We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

הערה: שיטה זו תוארה 12 בעבר. 1. בידוד חלבון הכן 1 מ&quot;ג של חלבון תאי על ידי תאי lysing, רצוי בשיטות פיזיות, כגון עיתונות צרפתית, מכות חרוז, או sonication. הימנע תמוגה תא בתיווך ליזוזים כי האנזים לבלבל מדידות ספקטרומטריית מסה. 2. רטיבות TCA של חלבונים הוספת חומצת 1 נפח trichloroacetic (TCA) לחלבון 4 כרכים ומקררים על קרח דק 10 כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של אצטון קר כקרח וצנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולהפוך את הצינור על הספסל כדי לייבש את גלולה ל15 דקות. כדורי חלבון חנות ב -80 ° C. 3. חלבונים לפגל וצמצום חוב דיסולפיד Reלהשעות את החלבונים ל~ 2 מ&quot;ג / מיליליטר ב500 denaturation μl וחיץ ירידה (או אוריאה 4 M או 3% SDS ב50 HEPES מ&quot;מ pH 8.5, 5 מ&quot;מ DTT). לחלופין, כולל מעכבי פרוטאז במאגר. דגירה חלבונים ל30 דקות ב56 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות בטמפרטורת חדר. 4. Aklylate קבוצות sulfhydryl חינם לשבש גיבוש דיסולפיד בונד באופן בלתי הפיך הכן iodoacetamide 0.3 M הטרי במים. זהירות! Iodoacetamide הוא רעיל ביותר. הוסף 25 μl 0.3 M iodoacetamide (ריכוז סופי 15 מ&quot;מ) ל500 חלבון μl ודגירה של 20 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. להרוות iodoacetamide ידי הוספת 10 μl של 300 מ&quot;מ DTT (5 מ&quot;מ ריכוז DTT סופי). אחסן את חלבוני alkylated ב -80 ° C. 5. עיכול חלבון TCA לזרז חלבונים (כפי שמתואר בשלב 2) ו resuspend ב 1 מיליליטר של 50 HEPES מ&quot;מ (pH 8.2), האוריאה ז 1. הכן פתרון מניות של endoprotein LysylASE (יס-C) במים בריכוז של 2 מיקרוגרם / μl ולהוסיף 5 μl לפתרון החלבון. דגירה את התערובת ל16 שעות בטמפרטורת חדר. להבטיח את הריכוז ליס-C הסופי הוא 10 ng / μl ויחס חלבון לLysC (w / w) הוא 1/50 עד 1/200. Resuspend 20 טריפסין הכיתה רצף מיקרוגרם ב40 μl של 50 מ&quot;מ חומצה אצטית, להוסיף 5 μl (10 מיקרוגרם טריפסין) כדי לעכל יס-C, ודגירה במשך 6 שעות ב 37 ° C. להשתמש באותו ריכוז פרוטאז ויחסי פרוטאז לחלבון ליס-C כמשמש לטריפסין. 6. הפוך שלב פפטיד הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת פפטידים על ידי הוספת חומצת trifluoroacetic (TFA) לריכוז סופי של .0.5% (pH ≈ 2). צרף עמודת C18 לסעפת חילוץ. השתמש בקצב הזרימה הגבוה ביותר האפשרי עבור כל השלבים מלבד טעינה וelution של פפטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודה רטובה עם אצטוניטריל מיליליטר 6 (ACN). לשטוף טור עם 6 מיליליטר 80% ACN, TFA 0.1%, ולאחר מכן לאזן עם 6 מיליליטר 0.1% TFA. אל תאפשרעמודה לרוץ יבש בין שלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק לחץ ואקום ולטעון 500 מיקרוגרם של פפטידים על הטור בקצב זרימה של כ 1 מיליליטר / דקה. ברגע שפפטידים שנקשרים לעמודה, הוואקום מחדש ולשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA, ולאחר מכן עם 3 מיליליטר של חיץ חומצת לימון (0.09 M חומצת לימון, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5). שים לב: יכולות להיות מתויגות כמויות פפטיד גבוהות אבל טור C18 מחייב קיבולת צריך להיות לפחות פי שתיים גבוהים יותר מכמות פפטיד כדי למנוע אובדן מדגם. </li></ol> 7. בעמודת פפטיד תיוג ידי Reductive Dimethylation (רדה תיוג) לבצע שלב זה מתחת למכסת מנוע כימי כמו המימן ציאניד הוא שוחרר בריכוז נמוך במהלך תהליך התיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 12 מיליליטר של ומאגרי &quot;אור&quot;, &quot;כבדים&quot; רדה לmethylate אמינים פפטיד בחינם. חיץ רדו אור מורכב מפורמלדהיד 0.8% ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן נשא מימנים בההפצות EIR טבעיות איזוטופי במאגר חומצת לימון. חיץ רדה כבד מורכב מ0.8% פורמלדהיד deuterated ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן deuterated במאגר חומצת לימון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עמודה המכילה פפטידים על ידי הוספת 10 מיליליטר בהיר או חיץ רדה כבד לעמודות המכיל פפטיד בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה וחזור על מנת להבטיח תיוג מלא. טור לשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 0.5% חומצה אצטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק ואקום וelute פפטידים שכותרתו ראשון עם 1 מיליליטר 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית באמצעות קצב זרימה של כ 0.5 מיליליטר / דקה. אם תרצה, למדוד את יעילות התיוג של דגימות בודדות על ידי ספקטרומטריית מסה לפני הערבוב כבדה וקלות דגימות (ראה &quot;נציג תוצאות&quot;). מערבבים 01:01 דגימות פפטיד כבדות ושכותרתו אור כדי לכמת על ידי ספקטרומטריית מסה. </li></ol> 8. תערובת פפטיד נפרדת בשלב הבסיסי pH הפוך כרומטוגרפיה (BPRP) &lt;/ P&gt; pH הבסיסי התהפך כרומטוגרפיה שלב (BPRP) להפריד את תערובת פפטיד לשברים מרובים, אשר מנותחים באופן עצמאי על ידי LC-MS/MS להגדיל את כיסוי proteome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fractionate תערובת פפטיד על עמודת C18-HPLC ידי יישום הדרגתי של ריכוז ACN גובר ב10 מ&quot;מ אמוניום ביקרבונט (pH 8). התחל עם 5% (v / v) ACN למשך 5 דקות, להגביר 35% ACN ב60 דקות, ולאחר מכן ל90% ACN בדקות 1. לשמר את ACN 90% למשך 4 דקות לפני הפחתת ACN עד 5% מחדש לאזן את העמודה במשך 9 דקות. לאסוף 96 שברים של נפח שווה בצלחת 96 היטב (A1 לH12). לפקח על חלוקה באמצעות גלאי UV ב220 ננומטר ואילו פפטידים משחררי את הטור (10-70 דקות לתנאים שתוארו כאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב את השברים מבארות A1, C1, E1, ו-G1 (A1 שבריר), מB1 בארות, D1, F1, וH1 (B1 שבריר), מבארות A2, C2, E2, ו G2 (A2 שבריר) ובהתאם ל שברים שנותרו. הסר את solvenלא באמצעות צנטריפוגות ואקום. פפטידים resuspend משברי A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, ו-B12 ב130 μl של 1% urea/0.5 M TFA ולטהר באמצעות StageTips כמתואר בשלב 9. חנות שברים B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, וA12 ב -20 º C. </li></ol> 9. לטהר פפטידים על ידי להפסיק וללכת חילוץ (StageTips) הכן 7 microcolumns C18-StageTip ידי אריזת 200 טיפים פיפטה μl עם שני C18 דיסקים עם קוטר פנימי (ID) של 1.07 מ&quot;מ. שים טיפים שלב לתוך צינורות Eppendorf. השתמש microcentrifuge לשטוף טיפים עם 130 μl של מתנול, ולאחר מכן 130 80% ul ACN, 0.5% חומצה אצטית. לאזן StageTips עם 130 μl 0.1% TFA. העבר את תערובת פפטיד לStageTips ולשטוף עם 130 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.5% חומצה אצטית. Elute פפטידים ראשון עם 20 μl 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, אז 20 μl 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית. שלב eluatesnd יבש על ידי סינון ואקום. 10. LC-MS/MS microcapillary <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פפטידים ב1-5 μl 5% חומצה פורמית, 5% ACN לריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl. לפתור ~ 1 מיקרוגרם פפטידים על 100 מיקרומטר × 20 סנטימטר עמודת HPLC שלב עם שיפוע של 6-22% ACN ב0.125% חומצה פורמית, התהפך C18 להחיל על 75 או 100 דקות בקצב זרימה של ~ 300 / דקות NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות פפטידים באמצעות LTQ Orbitrap ולוס 12 או פלטפורמה דומה נוזל כרומטוגרפיה מסת ספקטרומטריית עם ספקטרומטר מסת מתן ברזולוציה גבוהה ודיוק מסה גבוה. הפעל את ספקטרומטר מסת נתונים במצב תלוי עם מלאה MS סריקה (ברזולוציה של 60,000) שנרכשה במנתח Orbitrap. ליצור מלכודת היונים יניארי MS / MS ספקטרום ל20 יונים הנפוצים ביותר שזוהו בספקטרום MS המלא. הגדרת שליטה אוטומטית מטרות (AGC) עד 1 x 10 6 עבור MS המלא ו -2,000 עבור MS / MS. הגדר פעמים הצטברות יון המרביות ל1,000 אלפיות שנייםלטרשת נפוצה ו150 msec עבור MS / MS. תכלול יונים מבשר פפטיד מקוטעים מבחירה נוספת מ-MS / MS ל20-60 שניות. </li></ol> 11. MS / MS רכישת נתונים לזהות פפטידים על ידי השוואת קבצי RAW MS / MS ספקטרום למסד נתונים תיאורטי עם אלגוריתם כגון SEQUEST 8 שימוש בפרמטרים (טבלת 1). טבלה 1. חיפוש פרמטרים למסד פפטיד. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> פרמטרים כלליים </td><td> עיכול tryptic באופן מלא עם עד 2 החמיץ שסעים </td></tr><tr height="19"><td> 25 סובלנות יון מבשר עמודים לדקה </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 סובלנות יון שבר דה </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> שינויי סטטי </sטרונג&gt; </td><td> 57.02146 דה בציסטאין, carboxyamidomethylation </td></tr><tr height="19"><td> 28.03130 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation אור </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> שינויים דינמיים </td><td> 15.99491 דה במתיונין, חמצון </td></tr><tr height="19"><td> 6.03766 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation כבדה </td></tr></tbody></table><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים מסנן כדי 1% שיעור גילוי שווא עם שיטה כגון אסטרטגית 9 יעד דמה באמצעות מסד נתונים של מסגרות קריאה פתוחות באורינטציות בפועל והתהפכו. </li></ol> 12. פפטיד כימות לחשב את התחומים כבדים וקלים זוגות MS1 חילוץ יון chromatograms (אזורי שיא MS1) ויחסי פפטיד אות לרעש (S / N) 10. כוללים זוגות פפטיד רק כאשר ממוצע אות לnoiיחס se הוא מעל חמש. לכמת שפע יחסי של פפטיד בשתי דגימות כיחס בין אזורי שיא של MS1 כבדים וקלות גרסאות של אותו פפטיד (יחס אזור שיא MS1). חישוב שכיחות חלבון יחסי כיחס אזור שיא MS1 החציוני לפפטידים בחלבון.

<ol>
	<li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology.">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li><li>Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).</li><li>Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+rat+liver+membrane+proteome+using+peptide+immobilized+pH+gradient+isoelectric+focusing.">Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing.</a> Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database.">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses.">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li><li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation.">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li><li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe.">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li><li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367.">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li><li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics.">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses.">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li><li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates.">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins.">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li><li>Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+N(&#945;)-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX.">Improved N(&#945;)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis.">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים של עניין.

כמה נקודות לעשות תיוג איזוטופ יציב של פפטידים באמצעות dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) שיטה אטרקטיבית לפרוטאומיקה כמותיים: ריאגנטים זולים תיוג (ריאגנטים עולים פחות מ 1 $ לדגימה), קצב תגובה מהיר (10 דקות ~), היעדר מוצרי לוואי, גבוהים שחזור (איורים 3, 4), תוצרי תגובה יציבה,...

מדידת הבדלי ריכוז של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות היא אתגר מרכזי בפרוטאומיקה. יותר ויותר, זה נעשה על ידי תיוג חלבונים בכל דגימה עם תגי איזוטופים שונים, המשלב דגימות, ובאמצעות ספקטרומטריית מסה לכמת הבדלי ריכוז. מספר שיטות קיימות לתיוג איזוטופי יציב של חלבונים ופפטידים. 15 N תיוג 1 וSILAC 2 להציג תוויות איזוטופי מטבולית in vivo, ואילו 3 ICAT, 4 iTRAQ, וdimethylation ההפחתה 5 להוסיף תגיות איזוטופ יציבים לאחר מיצוי חלבון ועיכול. בין השיטות הללו, dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא צובר פופולריות כמו שיטה זולה, לשחזור לכמת הבדלי ריכוז חלבון בכמעט כל סוג של מדגם. תיוג רדה כרוך פפטידים מגיבים עם פורמלדהיד כדי ליצור בסיס שיף, אשר לאחר מכן מצטמצםעל ידי cyanoborohydride. תגובה זו dimethylates קבוצות אמינו חופשיות ברשתות N-Termini והצד ליזין וmonomethylates prolines N-מסוף. הפרוטוקול המתואר כאן methylates פפטידים במדגם 1 עם תווית &quot;קלה&quot; באמצעות ריאגנטים עם אטומי מימן בתפוצתם הטבעית איזוטופי ומדגם 2 עם תווית &quot;כבדה&quot; באמצעות פורמלדהיד deuterated וcyanoborohydride (איור 1). כל קבוצת אמין dimethylated על תוצאות פפטיד בהבדל המוני של 6.0377 דה בין אור וצורות כבדות, אשר מועסקות להבחין בין שתי צורות באמצעות ספקטרומטר מסה. באופן ספציפי, שכיחותם היחסית פפטיד הן לכמת כיחס בין אזורי הכרומתוגרמה יון MS1 חילוץ (יחס אזור שיא MS1) של אור והגרסה כבדה לכל זוג יונים פפטיד. השפע היחסי של חלבון מחושב כיחס אזור שיא MS1 החציוני בין כל פפטידים בחלבון. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים פרוטוקול חזק על התנהגותing ניסויי תיוג רדה ידי LC-MS/MS הכולל חילוץ התהפך שלב פפטיד מוצק שלב, תיוג רדה על עמודות, חלוקה פפטיד על ידי pH הבסיסי התהפך שלב כרומטוגרפיה (BPRP), וטיהור של תערובות הפפטיד באמצעות StageTips (איור 2) . אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של שימוש בתיוג רדה לפרוטאומיקה כמותית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T9159</td>
			<td style="width:319px;">protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">650501</td>
			<td>protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71736</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S8045</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">43816</td>
			<td>denature, reduce, alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">protease Inhibitor Complete Mini Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693124001</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H7523</td>
			<td>resuspend, extract, label protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C5670</td>
			<td>resuspend protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">Lysyl Endoprotease</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">129-02541</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:136px;">V5111</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">320099</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">tC18 Sep-Pak C18 cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">14261</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71435</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">deuterated formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium cyanoborodeuteride</td>
			<td>CDN isotopes</td>
			<td style="width:136px;">D-1797</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 &#181;m particle size)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td style="width:136px;">770450-902</td>
			<td>basic pH reversed-phase chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">399388</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18 Empore Disks</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:136px;">14-386-3&#160;</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">494437</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling

תיוג איזוטופ היציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא שיטה לכמת במדויק הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה. תיוג רדה מבוצע באמצעות אחת רגיל (אור) או בצורות deuterated (כבדות) של cyanoborohydride פורמלדהיד ונתרן להוסיף שתי קבוצות מתיל לכל אמין בחינם. כאן אנו מדגימים פרוטוקול חזק לתיוג רדה והשוואה כמותית של תערובות חלבונים מורכבות. דגימות חלבון לשם השוואה מתעכלים לפפטידים, שכותרתו לשאת אור או תגי תיל כבדים, מעורב, ושיתוף נותח על ידי LC-MS/MS. שכיחותם חלבון יחסית הן לכמת על ידי השוואת אזורי שיא הכרומתוגרמה יון של גרסאות כבדות וקלות שכותרת של הפפטיד המכונן שחולץ מן MS הספקטרום המלא. השיטה המתוארת כאן כוללת הכנת מדגם על ידי מיצוי שלב מוצק התהפך שלב, תיוג רדה על הטור של פפטידים, חלוקה פפטיד ידי Rev-pH הבסיסיכרומטוגרפיה ersed-שלב (BPRP), וטיהור פפטיד StageTip. אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של תיוג רדה ביחס לשיטות אחרות לשילוב איזוטופ יציב. אנו מדגישים יישומי רומן באמצעות תיוג רדה כשיטת מהירה, זולה, ומדויקת כדי להשוות שכיחותם חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

הערכנו את הדיוק, הדיוק, ושחזור של תיוג רדה באמצעות שמר האפייה וClostridium phytofermentans lysates תא כולו. אנו לכמת את יעילות התיוג רדה מתערובת של ג הראשון phytofermentans lysates חלבון מתאי (שכותרתו כבדה, H) וגלוקוז (תווית אור, L) תרבויות. כאשר מסונן לשיעור גילוי 1% פפטיד שווא, מדגם ז...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling at JoVE.com

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

JoVE Journal

Chemistry

16.0K Views.  Genoscope.  תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סו?...

Video: Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a result of the direct detection of the mass-to-charge ratio of each target molecule. However, MS-based proteomics, like most other analytical techniques, has a bias towards measuring high-abundance analytes, so it is challenging to achieve detection limits of low ng/mL or pg/mL in complex samples, and this is the concentration range for many disease-relevant proteins in biofluids such as human plasma. To assist in the detection of low-abundance analytes, immuno-enrichment has been integrated into the assay to concentrate and purify the analyte before MS measurement, significantly improving assay sensitivity. In this work, the immuno- Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) technology is presented for the quantification of proteins and peptides in biofluids, based on immuno-enrichment on beads, followed by MALDI-MS measurement without prior elution. The anti-peptide antibodies are functionalized on magnetic beads, and incubated with samples. After washing, the beads are directly transferred onto a MALDI target plate, and the signals are measured by a MALDI-Time of Flight (MALDI-TOF) instrument after the matrix solution has been applied to the beads. The sample preparation procedure is simplified compared to other immuno-MS assays, and the MALDI measurement is fast. The whole sample preparation is automated with a liquid handling system, with improved assay reproducibility and higher throughput. In this article, the iMALDI assay is used for determining the peptide angiotensin I (Ang I) concentration in plasma, which is used clinically as readout of plasma renin activity for the screening of primary aldosteronism (PA).

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

A protocol for the protein quantification in complex biological fluids using automated immuno-MALDI (iMALDI) technology is presented.

פפטיד, חלבון כימות באמצעות כלים אוטומטיים חיסונית-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of multiplexing up to 22 or 24 samples with tandem mass tags or isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectively, in a single experiment. This enhanced sample multiplexing considerably reduces mass spectrometry acquisition times and increases the utility of the expensive commercial isobaric reagents. However, the manual process of sample handling and pipetting steps in the strategy can be labor intensive, time consuming, and introduce sample loss and quantitative error. These limitations can be overcome through the incorporation of automation. Here we transferred the manual cPILOT protocol to an automated liquid handling device that can prepare large sample numbers (i.e., 96 samples) in parallel. Overall, automation increases feasibility and reproducibility of cPILOT and allows for broad usage by other researchers with comparable automation devices.

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) is an enhanced sample multiplexing strategy that is capable of increasing the number of samples that can be analyzed simultaneously with available isobaric tags. Incorporation of a robotic platform has greatly increased experimental throughput, reproducibility, and quantitative accuracy.

מולטיפלקס לדוגמה אוטומטי באמצעות תיוג איזוטופי משולב מקדים ותיוג איסוברי (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Stable Aqueous Suspensions of Manganese Ferrite Clusters with Tunable Nanoscale Dimension and Composition

Manganese ferrite clusters (MFCs) are spherical assemblies of tens to hundreds of primary nanocrystals whose magnetic properties are valuable in diverse applications. Here we describe how to form these materials in a hydrothermal process that permits the independent control of product cluster size (from 30 to 120 nm) and manganese content of the resulting material. Parameters such as the total amount of water added to the alcoholic reaction media and the ratio of manganese to iron precursor are important factors in achieving multiple types of MFC nanoscale products. A fast purification method uses magnetic separation to recover the materials making production of grams of magnetic nanomaterials quite efficient. We overcome the challenge of magnetic nanomaterial aggregation by applying highly charged sulfonate polymers to the surface of these nanomaterials yielding colloidally stable MFCs that remain non-aggregating even in highly saline environments. These non-aggregating, uniform, and tunable materials are excellent prospective materials for biomedical and environmental applications.

We report a one-pot hydrothermal synthesis of manganese ferrite clusters (MFCs) that offers independent control over material dimension and composition. Magnetic separation allows rapid purification while surface functionalization using sulfonated polymers ensures the materials are non-aggregating in biologically relevant medium. The resulting products are well positioned for biomedical applications.

מתלים מימיים יציבים של אשכולות פריט מנגן עם ממד ננומטרי טונה והרכב

Manganese ferrite clusters (MFCs) are spherical assemblies of tens to hundreds of primary nanocrystals whose magnetic properties are valuable in diverse ...

זיהוי איברים ראשוני בצמחי מרפא באמצעות תיוג 13C6-גלוקוז

13C6&#45;Glucose Labeling Associated with LC&#45;MS&#58; Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary metabolite in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Paris saponin (PS) has a variety of pharmacological activities and PPY is in increasing demand. This study established leaf, rhizome, and stem-vascular-bundle 13C6-Glucose feeding and non-feeding four treatments to precisely certify the primary organs involved in Paris saponins VII (PS VII) synthesis. By combining liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), the 13C/12C ratios of leaf, rhizome, stem, and root in different treatments were quickly and accurately calculated, and four types of PS isotopic ion peak(M&#8722;) ratios were found: (M+1) &#8722;/M&#8722;, (M+2) &#8722;/M&#8722;, (M+3) &#8722;/M&#8722; and (M+4) &#8722;/M&#8722;. The results showed that the ratio of 13C/12C in the rhizomes of the stem-vascular-bundle and rhizome feeding treatments was significantly higher than that in the non-feeding treatment. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves increased significantly under leaf and stem-vascular-bundle feeding treatments. Simultaneously, compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves under rhizome treatment showed no significant difference. Furthermore, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the stem, root, and rhizome showed no differences among the four treatments. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of the Paris saponin II (PS II) molecule (M+2) &#8722;/M&#8722; in leaves under leaf feeding treatment showed no significant difference, and the (M+3) &#8722;/M&#8722; ratio of PS II molecules in leaves under leaf feeding treatment were lower. The data confirmed that the primary organ for the synthesizing of PS VII is the leaves. It lays the foundation for future identification of the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants.

מחבר זרקור: פרופיל איברים ראשוניים צמחיים באמצעות תיוג 13C6-גלוקוז ו- LC-MS

The developed method of 13C6-Glucose labeling combined with liquid chromatography high-resolution mass spectrometry is versatile and lays the foundation for future studies on the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants, as well as the comprehensive utilization of these secondary metabolites.

13C6-תיוג גלוקוז הקשור LC-MS: זיהוי של איברים ראשוניים צמחיים בסינתזת מטבוליטים משנית

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary ...