלי המבוסס על תאים תאים מגעים בין נייטרלים. בנוסף, הם מושפעים תאים סמוכים כמו fibroblasts לב, תאי אנדותל, נוירונים תאים דלקתיים1. על מנת ללמוד את היכולת של cardiomyocytes להתאים לארגון תאיים שלהם ששונו תנאי עומס, כפי שניתן לראות במהלך היפרטרופיה, מה צעד ראשוני שמוביל אי ספיקת לב, בידוד, טיפוח של עכברוש חדרית למבוגרים cardiomyocytes (ARVC) הוא הכרחי2,3,4. מבחינה היסטורית, cardiomyocytes קודם הם בודדו אותנו מהמתרחש עובריים חומוס לבבות5,6. כמה שנים מאוחר יותר, הבידוד הראשון של cardiomyocytes סופני הבדיל תוארה על-ידי שימוש סידן דלדול7. אולם, cardiomyocytes למבוגרים אלה לא היו סידן סובלנית, ולכן לא ניתן להשתמש עבור מבחני פונקציונלי. לבסוף, בשנת 1976 פרוטוקול חדש זמין פאוול ולסובב לחקור cardiomyocytes חדרית מבוגר מתחת בתנאים פיזיולוגיים8. כצעד ראשון, הם בודדו cardiomyocytes מבוגר מתחת ריכוזי סידן נמוך וסידן מוגבר לאחר מכן פיזיולוגיים ריכוזי בשגרה stepwise. כיום, ברוב הפרוטוקולים עבור בידוד וטיפוח של cardiomyocytes למבוגרים לעבוד עם פרוטוקול זה סידן, להשתמש collagenase עיכול אנזימטי של אנשי קשר תא עבות-תא1.
לטיפוח מוצלחת, נדרש סרום עגל עוברית (FCS) או oncostatin מ' (OSM). ARVC לבצע של דה - ו מחדש - differentiation בשינויים מבניים מקיף כולל סרקומר פירוק ועל הרפורמציה9,10,11,12. תהליך זה מלווה ביטוי מחדש של גנים מסוג עוברית, כמו שרשרת כבדה β-צולבות הקישור חוטים שרירן (β-MHC), כפי הידוע מן היפרטרופיה, היווצרות של מבנים דמויי-pseudopodia, הנקרא גם מריחה4,11, 13. יתר על כן, swiprosin-1 (EFHD2), שזוהה חלבון, משחק תפקיד מרכזי בתהליך של בידול מחדש ARVC מעובדים11. כתוצאה מכך, ARVC בתרבות להפוך תאים נרחבת, רב שלבית, אשר באופן ספונטני להראות התכווצויות לאחר שבועיים עד שלושה שבועות תרבות2,4,14.
לאחרונה חשפו כי הלב differentiation re ביטול עם התרחשותה בתנאים תרבות מחקה כולל ראית ויוו במהלך לב שיפוצים10,15. שיפוץ לב הוא תהליך מפתח במהלך מחלות לב16. כמו מחלות לב הם עדיין הגורם העיקרי למוות בחברות תעשיתיות, הבנה טובה יותר של הביולוגיה של cardiomyocytes הבוגרים חשוב (מי; 2015). בידוד טיפוח של ARVC יוכלו לסייע לפתח אסטרטגיות חדשות, תרופות לטיפול במחלות לב. עם כתב היד הזה, מסופק עבור בידוד של טיפוח של ARVC פרוטוקול. יתר על כן, כמה חלקים קריטיים של שיטה זו מסומנים במקטע דיון.

<table><tbody><tr><td>Langendorff perfusion system</td><td>inhouse construction</td><td></td><td>double-walled with a water&lt;br/&gt; based heating system</td></tr><tr><td>Tissue chopper Mc Ilwain</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td><td>inhouse construction</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal shears</td><td>Aeskulap</td><td>BC772R</td><td></td></tr><tr><td>Capsule forceps</td><td>Eickemeyer</td><td>171307</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor large</td><td>Aeskulap</td><td>BC562R</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor small</td><td>Aeskulap</td><td>BC163R</td><td></td></tr><tr><td>Mash with Polyamid</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>mash size 200 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>plastic disc</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

בלב שלם, תאים סמוכים להשפיע cardiomyocytes למבוגרים. השיטה של בידוד, טיפוח של cardiomyocytes למבוגרים, חקירה מדויקת של אופן הפעולה של תאים אלה תחת טיפולים ספציפיים וסביבות אפשרי. כתב יד זה מציג פרוטוקול הבידוד מוצלח, טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC).
העכברוש מוקרבת על ידי נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה עמוקה. לאחר מכן, מופק הלב, העורקים הוא חשף. לאחר מכן, מתבצע זלוף במערכת זלוף Langendorff עם סידן דלדול וטיפול collagenase. לאחר מכן, רקמות חדרית מקבל כתוש, שהופץ מחדש, מסוננים, ואחריו שלושה צעדים צנטריפוגה עם תוספת הדרגתית של CaCl2 עד הריכוז פיזיולוגי סידן. ARVC הם מצופה על מנות התרבות תאים. לאחר רענון המדיום התרבות תאים, ARVC יכול להיות מעובד עד שישה ימים מבלי לשנות את המדיום תרבות סרום המכיל. בידוד של ARVC הוא תהליך רגיש סידן. שינויים קטנים בריכוז הסידן תאיים לגרום לירידה האיכות ואת הכדאיות של תאים מבודדים.
טרי מבודד ARVC הם מוט בצורת. בתוך הימים הראשונים של טיפוח-תרגול הוא מפסיד את מוט בצורת טופס ומורפולוגיה pseudopodia מבנים דמויי (התפשטות). במהלך המשקע מורפולוגי ARVC לבזות בתחילה שלהם אלמנטים כויץ ואחריו של הרפורמציה דרך סיבי אקטין מתח, sarcomerogenesis de novo . אחרי שבוע אחד של טיפוח-תרגול, רוב ARVC הצג מראה נפוץ עם striation קרוס לזיהוי בבירור. תהליך זה הוא רגיש ריכוז הסידן תאיים, בזמן הטיפול עם ionomycin נחלש מתפשטת. סמני מפתח בתהליך של דה - ו מחדש - differentiation הם שרשרת כבדה β-צולבות הקישור חוטים שרירן (β-MHC), oncostatin M (OSM) ו- swiprosin-1 (EFHD2). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הלב differentiation re ביטול המתרחשים בתנאים תרבות מחקה תכונות ראית ויוו במהלך שיפוץ לב. לכן, בידוד, טיפוח של ARVC לשחק תפקיד מפתח להבנת הביולוגיה של cardiomyocytes.

Cardiomyocytes למבוגרים בתרבות: איור 1 מציג סקירה של טרי מבודד למבוגרים cardiomyocytes 2 h לאחר השטיפה האחרונה. כ- 75% של כל cardiomyocytes היה מורפולוגיה של מוט בצורת. 25% הנותרים הראה מראה יוצא דופן מורפולוגיה עגול, אין לזיהוי ללא פגע קרום התא (איור 1). בסו?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

isolation-and-cultivation-of-adult-rat-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

15.5K Views.  Justus Liebig University Giessen. כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.

Video: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

בידוד וCryopreservation של שריר לב עכברוש ילודים

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Developmental Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biology

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...