מטרת הסרטון הזה היא להדגים פרוטוקול סטנדרטי לבידוד קרדיומיוציטים למבוגרים, תרבות ארוכת טווח ו transfection. בידוד ו culturing cardiomyocytes מעכבר או חולדה ממשיכים להיות שיטה חיונית כדי לחקור את הביולוגיה האוטונומית התא של קרדיומיוציטים בתוך הלב בריא ומחלות. יש כמה שאלות שאנחנו יכולים לענות באמצעות קרדיומיוציטים מבודדים.
כמו הפוטנציאל המשגשג. ישנם שינויים בביטוי גנים או ביטויי ציטוקין ספציפיים עם תגובת הפציעה. למרבה הצער, קרדיומיוציטים עכבר לא לשרוד בשבוע אחד בתנאי תרבות נורמלית.
לכן, בסרטון זה, אנו מתארים שיטה ממוטבת לבודד קרדיומיוציטים עכבר בוגר, transfixed אותם ותרבת אותם הרבה מעבר 21 ימים, טכניקה זו קשה בתחילה לשלוט. אבל עם תרגול אפשר להשיג כ 80 עד 90% לשרוד קרדיומיוציטים לאחר בידוד על 100 אחוז יעילות transfection. ורוב הקרדיומיוציטים האלה בתנאים הנכונים יכולים לשרוד את 20 הימים האחרונים.
נקו וערקו את המכשירים הכירורגיים שלכם על ידי השרייתם ב-70% אלכוהול למשך 15 דקות ולאחר מכן שטפו אותם במים מזוקקים כפולים. לאחר המים, להשאיר את הכלים באוויר להתייבש הבא, לנקות את המנגנון שפע על ידי הפעלת 70% אלכוהול פעמיים במשך חמש דקות כל אחד. הגדלת קצב הזרימה תסייע לנקות את הצינורות לאחר אלכוהול לשטוף את כל האלכוהול שנותר על ידי הפעלת מים מזוקקים כפול במשך 10 דקות.
הגדר שלוש מנות כדי לנקות את הלב לאחר כריתה. ממלאים כל אחת מהמנות ב-20 מיליליטר של חיץ מיוציט. מוסיפים שתיים עד שלוש טיפות של הפרין לכל מנה עם פיפטה פסטר ומערבבים היטב על ידי צינורות למעלה ולמטה מספר פעמים.
קח מזרק 10 מיליליטר ולמלא אותו עם חיץ מיוציט. מוציאים את כל בועות האוויר מהמזרק וממקמים אותו בצלחת השלישית בתצב זוויתי, ומאבטחים אותו בקלטת. הכינו קשר רופף עם תפר כירורגי וה מניחים אותו סביב המחט.
להזריק את העכבר עם הפרין באמצעות הזרקת IP 20 דקות לפני הרדמה. הפיץ את חיץ שפע מיוציט דרך מנגנון שפע בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה. לאחר חמש דקות, להחליף את חיץ שפע עם פתרון אנזים, להרוות את פתרון האנזים עם חמצן במהלך התהליך, שוב, להגדיר את פתרון האנזים לקצב זרימה של שלושה mLs לדקה.
אשר הרדמה על ידי צביטת בוהן והנח את העכבר על הפלטפורמה הכירורגית. לחיטוי העור עם 70% אלכוהול. בזהירות לפתוח את החזה, לממש את הלב ולשים את הלב בצלחת הראשונה.
לנקות את הדם מהלב על ידי סחיטה עדינה, ולאחר מכן להעביר את הלב לצלחת השנייה כדי לנקות עוד יותר את הדם מהלב כדי להסיר את כל הרקמות שאינן לב. לאחר מכן להעביר את הלב לצלחת השלישית. מצא את אבי הישבן ולהשתמש מטלטולים שלך כדי לשמור אותו פייטון יותר הצבת אותו סביב מחט cannulating.
לאבטח אותו על ידי משיכת למטה הידוק הקשר ההדוק מראש שלך ולאחר מכן ביצוע קשר שני. ליציבות נוספת, תקן את הסדר והמקום בעזרת קליפ. לקצץ כל חוט תפר עודף, ולבסוף להתחיל את שפע הלב באמצעות חיץ מיוציט במזרק כדי לנקות את כל הדם שנותר בלב.
בזהירות להסיר את המחט חישוב מן המזרק ולחבר אותו למנגנוני שפע. נסה למנוע מבועות אוויר להיכנס ללב. כמו זה עשוי להשפיע על זרימת פתרון האנזים ועיכול.
להזיז את ז'קט המים למעלה, כדי לספק סביבה הומוגנית ללב במהלך שפע. אפשר לפתרון האנזים לזרום דרך הלב במהירות של שניים עד שלושה MLs לדקה. תן לתסימת האנזים לזרום דרך הלב במשך שתי דקות.
בשתי דקות, מערבבים 40 מיקרוליטרים של פתרון סידן כלורי מיקרומולארי לפתרון האנזים. תן פתרון האנזים לעבור דרך הלב עוד 10 עד 15 דקות. ברגע שהזרימה הופכת חלקה והלב מתחיל להיראות חום ורך, אתה יודע שיש לך הפצה שווה של אנזים הקולגנס כדי להשיג עיכול נכון של הלב.
כאשר אתה חושב העיכול שלך הושלם, לקחת את הלב למטה מן מערכת זלוף Langendorff ולשים אותו לתוך צלחת פטרי 16 מילימטר מלא חמישה מיליליטר של פתרון אנזים ולקחת אותו לרגל biosafety. בזהירות להסיר את הרקמה אטריה ושומן נוסף. טחון את הלב בחלקים מוגדרים בעזרת מדפים.
קח פיפטה פסטר סטרילי לחתוך את הקצה שלה ב 45 מעלות. השתמש פיפטה פסטר כדי לשבור את רקמת הלב על ידי צינורות עדינים למעלה ולמטה. עיכול אופטימלי מספק השעיה של cardiomyocytes תא יחיד לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של פתרון להפסיק לעצור את פעילות האנזים כדי למנוע עיכול יתר, לקחת צינור חרוט 50 מיליליטר הראשון ולה מניחים מסננת תאים סטרילי מאה מיקרון על זה.
להעביר את ההשעיה cardiomyocyte דרך מסננת התא כדי להסיר את כל גושים גדולים של רקמה. לבסוף לשטוף את מסננת עם פתרון להפסיק לאסוף את כל שרידי cardiomyocyte המצורפת. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 20 GS במשך שלוש דקות ולהשליך את supernatant.
להשעות מחדש את cardiomyocytes ו 10 מיליליטר של פתרון להפסיק, במרווחים של שלוש דקות ב 10 microliters של 100 מילימולר סידן כלורי פתרון ארבע פעמים ומערבבים. לאחר המהדורה הרביעית צנטריפוגה ההשעיה cardiomyocytes ב 20 GS במשך שלוש דקות ולהשליך את supernatant. להשעות מחדש את cardiomyocytes לתוך מדיה תרבות Pre צלחת התאים לתוך צלחת 60 מילימטר והכניס אינקובטור CO2 במשך שעתיים עד שלוש שעות.
בעוד שעתיים-שלוש. סוגי התאים מזהמים העיקריים כמו תקיעות סיבים יהיה דבק בשירות של המנה, המאפשר בידוד טהור של cardiomyocytes. לאחר מכן, להוציא את המנה מהאינקובטור ולאסוף את cardiomyocytes צף בצינור חרוט מחדש את cardiomyocytes בצלחת תרבות למינין מצופה 24 היטב.
ארבע עד שש שעות מספיקות לקרדיומיוציטים לדבוק על פני השטח. אז transfection יכול להתבצע בשש שעות לאחר ציפוי. ריאגנט טרנספיקציה RNA IMAX שימש להשתלת קרדיומיוציטים עם siRNAs.
התקשורת התרבותית מכילה 25 דם מיקרומולארי Staten בתוספת 10%FBS, אשר מצאנו מתאים יותר לבצע תרבות cardiomyocyte לטווח ארוך לגרום ניתוח התפשטות. לאחר ההמרה, ניתן להציג את הקרדיומיוציטים על ידי מיקרוסקופיה תוך שימוש באינקובטור מיקרו כדי להפוך את התאים להדמיית זמן לשגות. אלה תמונות בהירות של קרדיומיוציטים בצורת מוט מנוקד בהגדלה נמוכה וגבוהה.
כאן, אתה יכול לראות יום אחר יום הדמיה, אשר מציג שינויים מורפולוגיה קרדיומיוציט עכבר למבוגרים. אנו מאשרים כי cardiomyocytes הם בריאים והתכווצות בנקודות זמן מוקדמות, כמו גם לאחר דידול D ותרבות לטווח ארוך. הנה דוגמה של כתם immunofluorescent Ki67 המדגים התפשטות המושרה של קרדיומיוציטים מבוגרים בתרבות לאחר siRNAs, transfection.
כפי שניתן לראות מן התוצאות באמצעות טכניקה זו, אפשר להשיג קרדיומיוציטים מבוגרים בריאים מן העכבר עכבר וחולדה ותרבות אותם למחקר ארוך. לסיכום, לאחר שליטה בטכניקה זו תאפשר לנו ללמוד קרדיומיוציטים הרבה מעבר לפרוטוקולי הכת הנוכחיים.
