We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

NOTE: Cette méthode a déjà été décrite 12. Une. Protein Isolation Préparer 1 mg de protéine cellulaire par lyse des cellules, de préférence par des méthodes physiques telles que la presse française, bourrelet battage ou sonication. Éviter la lyse cellulaire par le lysozyme médiation car l&#39;enzyme confondra mesures de spectrométrie de masse. 2. TCA précipitation des protéines Ajouter de l&#39;acide trichloroacétique 1 volume (TCA) à 4 volumes de protéines et de froid sur la glace pendant 10 min pour précipiter les protéines. Centrifugeuse à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Remettre en suspension le culot dans 1 ml d&#39;acétone glacée et centrifuger à 12 000 g pendant 5 min à 4 ° C. Eliminer le surnageant et inverser le tube sur le banc pour sécher le culot pendant 15 min. boulettes de protéines de magasin à -80 ° C. 3. Dénaturer les protéines et réduire les liaisons disulfures Resuspendre les protéines à ~ 2 mg / ml dans 500 ul de tampon de dénaturation et de réduction (soit 4 M d&#39;urée ou de 3% de SDS à 50 mM d&#39;HEPES pH 8,5, 5 mM de DTT). En option, inclure un inhibiteur de protéase dans la mémoire tampon. Incuber les protéines de 30 min à 56 ° C, suivies de 10 min à température ambiante. 4. Aklylate Groupes sulfhydryle libre de perturber de façon irréversible la formation de liaisons disulfures Préparer une solution fraîche 0,3 M iodacétamide dans l&#39;eau. ATTENTION! Iodoacetamide est hautement toxique. Ajouter 25 ul de 0,3 M d&#39;iodoacétamide (15 mM de concentration finale) et 500 ul de protéine et incuber pendant 20 min à l&#39;obscurité à température ambiante. Étancher iodacétamide en ajoutant 10 ul de 300 mM de DTT (5 mM concentration finale TNT). Stocker des protéines alkylés à -80 ° C. 5. Digestion des protéines TCA précipiter les protéines (comme décrit dans l&#39;étape 2) et remettre en suspension dans 1 ml de 50 mM de HEPES (pH 8,2), 1 M d&#39;urée. Préparer une solution stock de Lysyl endoproteinase (Lys-C) dans de l&#39;eau à une concentration de 2 ug / ul et ajouter 5 pl de la solution de protéine. Faire incuber le mélange pendant 16 heures à température ambiante. S&#39;assurer que la concentration finale Lys-C est de 10 ng / ul, et le rapport protéine-à-LysC (p / p) est 1/50-1/200. Remettre en suspension 20 ug de trypsine de qualité séquençage dans 40 ul de 50 mM d&#39;acide acétique, 5 ul (10 ug de trypsine) à la digestion par Lys-C et incuber pendant 6 heures à 37 ° C. Utiliser la même concentration de la protéase et les ratios protease-à-protéine pour Lys-C, tel qu&#39;utilisé pour la trypsine. 6. Phase inverse Peptide Extraction <ol><li> On acidifie par addition de peptides de l&#39;acide trifluoroacétique (TFA) à une concentration finale de 0,5% (pH d&#39;≈ 2). Attacher une colonne C18 à un collecteur d&#39;extraction. Utilisez le débit le plus élevé possible pour toutes les étapes sauf le chargement et l&#39;élution des peptides. </li><li> Colonne d&#39;eau avec 6 ml d&#39;acétonitrile (ACN). Laver la colonne avec 6 ml de 80% d&#39;ACN, 0,1% de TFA, puis s&#39;équilibrer avec 6 ml de TFA 0,1%. Ne pas laisser lecolonne fonctionner à sec entre les étapes. </li><li> Arrêter la pression de vide et charger 500 ug de peptides sur la colonne à un débit d&#39;environ 1 ml / min. Une fois que les peptides sont liés à la colonne, sous vide de redémarrage et laver avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec 3 ml de tampon d&#39;acide citrique (0,09 M acide citrique, 0,23 M de Na 2 HPO 4, à pH 5,5). Nota: Les montants élevés de peptides peuvent être marqués, mais la colonne C18 capacité de liaison devraient être au moins deux fois plus élevées que la quantité de peptide pour éviter la perte de l&#39;échantillon. </li></ol> 7. Sur colonne Peptide étiquetage par réductrice diméthylation (PENSER étiquetage) Effectuez cette étape sous une hotte chimique que le cyanure d&#39;hydrogène est libéré en faible concentration pendant le processus d&#39;étiquetage. <ol><li> Préparer 12 ml de tampons et de PENSER &quot;lourdes&quot; &quot;légères&quot; à la méthylation des amines peptide libre. Tampon de Redi lumière est constituée de 0,8% de formaldéhyde et 0,12 M cyanoborohydrure de sodium portant des atomes d&#39;hydrogène dans le eEIR naturelles distributions isotopiques dans le tampon d&#39;acide citrique. Tampon de Redi lourde est constituée de 0,8% de formaldehyde deutéré et 0,12 M de cyanoborohydrure de sodium deutéré dans un tampon d&#39;acide citrique. </li><li> Incuber colonne contenant des peptides par addition de 10 ml soit lumineux ou tampons de Redi lourd pour les colonnes contenant des peptides à raison de 1 ml / min et répéter à garantir un étiquetage complet. Laver la colonne avec 6 ml de TFA 0,1%, puis avec de l&#39;acide acétique à 1 ml de 0,5%. </li><li> Arrêter le vide et éluer les peptides marqués première avec 1 ml de 40% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5%, puis avec 1 ml de 80% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5% en utilisant un débit d&#39;environ 0,5 ml / min. Si vous le souhaitez, de mesurer l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage des échantillons individuels par spectrométrie de masse avant de mélanger des échantillons lourds et légers (voir «Les résultats représentatifs&quot;). Mélanger 01:01 échantillons peptidiques lourdes et légères marqué pour être quantifiée par spectrométrie de masse. </li></ol> 8. Peptide indépendante Mélange de pH basique de la phase inversée (BPRP) de chromatographie &lt;/ P&gt; PH basique en phase inverse (BPRP) chromatographie pour séparer le mélange de peptide en plusieurs fractions, qui sont analysées indépendamment par LC-MS/MS pour augmenter la couverture du protéome. <ol><li> Fractionner le mélange de peptides sur une colonne HPLC C18 en appliquant un gradient de concentration croissante d&#39;ACN dans 10 mM de bicarbonate d&#39;ammonium (pH 8). Commencer avec 5% (v / v) pendant 5 min ACN, augmenter à 35% ACN en 60 min, puis à 90% d&#39;ACN en 1 min. Conserver la CAN de 90% pendant 4 minutes avant de réduire la CAN à 5% de ré-équilibrer la colonne de 9 min. Recueillir 96 fractions de volume égal à une plaque de 96 puits (A1 à H12). Surveiller le fractionnement à l&#39;aide d&#39;un détecteur UV à 220 nm tandis que les peptides sont élution de la colonne (10 à 70 min dans les conditions décrites ici). </li><li> Combiner les fractions à partir de puits A1, C1, E1, et G1 (fraction A1), à partir de puits B1, D1, F1, H1 et (fraction B1), à partir de puits A2, C2, E2, et G2 (fraction A2) et en conséquence pour l&#39; fractions restantes. Retirez le solvent en utilisant une centrifugeuse sous vide. peptides Remettre en suspension de fractions A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 et B12 dans 130 pi de 1 M urea/0.5% de TFA et purifier l&#39;aide StageTips comme décrit à l&#39;étape 9. magasin fractions B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 et A12 à -20 º C. </li></ol> 9. Purify peptides par Stop and Go Extraction (StageTips) Préparer C18-StageTip 7 microcolonnes par emballage 200 conseils ul de pipettes avec deux C18 disques avec un diamètre interne (ID) de 1,07 mm. Mettez étape Conseils dans des tubes Eppendorf. Utilisez une micro à laver astuces avec 130 ul de méthanol, puis 130 ul de 80% d&#39;ACN, l&#39;acide acétique à 0,5%. Equilibrer StageTips avec 130 ul de 0,1% de TFA. Transfert mélange de peptides à StageTips et laver avec 130 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul de 0,1% de TFA, puis 40 ul d&#39;acide acétique à 0,5%. Éluer les peptides d&#39;abord avec 20 ul de 40% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5%, puis 20 ul de 80% d&#39;ACN, de l&#39;acide acétique à 0,5%. Combinez éluats unend sec par filtration sous vide. 10. Microcapillaire LC-MS/MS <ol><li> Dissoudre dans peptides 1-5 ul d&#39;acide formique à 5%, 5% de ACN à une concentration d&#39;environ 1 pg / pl. Résoudre ~ 1 pg peptides sur une 100 um x 20 cm C18-inversés colonne de HPLC en phase avec un gradient de 6-22% d&#39;ACN dans de l&#39;acide formique 0,125% appliqué sur 75 ou 100 min à un débit de ~ 300 nl / min. </li><li> Identifier des peptides en utilisant un Orbitrap Velos LTQ 12 ou liquide similaire plate-forme de spectrométrie de masse chromatographie avec un spectromètre de masse offrant haute résolution et haute précision de masse. Fonctionner le spectromètre de masse en mode dépendant des données avec un plein MS balayage (résolution de 60000) acquise dans l&#39;analyseur Orbitrap. Générer piège à ions linéaire spectres MS / MS pour les 20 ions les plus abondants détectés dans le spectre MS plein. Régler la commande automatique de gain (AGC) de cibles à 1 x 10 6 pour la pleine MS et 2000 pour MS / MS. Réglez durées maximales d&#39;accumulation d&#39;ions à 1000 mspour MS et 150 ms pour MS / MS. Exclure ions précurseurs de peptides fragmentés de sélection supplémentaire à partir de MS / MS pour 20-60 sec. </li></ol> 11. Acquisition de données MS / MS Identifier des peptides en comparant les fichiers RAW spectres MS / MS à une base de données théoriques avec un algorithme tel que SEQUEST 8 à l&#39;aide de ces paramètres (tableau 1). Tableau 1. Peptidiques Base de données Paramètres de recherche. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Paramètres généraux </td><td> digestion trypsique entièrement avec jusqu&#39;à deux clivages raté </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm d&#39;ions précurseur tolérance </td></tr><tr height="19"><td> 1,0 Da fragment tolérance d&#39;ions </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Modifications statiques </strong&gt; </td><td> 57,02146 Da sur la cystéine, carboxyamidomethylation </td></tr><tr height="19"><td> 28,03130 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l&#39;étiquette de diméthylation lumière </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Modifications dynamiques </td><td> 15,99491 Da sur la méthionine, l&#39;oxydation </td></tr><tr height="19"><td> 6,03766 Da sur la lysine et le peptide N-terminal, l&#39;étiquette de diméthylation lourde </td></tr></tbody></table><ol><li> Filtrer les peptides à un taux de faux positifs de 1% avec un procédé tel que le 9-stratégie de cible leurre en utilisant une base de données des cadres de lecture ouverts dans les orientations réelles et inversés. </li></ol> 12. Peptide Quantification Calculer les domaines de paires lourdes et légères de MS1 extraits ion chromatogrammes (zones de pointe MS1) et le peptide signal-sur-bruit (S / N) 10 rapports. Inclure paires peptidiques lorsque leur moyenne signal-noirapport est supérieur à cinq soi. Quantifier l&#39;abondance relative d&#39;un peptide dans les deux échantillons en tant que le rapport des aires des pics des versions MS1 lourdes et légères de la même peptide (MS1 de rapport de surface de pic). Calculer l&#39;abondance relative de la protéine comme étant le rapport de la MS1 surface du pic médian de tous les peptides dans la protéine.

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins.">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li><li>Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. 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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents ou d&#39;autres conflits d&#39;intérêts.

Plusieurs points font stable marquage isotopique des peptides en utilisant une méthode intéressante pour la protéomique quantitative diméthylation réductrice (étiquetage PENSER): réactifs peu coûteux en matière d&#39;étiquetage (réactifs coûtent moins de 1 $ par échantillon), la vitesse de réaction rapide (~ 10 min), l&#39;absence de produits secondaires, hauts reproductibilité (figures 3, 4), produits de réaction stables, la capacité à utiliser toute la protéase, et une grande effica...

Mesure des différences de concentration de nombreuses protéines entre les échantillons complexes est un défi central en protéomique. De plus en plus, ce qui est fait par marquage des protéines dans chaque échantillon avec des étiquettes isotopiques, combiner les échantillons, et l&#39;utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier les différences de concentration. Plusieurs méthodes existent pour marquage isotopique stable des protéines et des peptides. 15 N étiquetage 1 et 2 présentent SILAC marqueurs isotopiques métabolique in vivo, alors que iCAT 3, iTRAQ 4, et la réduction diméthylation 5 ajouter des tags sur les isotopes stables après extraction des protéines et la digestion. Parmi ces méthodes, diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) gagne en popularité comme une méthode reproductible peu coûteux à quantifier les différences de concentration de protéines dans presque n&#39;importe quel type d&#39;échantillon. Étiquetage Redi implique peptides réagissant avec du formaldéhyde pour former une base de Schiff, qui est ensuite réduitpar cyanoborohydrure. Cette réaction dimethylates groupes amino libres sur N-terminales et latérales de lysine chaînes et monomethylates ProLines N-terminaux. Le protocole décrit ici méthylation peptides dans l&#39;échantillon 1 avec une étiquette &quot;lumière&quot; en utilisant des réactifs avec des atomes d&#39;hydrogène dans leur distribution isotopique naturelle et de l&#39;échantillon 2 avec une étiquette &quot;lourd&quot; en utilisant du formaldéhyde et du cyanoborohydrure deutéré (Figure 1). Chaque groupe amino diméthylé sur un résultat de peptide dans une différence de masse de 6,0377 Da entre la lumière et les formes lourds, qui est utilisé pour distinguer les deux formes à l&#39;aide d&#39;un spectromètre de masse. Plus précisément, les abondances relatives des peptides sont quantifiées comme étant le rapport des aires de chromatogramme d&#39;ions MS1 extraites (MS1 de rapport de surface de pic) de la lumière et de la version lourde pour chaque paire d&#39;ions peptide. L&#39;abondance relative d&#39;une protéine est calculée comme le rapport médian MS1 ​​de surface de pic parmi tous les peptides dans la protéine. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole robuste pour conduitement Redi expériences de marquage par LC-MS/MS qui comprend peptide extraction en phase inverse en phase solide, en colonne étiquetage de Redi, peptide fractionnement par pH basique en phase inverse (BPRP) Chromatographie, et la purification de mélanges de peptides à l&#39;aide StageTips (Figure 2) . Nous discutons des avantages et des limites de l&#39;utilisation étiquetage PENSER pour protéomique quantitative.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T9159</td>
			<td style="width:319px;">protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">650501</td>
			<td>protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71736</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S8045</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">43816</td>
			<td>denature, reduce, alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">protease Inhibitor Complete Mini Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693124001</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H7523</td>
			<td>resuspend, extract, label protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C5670</td>
			<td>resuspend protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">Lysyl Endoprotease</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">129-02541</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:136px;">V5111</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">320099</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">tC18 Sep-Pak C18 cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">14261</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71435</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">deuterated formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium cyanoborodeuteride</td>
			<td>CDN isotopes</td>
			<td style="width:136px;">D-1797</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 &#181;m particle size)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td style="width:136px;">770450-902</td>
			<td>basic pH reversed-phase chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">399388</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18 Empore Disks</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:136px;">14-386-3&#160;</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">494437</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une méthode pour quantifier avec précision les différences d&#39;expression des protéines entre les échantillons à l&#39;aide de la spectrométrie de masse. Étiquetage Redi est réalisée en utilisant soit régulière (lumière) ou deutérés formes (lourds) de formaldéhyde et cyanoborohydrure de sodium à ajouter deux groupes méthyle à chaque amine libre. Ici, nous démontrons un protocole robuste pour l&#39;étiquetage de Redi et la comparaison quantitative de mélanges complexes de protéines. Les échantillons de protéines pour la comparaison sont digérés en peptides, marqués à porter la lumière ou des étiquettes de méthyle lourds, mélangé, et co-analysés par LC-MS/MS. Les abondances relatives des protéines sont quantifiées en comparant les aires des pics du chromatogramme d&#39;ions de versions lourdes et légères marqués du peptide constituant extrait de la MS spectres complet. La méthode décrite ici comprend la préparation d&#39;échantillons par phase inverse extraction en phase solide, en colonne étiquetage de Redi de peptides, un peptide fractionnement par pH rev basephase ersed (BPRP) Chromatographie, et StageTip purification de peptide. Nous discutons des avantages et des limites de l&#39;étiquetage Redi par rapport à d&#39;autres méthodes pour l&#39;incorporation des isotopes stables. Nous soulignons de nouvelles applications utilisant l&#39;étiquetage PENSER comme une méthode rapide, peu coûteux et précis pour comparer l&#39;abondance de protéines dans presque n&#39;importe quel type d&#39;échantillon.

Nous avons évalué l&#39;exactitude, la précision et la reproductibilité de l&#39;étiquetage Redi utilisant Saccharomyces cerevisiae et Clostridium phytofermentans lysats de cellules entières. Nous avons d&#39;abord quantifié l&#39;étiquetage efficacité de Redi d&#39;un mélange de C phytofermentans lysats de protéines à partir de cellulose (lourde marqué, H) et le glucose (étiquette de la lumière, L) cultures. Lorsque filtré à un peptide taux de fausses découvertes de 1%, cet ...

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l&#39;analyse des mélanges de protéines à l&#39;aide de l&#39;approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n&#39;importe quel type d&#39;échantillon.

Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

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Research

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Chemistry

16.0K vues.  Genoscope.  Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon. 

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

À grande échelle non ciblée profilage métabolomique du sérum par Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Recherche

Chimie

Improved In-gel Reductive &#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive &#946;-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.

Improved In-gel Reductive &amp;#946;-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive &#946;-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.

Amélioration dans le gel sulfo-réductrices glycomique β-élimination complète pour O-liés et par spectrométrie de masse

Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Examen quantitative et qualitative des interactions entre particules à l&#39;aide de la sonde colloïdale nanoscopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

A Quantitative Glycomics et protéomique Stratégie Purification Combined

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Normes pour Quantitative Metalloproteomic Analyse Utilisation Taille Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a result of the direct detection of the mass-to-charge ratio of each target molecule. However, MS-based proteomics, like most other analytical techniques, has a bias towards measuring high-abundance analytes, so it is challenging to achieve detection limits of low ng/mL or pg/mL in complex samples, and this is the concentration range for many disease-relevant proteins in biofluids such as human plasma. To assist in the detection of low-abundance analytes, immuno-enrichment has been integrated into the assay to concentrate and purify the analyte before MS measurement, significantly improving assay sensitivity. In this work, the immuno- Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) technology is presented for the quantification of proteins and peptides in biofluids, based on immuno-enrichment on beads, followed by MALDI-MS measurement without prior elution. The anti-peptide antibodies are functionalized on magnetic beads, and incubated with samples. After washing, the beads are directly transferred onto a MALDI target plate, and the signals are measured by a MALDI-Time of Flight (MALDI-TOF) instrument after the matrix solution has been applied to the beads. The sample preparation procedure is simplified compared to other immuno-MS assays, and the MALDI measurement is fast. The whole sample preparation is automated with a liquid handling system, with improved assay reproducibility and higher throughput. In this article, the iMALDI assay is used for determining the peptide angiotensin I (Ang I) concentration in plasma, which is used clinically as readout of plasma renin activity for the screening of primary aldosteronism (PA).

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

A protocol for the protein quantification in complex biological fluids using automated immuno-MALDI (iMALDI) technology is presented.

Peptide et protéine Quantification moyen automatisé Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of multiplexing up to 22 or 24 samples with tandem mass tags or isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectively, in a single experiment. This enhanced sample multiplexing considerably reduces mass spectrometry acquisition times and increases the utility of the expensive commercial isobaric reagents. However, the manual process of sample handling and pipetting steps in the strategy can be labor intensive, time consuming, and introduce sample loss and quantitative error. These limitations can be overcome through the incorporation of automation. Here we transferred the manual cPILOT protocol to an automated liquid handling device that can prepare large sample numbers (i.e., 96 samples) in parallel. Overall, automation increases feasibility and reproducibility of cPILOT and allows for broad usage by other researchers with comparable automation devices.

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) is an enhanced sample multiplexing strategy that is capable of increasing the number of samples that can be analyzed simultaneously with available isobaric tags. Incorporation of a robotic platform has greatly increased experimental throughput, reproducibility, and quantitative accuracy.

Multiplexage automatisé de l’échantillon à l’aide de l’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et du marquage isobarique (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Stable Aqueous Suspensions of Manganese Ferrite Clusters with Tunable Nanoscale Dimension and Composition

Manganese ferrite clusters (MFCs) are spherical assemblies of tens to hundreds of primary nanocrystals whose magnetic properties are valuable in diverse applications. Here we describe how to form these materials in a hydrothermal process that permits the independent control of product cluster size (from 30 to 120 nm) and manganese content of the resulting material. Parameters such as the total amount of water added to the alcoholic reaction media and the ratio of manganese to iron precursor are important factors in achieving multiple types of MFC nanoscale products. A fast purification method uses magnetic separation to recover the materials making production of grams of magnetic nanomaterials quite efficient. We overcome the challenge of magnetic nanomaterial aggregation by applying highly charged sulfonate polymers to the surface of these nanomaterials yielding colloidally stable MFCs that remain non-aggregating even in highly saline environments. These non-aggregating, uniform, and tunable materials are excellent prospective materials for biomedical and environmental applications.

We report a one-pot hydrothermal synthesis of manganese ferrite clusters (MFCs) that offers independent control over material dimension and composition. Magnetic separation allows rapid purification while surface functionalization using sulfonated polymers ensures the materials are non-aggregating in biologically relevant medium. The resulting products are well positioned for biomedical applications.

Suspensions aqueuses stables d’amas de ferrite de manganèse avec dimension et composition à l’échelle nanométrique accordable

Manganese ferrite clusters (MFCs) are spherical assemblies of tens to hundreds of primary nanocrystals whose magnetic properties are valuable in diverse ...

Identification des organes primaires chez les plantes médicinales à l’aide de l’étiquetage au 13C6-glucose

13C6&#45;Glucose Labeling Associated with LC&#45;MS&#58; Identification of Plant Primary Organs in Secondary Metabolite Synthesis

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary metabolite in Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Hand. -Mzt. (PPY), Paris saponin (PS) has a variety of pharmacological activities and PPY is in increasing demand. This study established leaf, rhizome, and stem-vascular-bundle 13C6-Glucose feeding and non-feeding four treatments to precisely certify the primary organs involved in Paris saponins VII (PS VII) synthesis. By combining liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), the 13C/12C ratios of leaf, rhizome, stem, and root in different treatments were quickly and accurately calculated, and four types of PS isotopic ion peak(M&#8722;) ratios were found: (M+1) &#8722;/M&#8722;, (M+2) &#8722;/M&#8722;, (M+3) &#8722;/M&#8722; and (M+4) &#8722;/M&#8722;. The results showed that the ratio of 13C/12C in the rhizomes of the stem-vascular-bundle and rhizome feeding treatments was significantly higher than that in the non-feeding treatment. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves increased significantly under leaf and stem-vascular-bundle feeding treatments. Simultaneously, compared to the non-feeding treatment, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the leaves under rhizome treatment showed no significant difference. Furthermore, the ratio of PS VII molecules (M+2) &#8722;/M&#8722; in the stem, root, and rhizome showed no differences among the four treatments. Compared to the non-feeding treatment, the ratio of the Paris saponin II (PS II) molecule (M+2) &#8722;/M&#8722; in leaves under leaf feeding treatment showed no significant difference, and the (M+3) &#8722;/M&#8722; ratio of PS II molecules in leaves under leaf feeding treatment were lower. The data confirmed that the primary organ for the synthesizing of PS VII is the leaves. It lays the foundation for future identification of the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants.

Pleins feux sur l’auteur : Profilage des organes primaires des plantes à l’aide du marquage au 13-C6-glucose et de la LC-MS

The developed method of 13C6-Glucose labeling combined with liquid chromatography high-resolution mass spectrometry is versatile and lays the foundation for future studies on the primary organs and pathways involved in the synthesis of secondary metabolites in medicinal plants, as well as the comprehensive utilization of these secondary metabolites.

13Marquage C6-glucose associé à la LC-MS : identification des organes primaires des plantes dans la synthèse des métabolites secondaires

This paper presents a novel and efficient method for certifying primary organs involved in secondary metabolite synthesis. As the most important secondary ...