The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

1. בידוד של ביציות Xenopus וMicroinjection של קרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ביציות מlaevis Xenopus נקבה בוגרת. לטשטש בעלי חיים בMS222 0.2%, ולכרות אונות השחלות דרך חתך בבטן קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הביציות משחלות האונות על ידי עיכול אנזימטי ב19 מעלות צלזיוס במשך שעה 3-4 עם 600-700 U / ml מסוג 2 collagenase מhistolyticum Clostridium המומס בתמיסת סידן חופשי OR2 (מתכון בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירה, הנח את ביציות defolliculated בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ משקפת בנתרן גבוה המכיל פתרון (ND96: מתכון בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ביציות V-VI במה ומניח אותם בצלחת פטרי נוספת עם פיפטה פסטר. הערה: פיפטה בלאנט פסטר ידי בוער כדי למנוע פגיעת ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק ביציות עם קרנה (למשל 0.2 ng למקטע αβγENaC). ממיסים cRNAs במי RNase ללא. הערה: סך הכלנפח מוזרק לתוך כל ביצית הוא 46 NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות הזריקו ביציות ב19 ° C בתמיסת נתרן נמוכה כדי למנוע העמסת נתרן של הביציות (ND9: מתכון בטבלה 1). להשלים את הפתרון עם פניצילין 100 נתרן U / ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין סולפט כדי למנוע התפתחות חיידקים. לטפל בזהירות את הביציות כדי להגביל את כמות ביציות פגומות או מתות ולשמור אותם בקבוצות קטנות בודדות בבארות 12 גם צלחת מלאה בפתרון אמבטיה בשני הימים לאחר הזרקת קרנה. </li></ol> 2. ביצוע ניסויי מתח מהדק שתי אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ביציות יומיים לאחר ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק אחד של מערכת הכבידה האכילה זלוף עם פתרון ND96 ועוד מזרק עם פתרון ND96 מכיל אמילוריד (2 מיקרומטר). הר מזרקים 50 ס&quot;מ מעל חדר האמבטיה ביצית. הערה: הריכוז של אמילוריד מעכב ENaC נבחר להיות גבוה יותר 20 פעמים מאשר IC 50 </תת&gt; (100 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מקור אור קר 150 הלוגן W ולהתאים אותו ל10 ס&quot;מ מעל חדר האמבטיה ביצית המאפשר ויזואליזציה טובה עם מיקרוסקופ המשקפת. לאחר מכן הפעל את השאיבה ולהתאים את צינור היניקה בסוף של חדר האמבטיה ביצית. מתאם לאתר ההפך צינור יניקה לsuperfusion צינורות &quot;נכנס לאמבטיה הביצית. הערה: כוח היניקה חייב להיות מספיק כדי לתמוך בזרימה רציפה של הפתרון superfusing הביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מהירות superfusion של כל פתרון ל3-5 מיליליטר / דקה על ידי שימוש במכשיר בקרת הזרימה הכבידה iv. חבר את צינורות superfusion עם מתאם לתא האמבטיה ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך נימי זכוכית עם חולץ micropipette להשיג בקטרים ​​קצה &lt;1 מיקרומטר. ואז למלא נימים ל~ 1/4 עם 3 M KCl. הערה: ודא שחלק כלור של חוט הכסף של בעל אלקטרודה הוא שקוע בפתרון KCl. הגעה לבועות אוויר בקצה של הנימים. בועות אוויר פוגעות בצפחותrement ידי הגדלת קיבול תועה התנגדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הנימים לתוך מחזיקי אלקטרודה של הזרם ומתח האלקטרודה ולהכניס אותם לתוך אמילוריד ND96 מכיל פתרון (2 מיקרומטר) באמצעות מיקרו-מניפולטורים. </li></ol> 3. מדידה של כל תא זרמים אמילוריד רגישים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפס פוטנציאל אלקטרודה של האלקטרודה המתח (מ &#39;V) ואת האלקטרודה הנוכחית (ה V) על ידי התאמה מ&#39; V ו-e V לקזז כפתורי הערה:. ההתנגדות צריכה להיות 1-2 MΩ לאלקטרודה למדידה מ &#39;V ו0.5 -1 MΩ לאלקטרודה ההזרקה הנוכחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצית אל תוך חדר האמבטיה בקרבת האלקטרודה חישת מתח. הערה: אל תפגע בביצית במהלך כל שלבי העברה אלה. השתמש פיפטה פסטר להעביר את הביצית. כדי למנוע נזק לביצית הקצוות של פיפטה יש הקהה ידי בוער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדקור את oocytes בעדינות עם שני microelectrodes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פוטנציאל ההחזקה במגבר ל-60 mV ולהפעיל את רשמקול התרשים. הפעל את אמילוריד (2 מיקרומטר) המכיל פתרון. הערה: הנוכחי צריך להיות על 0 ± 0.5 μA. זרמי דליפה גדולים יותר מצביעים impalement דולף. לכן, יש לדחות ביציות אלה. יתר על כן, זרמי הדליפה שנמדדו בנוכחות אמילוריד (2 מיקרומטר) צריכים להיות דומים בαβγ-WT להביע ביציות לאלה שנמדדו בENaC αβγ מוטנטי להביע ביציות. זה מצביע על כך המוטציות אינן משפיעות על אמילוריד הרגישות של הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בהקלטה. אם יש צורך להתאים את הרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרם הנמדד מגיע לרמה יציבה, לשנות לפתרון ללא אמילוריד. הערה: סטיות הנוכחיות כלפי מטה את העקבות הנוכחיות מתאימות לזרמים פנימה, דהיינו תנועה של מטען חיובי (Na +) מהצד תאי אל תוך התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> After הוא הגיע לרמה נוכחית (לאחר ~ 60 שניות), לעבור superfusion חזרה לפתרון אמילוריד מכיל. אחרי הנוכחי של הביצית מגיעה לנקודת ההתחלה הראשונית נוכחית, כבה את מהדק המתח והעדינות למשוך את האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאפשר הודבק מכתבים מחדש של קרום הפלזמה באתרי impalement, הנח את הביצית לאחד טוב של צלחת 96 היטב המכילה 100-150 μl של פתרון ND96 פרוטאז בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 5 דקות, להעביר ביצית לפרוטאז המכיל פתרון או לפתרון שליטה ללא פרוטאז לזמן דגירה 30 דקות. הערה: זמן הדגירה תלוי בפרוטאז והערוץ למד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב הדגירה לחזור על המדידה הנוכחית (ראה 3.2 ובאים). הערה: אפשר למדוד&gt; 90% מהביציות לאחר הדגירה בפתרון פרוטאז. </li></ol> 4. Biotinylation Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר וזורקים ביציות פגומות מתחת למיקרוסקופ המשקפת. הערה: השתמש להזריקed ביציות מאותה אצווה למדידות זרם ולניסויי biotinylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור ביוטין ב RT לפחות 20 דקות לפני השימוש בו בניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות: ND96 וND96 מכילים פרוטאז המתאים. הכן טפטפות פסטר על ידי התיוג ועל ידי בוער בקצרה העצות שלהם, כדי למנוע פגיעה בביציות. הערה: כאן, נעשה שימוש במיקרוגרם / מיליליטר chymotrypsin פרוטאז 2 בND96. טיפול בכל אחת מקבוצות עם טפטפת נפרד כדי למנוע זיהום צולב של פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא היטב בכל צלחת 6 היטב עם 2.5 מיליליטר שליטה ND96 או ND96 מכילה פרוטאז ב RT. לאחר מכן להפקיד 30 ביציות לכל היטב דגירתם ל30 דקות ב RT. הערה: לנהלים הבאים זה חשוב לשמור על דגימות קרח בכל העת. כל צעדי צנטריפוגה מבוצעים בב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא היטב בכל צלחת 6 היטב חדשה עם 2.5 ND96 מיליליטר (כל קבוצה צריכה 3 בארות לשלבי הכביסה) ולשקול את ביוטין. הערה: p ביוטין 2.5 מ&quot;גאה כן נדרש (1 מ&quot;ג / מיליליטר). ממיסים את יוטין במאגר biotinylation (כלומר 25 יוטין מ&quot;ג (ל10 קבוצות) ב25 חיץ biotinylation מיליליטר (מתכון בטבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל קבוצה של ביציות למלאו היטב עם ND96 2.5 מיליליטר. העברת ביציות ברצף לשתי בארות נוספות עם ND96 כדי לשטוף את כל פרוטאז שנותר. דגירה הביציות במשך 5 דקות בND96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הביציות לפתרון ביוטין המכיל גם 2.5 מיליליטר דגירה אותם עם תסיסה עדינה (&#39;שייקר&#39;) ל15 דקות. הערה: מזעור ND96 הועבר עם פיפטה כדי למנוע דילול של פתרון ביוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל קבוצה של ביציות ל2.5 מיליליטר חיץ להרוות המכיל גם (מתכון בטבלה 1) כדי לעצור את תגובת biotinylation. לאחר מכן, להעביר את כל קבוצה של ביציות לתוך באר שני המכיל גם 2.5 מיליליטר להרוות את חיץ דגירה במשך 5 דקות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביציות פגומות או מתות. הערה:בחר את אותו מספר ביציות לכל קבוצה להליך הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל קבוצה של ביציות לצינור microcentrifuge פלסטיק 1.5 מיליליטר. הערה: מזער את הכמות של חיץ להרוות שמועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, lyse הביציות על ידי העברתם באמצעות מחט 27 G במאגר תמוגה מיליליטר 1 (מתכון ראה טבלה 1) השלים עם מעכבי פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysates 10 דקות ב 1,500 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהעביר אותו לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge מכיל 0.5% Triton-X-100 וNP40 0.5%. זורק את הכדור שנותר. הערה: supernatant מכיל חלבוני קרום פלזמה biotinylated וחלבונים תאיים שאינו biotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות microcentrifuge עבור 20 דקות על קרח. שוב ושוב מערבולת הצינורות בתקופה זו כדי להמס לחלוטין את החלבונים בNP40 וTriton-X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של חרוזים agarose לכל קבוצת ביצית במשך 3 דקות צנטריפוגה 100 μl ב1,500 x גרם. לאחרצנטריפוגה להסיר supernatant מפתרון חרוזים ולשטוף שלוש פעמים עם חיץ תמוגה לאזן את החרוזים עם חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של חרוזים נשטפו לתוך צינור אחד microcentrifuge המכיל את החלבון-חומר ניקוי, הפתרון מוכן ב4.13 לאפשר מחייב של חלבוני biotinylated לחרוזי פיפטה 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות microcentrifuge עם O הסיבוב תקורה / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות microcentrifuge 3 דקות ב 1,500 x גרם. לאחר מכן להעביר את supernatant לתוך צינור חדש. הערה: חלבונים תאיים אינם מסומנים עם ביוטין. Supernatant יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C. לא לשאוב את החרוזים. </li></ol> 5. איתור של ENaC מחשוף רסיסים על פני התא על ידי ניתוח הכתם המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם חיץ תמוגה ולהוסיף של חיץ מדגם SDS-PAGE 2x 100 μl. הערה: דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס או מייד מוכנה לניתוח כתם מערבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רתיחה שלamples למשך 5 דקות על 95 מעלות צלזיוס ולאחר מכן צינורות מניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במשך 3 דקות ב20,000 XG ו פיפטה את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש. הערה: supernatant זה מכיל חלבוני קרום הפלזמה biotinylated מתא השטח של הביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח 30 μl של supernatant זאת על ידי כתם מערבי לחקור ברי מחשוף על פני התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את חלבוני biotinylated ידי-SDS (אלקטרופורזה נתרן גופרתי dodecyl polyacrylamide ג&#39;ל) באמצעות ג&#39;ל מתאים (8%, 10%, 12% בהתאם למשקל המולקולרי של שברי המחשוף נחקרו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את החלבונים לdifluoride polyvinylidene קרומים (PVDF) על ידי סופג חצי יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור את הממברנה עם נוגדנים ספציפיים נגד γENaC האנושי המכוונים נגד אפיטופ בC-הסופית (ראה איור 3 ו13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנוגדנים נגד ארנב עז שכותרת חזרת peroxidase כאנטי משנייםגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות אותות chemiluminescent. </li></ol>

<ol>
	<li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENaC+at+the+cutting+edge:+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases.">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li><li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+serine+proteases.">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li><li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases.">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li><li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating.">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li><li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase.">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li><li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-activated+receptors:+contribution+to+physiology+and+disease.">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li><li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+&#946;-subunit.">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin &#946;-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li><li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S.">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li><li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes.">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li><li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+epithelial+Na++channels+by+cleaving+the+&#947;-subunit.">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the &#947;-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li><li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel.">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li><li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel.">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li><li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+&#947;-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel.">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the &#947;-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li><li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li><li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Na++removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na+-channel+(ENaC)+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval.">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בכתב היד הזה גישה המתודולוגית שיושמה בהצלחה ללמוד את מנגנוני ההפעלה של ENaC ידי פרוטאזות מתוארת 8,13. המערכת המבוססת היטב Xenopus laevis ביצית הביטוי שימשה לENaC תפקודי המפורש. פונקצית ENaC הוערכה עם טכניקת המתח-clamp שתי אלקטרודות הקונבנציונלית. מכוון mutagenesis אתר הועסק כדי לזהות אתרי מחשוף פרוטאז רלוונטיים מבחינה תפקודית. ניסויי biotinylation בוצעו במקביל למדידות אלקטרו אפשרו לתאם את המראה של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא עם הפעלה נוכחית מפרקי חלבונים. קורלציה בין מהלך הזמן של הפעלה הנוכחית ואת המראה של שברי מחשוף מפרקי חלבונים בתא השטח תומכת ברעיון של הפעלת ערוץ מפרקי חלבונים. הקלטות המתח-clamp שתי אלקטרודות דורשות impalement של oocyte עם שני microelectrodes. הליך זה מבוצע בדרך כלל פעם אחת בלבד בביצית בודדת. עם זאת, זה היה אפשרי על מנת להסיר את microelectrodes לאחר הקלטה נוכחית כל תא ראשוני ללא נזק נראה לעין לביצית. ואכן, קרום הפלזמה באתרי impalements נראה לחתום מחדש תוך כמה דקות. לפיכך, לאחר שסיים את מדידת המתח-clamp שתי האלקטרודה ראשונה, זה אפשרי להעביר את הביצית מתא הזרימה הניסיונית של התקנת המתח-clamp שתי אלקטרודות לצינור microfuge או גם צלחת 96 היטב מלאה נפח קטן של פתרון מבחן או שליטה. לאחר מכן, באותה הביצית יכולה להיות מועברת חזרה לתא הזרימה והוא יכול להיות משופד שוב לבצע מדידת המתח-clamp שתי האלקטרודה שנייה. למרבה הפלא, זרמים בתיווך ENaC לא משתנים הרבה בין המדידה הראשונה ושנייה, כאשר הביצית נשמרה בפתרון שליטה. לעומת זאת, דגירה של הביצית בסול פרוטאז המכילution אחרי המדידה הראשונה הביא הנוכחי בתיווך ENaC המוגבר במדידה השנייה (איור 2). ממצא זה מצביע על הפעלת ערוץ מפרקי חלבונים. ביצוע שתי מדידות זרם נפרדות בביצית אחת מציע את היתרון שהביצית יכולה להיות חשופה לפרוטאזות או סוכנים תרופתיים אחרים בין שתי המדידות לאורך זמן משתנה בנפח קטן של פתרון מבחן. זה חשוב כאשר משתמשים בסוכנים שהם יקרים ו / או לא זמינים בכמויות גדולות, למשל הכנות פרוטאז מטוהרים. הזמינות המוגבלת של סוכנים עשויה להפוך אותו לבלתי אפשרי (או מעבר להישג יד) כדי להשתמש בם בהקלטות המתח-clamp שתי אלקטרודה רציפות בגלל הכמויות הגדולות של פתרון מבחן הנדרש לרציפות superfusing הביציות עם ספיקות של כמה מיליליטר לדקה. יתר על כן, מדידות המתח-clamp שתי אלקטרודה רציפות מוגבלות על ידי Phenom הידועEnon של מוזנח ערוץ ספונטני גם תאר ל15 ENaC. לעומת זאת, חשיפת ביציות כדי לבדוק פתרונות בין שתי מדידות נפרדות לעד שעה או יותר בדרך כלל אינו מהווה בעיה (ראה איור 4 א). לבסוף, שתי מדידות רציפים שבוצעו באותה הביצית מאפשרות תצפיות לזווג של השפעות תרופה. זו יש יתרון על פני מדידות מזווגים משתי קבוצות נפרדות של ביציות (שטופלה פרוטאז ורכב שטופלה), משום שהיא מפחיתה את הבעיה של שונות גבוהות בין הביציות, בדרך כלל נצפו בביטוי ערוץ יון. עם תצפיות לזווג והאפשרות לנרמל את הנתונים למדידה הראשונה, פחות ביציות נדרשות לכל קבוצת ניסוי כדי להדגים אפקט משמעותי של סוכן תרופתי. נורמליזציה של נתונים גם עושה את זה קל לסכם נתונים מקבוצות שונות של ביציות עם רמות שונות ערוץ יון ביטוי וזרמים שונים ומכאן בסיס (איור 2). כמובן, ניסויי שליטה נחוצים לגישה זו על מנת להוכיח כי פעילות ערוץ יון של עניין נותרת יציבה בביציות שליטת רכב שטופלה מהראשונה למדידה השנייה (ראה איור 2). על מנת להוכיח כי הפעלה נוכחית מפרקי חלבונים קושרים עם הופעתו של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא, גישת biotinylation תוארה במקור על ידי האריס et al. 9 ניתן להשתמש. הליך זה (כמפורט בסעיף הפרוטוקול ומוצג באיור 4) הותאם להפגין חשיפת שערוצי פרוטאזות וההפעלה הבאה של זרמים בתיווך ENaC הקביל על ידי הופעתו תלויה בזמן של שברי מחשוף. שיטת biotinylation גם מאפשרת הניתוח של עלייה כללית או ירידה של חלבונים בממברנה על פני התא. לכן, שיטה זו מתאימה כדי לחקור את ההשפעה של פרוטאזות וPhar האחרסוכני macological על הכנסת ערוץ לתוך קרום הפלזמה או על שליפת ערוץ. יתר על כן, ניתוח כתם המערבי של חלבוני קרום הפלזמה biotinylated מאפשר זיהוי של שברי חלבון (לדוגמא: שברי ENaC מפרקי חלבונים) או שינויים בדפוס glycosylation אשר עשוי להיות רלוונטיות מבחינה תפקודית. לסיכום, השילוב של שיטות המשמש כדי לחקור את ההשפעה של גירוי של פרוטאזות בכל תא זרמים בתיווך ENaC ולהפגין מתאם עם המופע של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא עשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של יישומים. בפרט, שיטות אלו עשויות להיות מתאימות כדי לענות על שאלות דומות לגבי הרגולציה של ערוצים אחרים יון, מובילים או קולטנים הטרנסממברני (למשל הקולטנים מופעל פרוטאז PARS).

פרוטאזות הן אנזימים שמעורבים בתגובות פיסיולוגיות שונות הנעות בין השפלה מפרקי חלבונים הידועה של חלבונים, בהקשר של מערכת העיכול, למפלי פרוטאז מתוחכמים המעורבים במסלולי איתות רגולציה מורכבים. פרוטאזות מסווגות לשבע קבוצות על פי האתר הפעיל הקטליטית שלהם: aspartate, asparagine, ציסטאין, חומצה גלוטמית, metallo, סרין, ופרוטאזות תראונין. פרוטאזות שונות למקד לאתרי מחשוף ברורים שהם לא תמיד קלים לחזות מהמבנה הראשוני של חלבון. מסד הנתונים Merops <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">(http://merops.sanger.ac.uk/)</a> מספק מידע מפורט על מגוון רחב של פרוטאזות ואתרי המחשוף המועדף שלהם. ניתן לזהות אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית באמצעות מכוון mutagenesis אתר. היא מבוססת היטב כי עיבוד מפרקי חלבונים של ENaC הוא מנגנון חשוב של הפעלה של ההוא 1,2 ערוץ יון מסוים. מעניין, יש ראיות לכך שהפונקציה של 1a חישת החומצה הקשור ערוץ יון (ASIC1a) יכולה גם להיות שונה על ידי פרוטאזות 3-5. נכון לעכשיו היא נשארת שאלה פתוחה אם מחשוף ערוץ מפרקי חלבונים ממלא תפקיד פיסיולוגי רלוונטי בהסדרת פעילותם של תעלות יונים אחרות או מובילים. עם זאת, הוא מבוסס היטב כי מחשוף מפרקי חלבונים מפעיל קבוצה של קולטני G-חלבון בשילוב, הקולטנים מופעל פרוטאז (PARS) 6. פרוטאזות סרין כמה (פרוטאזות למשל הפעלת ערוצים (CAP1-3), chymotrypsin, טריפסין, furin, plasmin, elastase נויטרופילים, וkallikrein) הוכחו להפעיל proteolytically ENaC 2. בנוסף לפרוטאזות סרין, קבוצות אחרות של פרוטאזות עשויות להיות מעורבות בהפעלת ENaC מפרקי חלבונים. ואכן, הנתונים אחרונים מראה כי פרוטאינאז meprin-β 7 ופרוטאז ציסטאין cathepsin-S 8 יכול גם Activate ENaC. עם זאת, פרוטאזות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (פתים-) להפעלת ENaC להישאר שייקבעו ועשויות להיות שונות מהרקמה לרקמה. פרוטאזות ידועות לדבוק מעדיפים באתרים מסוימים ברצף חומצות אמינו. לדוגמא, chymotrypsin פרוטאז סרין מציג דפוס מחשוף ספציפי ביקוע אחרי חומצה אמינית ארומטיים שאריות פנילאלנין וטירוזין. לעומת זאת, טריפסין פרוטאז סרין מעדיף דבק לאחר יזין השאריות הבסיסי או ארגינין. באמצעות בונה γENaC אדם מוטציה שנוצרה על ידי מכוון mutagenesis אתר, אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית בENaC הביעו heterologously במערכת ביטוי הביצית יכולים להיות מזוהים 8-13. על ידי הזרקת קרנה ליחידות משנת שלוש ENaC (αβγ) לתוך ביציות מבודדות, ENaC יכול לבוא לידי ביטוי מבחינה תפקודית בתאים אלה ופעילותם של ערוצים נוכחים בקרום הפלזמה ניתן למדוד על ידיבאמצעות טכניקת המתח-clamp שתי אלקטרודות. על ידי שימוש באמילוריד משתן, מעכב ENaC ספציפי, רכיב אמילוריד רגיש בתיווך ENaC כל התא הנוכחי (ΔI עמי) יכול להיות מופרד מזרמי דליפה נוקבים או מזרמים שנערכו על ידי תעלות יונים אחרות. לפיכך, ערכי ΔI עמי משקפים פעילות ENaC כללית ויכולים שייקבעו על ידי הפחתת כל תא זרמים נמדדים בנוכחות אמילוריד מכל תא הזרמים המקביל נרשמו בהעדר אמילוריד. כדי לבדוק אם פרוטאז יש השפעה ממריצה על ENaC, ΔI עמי נמדד פעמיים באותו הביצית, כלומר לפני ואחרי הדגירה של הביצית בתמיסה המכיל פרוטאז. גידול של ΔI עמי מהראשון למדידה השנייה מציין הפעלת ENaC מפרקי חלבונים. Chymotrypsin או טריפסין ידוע כדי לעורר מקסימאלי ENaC במערכת ביטוי הביצית 2,14 וניתן להשתמש בם לconfirm כי הפעלת ENaC מפרקי חלבונים ניתן לזהות באצווה מסוימת של ביציות. במקביל למדידות זרם כל התא, גישת biotinylation 9 הייתה בשימוש כדי לחקור האם הגידול בΔI עמי מזוהה עם חשיפה של הביציות לפרוטאזות בקורלציה עם הופעתו של ENaC מחשוף שברים על פני התא. חלבונים בתא השטח מסומנים עם ביוטין ויכולים להיות מופרדים מחלבונים תאיים באמצעות קשירת חלבוני biotinylated לחרוזי agarose כותרת Neutravidin. ניתן לנתח חלבוני biotinylated על ידי כתם מערבי. שברי מחשוף γENaC על פני התא ניתן לאתרם באמצעות נוגדן ספציפי המכוון כנגד אפיטופ בC-הסופית של γENaC. כדי לזהות את האתר רלוונטי מבחינה תפקודית מחשוף (ים), שחזה יכולים להיות מוטציה אתרי מחשוף שימוש מכוון mutagenesis אתר. ערוצי wildtype והמוטציה הם בהשוואה בניסויים מקבילים באמצעות ביציות מהיםאצווה איימי. עם גישה המתודולוגית זה הודגם לראשונה כי הפעלת מפרקי חלבונים של כל תא זרמים בתיווך ENaC קורלציה עם המראה תלוי הזמן של ENaC מחשוף שברים על פני התא. תוצאות אלו מצביעות על קשר סיבתי בין מחשוף ערוץ והפעלת ערוץ. יתר על כן, באמצעות מכוון mutagenesis אתר של אתרי מחשוף המשוערת בשילוב עם הטכניקה של שתי האלקטרודה המתח-clamp, אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית לplasmin, chymotrypsin 13 וcathepsin-S 8 זוהו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

כדי לחקור האם plasmin פרוטאז סרין יכול להפעיל את הזרמים בתיווך ENaC, ΔI עמי של ביציות ENaC-להביע בודדות נקבע לפני ואחרי 30 דגירה דקות של הביציות בללא פרוטאז (שליטה) (איור 2 א) או בתמיסה המכיל plasmin (איור 2B) תוך שימוש בטכניקה של שתי האלקטרודה המתח-clamp (ראה איור 1). חשיפה לplasmin מוגברת ΔI עמי בכל ביצית שנמדדה. לעומת זאת, בניסויים שליטים, 30 דגירה דקות של ביציות ENaC-לבטא בפתרון נטול פרוטאז הייתה השפעה זניחה (איור 2 C, D). לכן, על ידי שימוש בשיטה זו של גירוי הנוכחי בתיווך ENaC ידי plasmin ניתן לאתרם. כדי לחקור את ההשפעות של מוטציה אתרי מחשוף המשוערת על ההפעלה של זרמים בתיווך ENaC, כמו גם על מחשוף ערוץ, את ההשפעה של chymotrypsin על WT-ENaC הושוותה עם זה עלENaC מוטציה עם prostasin מוטציה ואתרי מחשוף plasmin (RKRK178AAAA γ; K189A). במהלך הפעלת ערוץ על ידי chymotrypsin כמו גם את המראה של ENaC מחשוף מוצרים על פני תא הזמן נחקר על ידי שימוש פעמים דגירה פרוטאז שונות (איור 4 א). זה היה הוכיח כי עיכובי ערוץ המוטציה ומפחיתים את ההפעלה הנוכחית בתיווך ENaC ידי chymotrypsin. זה הקביל להופעה מאוחרת של שבר נמוך מולקולרי γENaC משקל מחשוף של 67 kDa המתאימים למקטע ביקע באופן מלא. שברי מחשוף התגלו באמצעות נוגדן γENaC המכוון נגד אפיטופ בC-הסופית (איור 3). גישה המתודולוגית זה מוכיחה כי במהלך הפעלת מפרקי חלבונים של זרמים בתיווך ENaC הזמן בקורלציה עם הופעתו של מוצר מחשוף 67 kDa γENaC על פני התא (איור 4 ב &#39;, ג&#39;). זו תומכת ברעיון שלקשר סיבתי בין מחשוף ערוץ מפרקי חלבונים והפעלת ערוץ 13. יתר על כן, על ידי שילוב של מדידות זרם וזיהוי של שברי γENaC בתא השטח זה היה הוכיח כי אתרי מחשוף המוטציה הם מבחינה פונקציונלית רלוונטיים להפעלת ערוץ מפרקי חלבונים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. נוהל קביעת האפקט של גירוי פרוטאז על ENaC הביע heterologously בXenopus laevis ביציות. פעילות ENaC מוערכת על ידי מדידת רכיב כל תא אמילוריד רגיש הנוכחי ΔI עמי. <img alt="איור 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> איור 2. Plasmin מגרה curren תיווך ENaCts בביציות להביע ENaC. ביציות (AD) להביע ENaC אדם הודגרו למשך 30 דקות בתמיסה נטול פרוטאז (שליטה) או בתמיסה המכילה plasmin (10 מיקרוגרם / מיליליטר). כדי לקבוע ΔI עמי לפני (-) ואחרי דגירה (+), ביציות היו מהודקות בפוטנציאל החזקת -60 mV (A, B) ארבע עקבות הנוכחיות נציג כל התא מצרור אחד של ביציות.. אמילוריד (עמי) היה נוכח בפתרון האמבטיה לעכב באופן ספציפי ENaC כפי שצוין על ידי פסים שחורים. (C) נקודות נתונים שהתקבלו מביצית בודדת מחוברים על ידי קו. סיכום (ד &#39;) של ניסויים דומים כפי שמוצגים בעמודות ג מייצגים אפקט של גירוי יחסי בΔI עמי מחושב כיחס בין ΔI עמי נמדד לאחר דגירה 30 דקות (ΔI עמי 30 דקות) לΔI עמי הראשוני (הראשוני ΔI עמי) נמדדה לפני הדגירה. מספרים בתוך העמודות מצביעיםמספר הביציות בודדות שנמדדו. N מציין את מספר קבוצות השונות של ביציות. (נתון זה שונה מ[ Haerteis אח&#39; 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> איור 3. דגם של אתרי מחשוף המקטע מראה γENaC להפעלת מפרקי חלבונים ואתר הקישור של הנוגדן בשימוש. מחשוף פרוטאוליטי ידי furin convertase קשור-Golgi הוא חשוב להתבגרות ENaC במסלול biosynthetic לפני הערוץ מגיע קרום הפלזמה. לאחר המחשוף ידי furin בר kDa 76 ניתן לאתרם בתא השטח באמצעות גישה biotinylation ונוגדנים נגד אפיטופ בC-הסופית של γ-למקטע. השלב הסופי המכריע בEN פרוטאוליטיהפעלת aC כנראה מתרחשת בקרום הפלזמה שבי γENaC הוא ביקע ידי פרוטאזות תאיים (למשל plasmin או chymotrypsin) באזור דיסטלי לאתר furin וכתוצאה מכך שבר מחשוף 67 kDa. (נתון זה שונה מ[ Haerteis אח&#39; 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="איור 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> איור 4:. מוטציה שני plasmin (K189) ואתר prostasin מחשוף (RKRK178) מעכבת את ההפעלה של זרמים בתיווך ENaC והמראה של מוצר מחשוף 67 kDa של γ-למקטע של ערוץ ביציות להביע WT (סימנים פתוחים) ו γ RKRK178AAAA; ערוץ K189A ENaC מוטציה (סימנים סגורים) הודגרו למשך 30 דקות בתמיסה נטול פרוטאז (שליטה) או ל5, 30, או 60 דקות בתמיסה המכילה chymotrypsin (2 מיקרוגרם / מיליליטר). () כדי לקבוע ΔI עמי לפני ואחרי הדגירה, ביציות היו מהודקות בפוטנציאל החזקת -60 mV. עיגולים מייצגים את היחס של ΔI עמי נמדד לאחר 5, 30, או 60 דגירה דקות (דקות ΔI עמי) לΔI עמי הראשוני (הראשוני ΔI עמי) נמדד לפני הדגירה. כל נקודת נתונים מייצגת את ΔI עמי הממוצע שנמדד ב22-24 ביציות בודדות מארבע קבוצות שונות. (BD) במקביל לגילוי של ΔI עמי, ביטוי של γENaC biotinylated על פני התא נותח על ידי-SDS. γENaC זוהה עם נוגדנים נגד אפיטופ בC-הסופית של γENaC האנושי. ניתוח densitometric כתמים מערביים נציג מצרור אחד של ביציות מוצגים. (CE) של שלושה כתמים מערביים דומים לאלו המוצגות בB או ד לכל מסלול, יםignals זוהה באזורים של 76 KD (עמודות פתוחות) ו67 KD (עמודות אפורות) נקבעו ומנורמל לסכום של האות בסך הכל זוהתה. N מציין את מספר קבוצות השונות של ביציות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments at JoVE.c

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

הפעלת מפרקי חלבונים של ערוץ אפיתל נתרן (ENaC) הביע heterologously בXenopus laevis ניתן להדגים ביציות על ידי שילוב של מדידות זרם עם גישת biotinylation לחקור את המראה של מוצרי מחשוף ערוץ יון על פני התא. ניתן לזהות אתרי מחשוף חשובים ופונקציונליים באמצעות מכוון mutagenesis אתר.

הפגנה של מפרקי חלבוני הפעלה של אפיתל נתרן הערוץ (ENaC) על ידי שילוב של מדידות זרם עם איתור של שברי מחשוף

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K Views.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  הפעלת מפרקי חלבונים של ערוץ אפיתל נתרן (ENaC) הביע heterologously בXenopus laevis ניתן להדגים ביציות על ידי שילוב של מדידות זרם עם גישת biotinylation לחקור את המראה של מוצרי מחשוף ערוץ יון על פני התא. ניתן לזהות אתרי מחשוף חשובים ופונקציונליים באמצעות מכוון ...

Video: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

הפגנה של עורית Allodynia בשיתוף עם כאבי אגן כרוניים

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.