The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

1. Aislamiento de oocitos de Xenopus y microinyección de ARNc <ol><li> Obtener ovocitos de Xenopus laevis hembra adulta. Anestesiar animales en 0,2% MS222, y resecar lóbulos ováricos través de una pequeña incisión abdominal. </li><li> Aislar ovocitos de los lóbulos ováricos por digestión enzimática a 19 ° C durante 3-4 horas con 600 a 700 U / ml de colagenasa tipo 2 de Clostridium histolyticum disueltos en solución OR2 libre de calcio (receta en la Tabla 1). </li><li> Para la selección, coloque los ovocitos desfolicularon en una placa de Petri con un microscopio binocular en un alto contenido de sodio que contiene la solución (DN96: Receta en la Tabla 1). </li><li> Seleccione ovocitos V-VI de la etapa y colocarlos en otra placa de Petri con una pipeta Pasteur. NOTA: Blunt pipeta Pasteur por flameado para evitar lesiones de los ovocitos. </li><li> Inyectar oocitos con ARNc (por ejemplo 0,2 ng por αβγENaC subunidad). Disolver cARNs en RNasa libre de agua. NOTA: Totalvolumen inyectado en cada ovocito es de 46 nl. </li><li> Tienda inyectado ovocitos a los 19 ° C en una solución baja en sodio para evitar la carga de sodio de los ovocitos (ND9: Receta en la Tabla 1). Suplemento la solución con penicilina 100 U / ml de sodio y 100 g / ml de sulfato de estreptomicina para prevenir el crecimiento bacteriano. Maneje cuidadosamente los ovocitos de limitar la cantidad de ovocitos dañados o muertos y mantenerlos en pequeños grupos individuales en un 12 pocillos de la placa de pozos llenos de solución del baño durante los dos días después de la inyección de ARNc. </li></ol> 2. Realización de dos electrodos Los experimentos de fijación de voltaje <ol><li> Medir la ovocitos dos días después de la inyección. </li><li> Llene una jeringa de un sistema de perfusión alimentado por gravedad con solución ND96 y otra jeringa con solución ND96 contiene amilorida (2 M). Monte jeringas de 50 cm por encima de la cámara de baño de los ovocitos. NOTA: La concentración de la amilorida inhibidor de ENaC fue elegido para ser 20 veces superior a su IC 50 </sub&gt; (100 nM). </li><li> Encienda la fuente de luz fría 150 W halógeno y ajustarlo a 10 cm por encima de la cámara de baño de ovocitos que permite una buena visualización con el microscopio binocular. A continuación, encienda de succión y ajustar el tubo de succión en el extremo de la cámara de baño de ovocitos. Adaptador Localice succión tubo opuesto al superfusion tubos &#39;entrar en el baño de los ovocitos. NOTA: Potencia de succión debe ser suficiente para soportar el flujo continuo de la solución de superfusión el ovocito. </li><li> Ajustar la velocidad de superfusión de cada solución a 3-5 ml / min utilizando el dispositivo de control de flujo por gravedad IV. Conectar los tubos de superfusión con un adaptador para la cámara de baño de ovocitos. </li><li> Tire de capilares de vidrio con un extractor de micropipeta para obtener diámetros de punta de &lt;1 m. Luego llena los capilares a ~ 1/4 con 3 M KCl. NOTA: Asegúrese de que la parte tratada con cloro del alambre de plata del soporte del electrodo se sumerge en una solución de KCl. Compruebe si hay burbujas de aire en la punta del capilar. Las burbujas de aire deterioran la medirement al aumentar la resistencia capacitancia parásita. </li><li> Inserte los capilares en los soportes de los electrodos de la corriente y el electrodo de tensión y los situará en ND96 contiene amilorida solución (2 M) utilizando los micro-manipuladores. </li></ol> 3. Medición de las corrientes de células enteras amilorida-sensibles <ol><li> Poner a cero el potencial de electrodo del electrodo de tensión (V m) y el electrodo de corriente (V e) mediante el ajuste de la V m y V e desplazamiento botones NOTA:. La resistencia debe ser 1-2 MΩ para el electrodo para medir V y 0,5 m -1 MΩ para el electrodo de inyección de corriente. </li><li> Coloque el ovocito en la cámara de baño en estrecha proximidad al electrodo de detección de voltaje. NOTA: No dañe el ovocito durante cualquiera de estos pasos de transferencia. Utilizar una pipeta Pasteur para transferir el ovocito. Para evitar daños en el ovocito de los bordes de la pipeta debe ser mitigado por flameado. </li><li> Empalar ooCytes suavemente con las dos microelectrodos. </li><li> Ajuste el potencial de explotación al amplificador a -60 mV y encender el registrador gráfico. Encienda la amilorida (2 M) que contiene la solución. NOTA: La corriente debe ser de aproximadamente 0 ± 0,5 μA. Corrientes de fuga mayores indican un empalamiento con fugas. Por lo tanto, estos ovocitos deben ser rechazados. Por otra parte, las corrientes de fuga medida en presencia de amilorida (2 M) deben ser similares en αβγ-WT expresar ovocitos a los medidos en-αβγ mutante ENaC expresar ovocitos. Esto indica que las mutaciones no afectan a la amilorida-sensibilidad del canal. </li><li> Inicie la grabación. Si es necesario ajustar la ganancia. </li><li> Después de la corriente medida alcanza una meseta estable, cambiar a la solución a amilorida libre. NOTA: desviaciones actuales a la baja en las trazas de corriente corresponden a corrientes hacia el interior, es decir, el movimiento de carga positiva (Na +) desde el lado extracelular en la célula. </li><li> After una meseta actual se alcanza (después de ~ 60 seg), cambiar la superfusión de nuevo a la solución que contiene amilorida. Después de la corriente del ovocito alcanza la corriente de referencia inicial, desactive el bloqueo de tensión y suavemente retirar los electrodos. </li><li> Para permitir el resellado de la membrana plasmática en los sitios de empalamiento, colocar el ovocito en un pocillo de una placa de 96 pocillos que contenía 100-150 l de proteasa libre de solución ND96. </li><li> Después de 5 min, transferir los ovocitos a una proteasa que contiene una solución o a una solución de control sin proteasa durante un tiempo de incubación de 30 min. NOTA: El tiempo de incubación depende de la proteasa y el canal estudiado. </li><li> Después de la etapa de incubación repetir la medición de la corriente (ver 3.2 y siguientes). NOTA: Es posible medir&gt; 90% de los oocitos después de la incubación en solución de proteasa. </li></ol> 4. Ensayo de biotinilación <ol><li> Seleccionar y descartar ovocitos defectuosos bajo el microscopio binocular. NOTA: Utilice injected ovocitos del mismo lote para las mediciones de corriente y para los experimentos de biotinilación. </li><li> Mantener biotina a TA durante al menos 20 minutos antes de su uso en el experimento. </li><li> Preparar las soluciones: DN96 y DN96 contiene la proteasa apropiada. Preparar pipetas Pasteur etiquetándolos y por flameado brevemente sus consejos para evitar lesiones de los ovocitos. NOTA: Aquí, se utiliza la proteasa quimotripsina 2 mg / ml en ND96. Tratar a cada grupo con una pipeta separada para evitar la contaminación cruzada de las soluciones. </li><li> Llene cada pocillo de una placa de 6 pocillos con 2,5 ml de control DN96 o DN96 contiene una proteasa a TA. Luego depositar 30 ovocitos por pocillo y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Para los procedimientos posteriores es importante para mantener las muestras en hielo en todo momento. Todos los pasos de centrifugación se realizó a 4 ° C. </li><li> Llene cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos con 2,5 ml ND96 (cada grupo tiene 3 pozos para los pasos de lavado) y pesar la biotina. NOTA: 2,5 mg de biotina pER así se requiere (1 mg / ml). Disolver la biotina en el tampón de biotinilación (es decir, 25 mg de biotina (para 10 grupos) en 25 ml de tampón de biotinilación (receta en la Tabla 1). </li><li> Transfiera cada grupo de ovocitos a un pozo lleno de 2,5 ml ND96. Transferencia ovocitos secuencialmente en dos pozos adicionales con ND96 para lavar cualquier proteasa restante. Incubar los ovocitos durante 5 min en ND96. </li><li> La transferencia de los oocitos en una solución también contiene 2,5 ml de biotina y se incuba con agitación suave (&#39;agitador&#39;) durante 15 min. NOTA: Minimizar el ND96 transferido con la pipeta para evitar la dilución de la solución de biotina. </li><li> Transfiera cada grupo de ovocitos en un pozo que contiene 2,5 ml de tampón de enfriamiento rápido (receta en la Tabla 1) para detener la reacción de biotinilación. A continuación, traslado a cada grupo de ovocitos en un segundo pozo también contiene 2,5 ml apagues tampón y se incuba durante 5 minutos con agitación suave. </li><li> Retire ovocitos dañados o muertos. Nota:Elige el mismo número de ovocitos por grupo para el siguiente procedimiento. </li><li> Transfiera cada grupo de ovocitos a un tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 ml. NOTA: Reducir al mínimo la cantidad de memoria intermedia de enfriamiento que se transfiere. </li><li> Posteriormente, la lisis de los ovocitos haciéndolas pasar a través de una aguja 27 G en 1 ml de tampón de lisis (receta ver Tabla 1) suplementado con inhibidores de la proteasa. </li><li> Centrifugar los lisados ​​durante 10 min a 1500 x g. </li><li> Aspirar el sobrenadante y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,5% de Triton-X-100 y 0,5% de NP40. Deseche el sedimento restante. NOTA: El sobrenadante contiene proteínas de la membrana de plasma con biotina y proteínas intracelulares no biotinilado. </li><li> Incubar los tubos de microcentrífuga durante 20 min en hielo. Repetidamente vórtice los tubos durante este periodo para disolver completamente el proteínas en NP40 y Triton-X-100. </li><li> Centrífuga de 100 l de perlas de agarosa por grupo de ovocitos durante 3 min a 1500 x g. Después de lacentrifugación eliminar el sobrenadante de la solución de perlas y lavar tres veces con tampón de lisis para equilibrar las cuentas con tampón. </li><li> Pipetear 100 l de las perlas lavadas en cada tubo de microcentrífuga que contiene el detergente-solución de proteína preparada en 4,13 para permitir la unión de las proteínas biotinilados a las perlas. </li><li> Incubar los tubos de microcentrífuga con sobrecarga de rotación O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugar los tubos de microcentrífuga durante 3 min a 1500 x g. A continuación, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. NOTA: proteínas intracelulares no están etiquetados con biotina. El sobrenadante se puede almacenar a -20 ° C. No aspirar los talones. </li></ol> 5. Detección de ENAC Escote fragmentos en la superficie celular mediante análisis de transferencia Western <ol><li> Lavar las perlas tres veces con tampón de lisis y añadir 100 l de 2x tampón de muestra de SDS-PAGE. NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -20 ° C o inmediatamente prepararon para el análisis de transferencia de Western. </li><li> Hervir splos de 5 min a 95 ° C y luego colocar los tubos en hielo. </li><li> Centrifugar las muestras durante 3 min a 20.000 xg y la pipeta el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. NOTA: Este sobrenadante contiene las proteínas de la membrana de plasma biotiniladas de la superficie celular de los ovocitos. </li><li> Analizar 30 l de este sobrenadante por Western blot para investigar fragmentos de escisión en la superficie celular. </li><li> Separar las proteínas biotiniladas por SDS-PAGE (dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio) usando un gel apropiado (8%, 10%, 12%, dependiendo del peso molecular de los fragmentos de escisión investigados). </li><li> Transferencia de las proteínas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas mediante transferencia semiseca. </li><li> La sonda de la membrana con un anticuerpo específico contra γENaC humano dirigido contra un epítopo en el extremo C-terminal (véase la Figura 3 y 13). </li><li> Utilice peroxidasa de rábano picante de cabra marcada con anticuerpo anti-conejo como anti secundariacuerpo. </li><li> Detectar las señales quimioluminiscentes. </li></ol>

<ol>
	<li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENaC+at+the+cutting+edge:+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases.">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li><li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+serine+proteases.">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li><li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases.">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li><li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating.">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li><li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase.">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li><li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-activated+receptors:+contribution+to+physiology+and+disease.">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li><li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+&#946;-subunit.">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin &#946;-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li><li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S.">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li><li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes.">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li><li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+epithelial+Na++channels+by+cleaving+the+&#947;-subunit.">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the &#947;-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li><li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel.">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li><li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel.">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li><li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+&#947;-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel.">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the &#947;-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li><li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li><li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Na++removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na+-channel+(ENaC)+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval.">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este manuscrito un enfoque metodológico que se aplicó con éxito para estudiar los mecanismos que subyacen a la activación de ENaC por proteasas se describe 8,13. Se utilizó para funcionalmente expresa ENaC El sistema de expresión bien establecida de Xenopus laevis de ovocitos. Función de ENaC se evaluó con la técnica convencional de fijación de voltaje de dos electrodos. Se empleó la mutagénesis dirigida al sitio para identificar los sitios de escisión de la proteasa funcionalmente relevantes. Experimentos de biotinilación realizadas en paralelo con las mediciones electrofisiológicas hicieron posible correlacionar la aparición de ENaC de escisión de productos en la superficie celular con activación actual proteolítica. Una correlación entre el transcurso de tiempo de activación actual y la aparición de fragmentos de escisión proteolítica en la superficie celular es compatible con el concepto de activación del canal proteolítica. De dos electrodos grabaciones de fijación de voltaje requieren el empalamiento de un Oocyte con dos microelectrodos. Este procedimiento generalmente se realiza sólo una vez en un oocito individual. Sin embargo, era factible para eliminar los microelectrodos después de una grabación actual de células enteras inicial sin daño aparente para el ovocito. De hecho, la membrana de plasma en los sitios de impalements aparece para volver a sellar dentro de unos pocos minutos. Por lo tanto, después de completar una primera medición de fijación de voltaje de dos electrodos, es posible transferir el ovocito de la cámara de flujo experimental de la configuración de fijación de voltaje de dos electrodos a un tubo de microfuga o un pocillo de una placa de 96 pocillos lleno de un pequeño volumen de solución de ensayo o de control. Después, el mismo oocito puede ser transferido de nuevo a la cámara de flujo y puede ser atravesado de nuevo para realizar una segunda medición de fijación de voltaje de dos electrodos. Sorprendentemente, las corrientes mediadas por ENAC no varían mucho entre la primera y segunda medición cuando el oocito se mantuvo en la solución de control. En contraste, la incubación de los ovocitos en un sol de proteasa que contienelución después de la primera medición se tradujo en un aumento de la corriente mediada por ENAC en la segunda medición (Figura 2). Este hallazgo indica la activación del canal proteolítica. Realización de dos mediciones de corriente separadas en un solo ovocito ofrece la ventaja de que el ovocito puede estar expuesto a las proteasas u otros agentes farmacológicos entre las dos mediciones para una longitud variable de tiempo en un pequeño volumen de solución de prueba. Esto es importante cuando se utilizan agentes que son caros y / o no está disponible en grandes cantidades, por ejemplo, preparaciones de proteasa purificada. La disponibilidad limitada de agentes puede hacer que sea imposible (o inaccesibles) para usarlos en continuo de dos electrodos grabaciones de fijación de voltaje debido a los grandes volúmenes de solución de ensayo requerida para superfusión continua los ovocitos con tasas de flujo de varios mililitros por minuto. Por otra parte, las mediciones de fijación de voltaje de dos electrodos continuos están limitadas por el fenómeno bien conocidomeno de resumen canal espontánea también describen por ENAC 15. En contraste, la exposición de ovocitos para poner a prueba soluciones entre dos mediciones separadas por hasta una hora o más generalmente no representa un problema (véase la figura 4A). Por último, dos mediciones secuenciales realizadas en el mismo oocito permiten pares de observaciones de los efectos de la droga. Esto tiene una ventaja sobre las mediciones no apareados de dos grupos separados de ovocitos (tratado con proteasa y tratado con vehículo), ya que reduce el problema de la alta variabilidad entre ovocitos, normalmente observados en la expresión de canales de iones. Con pares de observaciones y la posibilidad de normalizar los datos a la primera medición, se necesitan menos ovocitos por grupo experimental para demostrar un efecto significativo de un agente farmacológico. La normalización de los datos también hace que sea fácil de resumir los datos de diferentes lotes de ovocitos con diferentes niveles de expresión de los canales iónicos y, por tanto, diferentes corrientes de línea de base (Figura 2D). Obviamente, los experimentos de control son necesarios para este enfoque para demostrar que la actividad del canal iónico de interés se mantiene estable en los ovocitos de control tratados con vehículo desde la primera a la segunda medición (véase la Figura 2). Para demostrar que la activación proteolítica de corriente se correlaciona con la aparición de productos de escisión de ENaC en la superficie celular, un enfoque de biotinilación originalmente descrito por Harris et al. 9 se puede utilizar. Este procedimiento (como se detalla en la sección de protocolo y muestra en la Figura 4) fue adaptado para demostrar que la exposición de los canales a las proteasas y la posterior activación de las corrientes mediadas por ENAC es paralela a la aparición dependiente del tiempo de fragmentos de escisión. El método de biotinilación también permite el análisis de un aumento global o la disminución de proteínas de membrana en la superficie celular. Por lo tanto, este método es adecuado para investigar el efecto de las proteasas y otros Pharagentes farmacológica sobre la inserción de canal en la membrana de plasma o sobre la recuperación de canal. Además, el análisis de transferencia Western de las proteínas de la membrana de plasma con biotina permite la detección de fragmentos de proteína (por ejemplo, fragmentos proteolíticos ENaC) o cambios en el patrón de glicosilación que puede ser funcionalmente relevante. En conclusión, la combinación de los métodos utilizados para investigar el efecto estimulador de proteasas en las corrientes de células enteras mediadas por ENaC y para demostrar una correlación con la aparición de productos de escisión de ENaC en la superficie celular puede ser útil para una amplia gama de aplicaciones. En particular, estos métodos pueden ser adecuadas para abordar cuestiones similares con respecto a la regulación de otros canales iónicos, transportadores o receptores transmembrana (por ejemplo, los receptores activados por proteasas PAR).

Las proteasas son enzimas que están implicadas en diversas reacciones fisiológicas que van desde la degradación proteolítica bien conocida de proteínas, en el contexto de la digestión, a cascadas de proteasa altamente sofisticados que participan en vías de señalización reguladora complejos. Las proteasas se clasifican en siete grupos de acuerdo con su sitio activo catalítico: aspartato, asparagina, cisteína, ácido glutámico, metalo, serina, treonina y proteasas. Diferentes proteasas se dirigen a sitios de escisión distintos que no siempre son fáciles de predecir a partir de la estructura primaria de una proteína. La base de datos MEROPS ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> ) proporciona información detallada sobre una amplia gama de proteasas y sus sitios de división preferenciales. Sitios de escisión funcionalmente relevantes pueden identificarse utilizando la mutagénesis dirigida al sitio. Está bien establecido que el procesamiento proteolítico de ENAC es un importante mecanismo de activación de thLa particularidad 1,2 canal iónico. Curiosamente, hay pruebas de que la función del ácido de detección de canal iónico 1a relacionada (ASIC1a) también puede ser modificado por proteasas 3-5. En la actualidad sigue siendo una cuestión abierta si la escisión proteolítica canal juega un papel fisiológico importante en la regulación de la actividad de otros canales iónicos o transportadores. Sin embargo, está bien establecido que la escisión proteolítica activa un grupo de receptores acoplados a proteínas G, los receptores activados por proteasa (PAR) 6. Varias proteasas de serina proteasas (por ejemplo, canal de activación (CAP1-3), quimotripsina, tripsina, furina, plasmina, elastasa de neutrófilos, y la calicreína) se han mostrado para activar proteolíticamente ENaC 2. Además de las serina proteasas, otros grupos de proteasas pueden estar implicadas en la activación proteolítica de ENaC. De hecho, los últimos datos muestran que la metaloproteinasa meprin-β 7 y la proteasa cisteína catepsina S-8 también puede activate ENAC. Sin embargo, los (pato-proteasas) fisiológicamente relevantes para la activación de ENaC no se habían determinado y pueden diferir de un tejido a otro. Las proteasas se conocen para escindir preferentemente en sitios particulares en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la quimotripsina de serina proteasa muestra un patrón de escisión específico de escisión después de la amino-ácido aromático residuos de fenilalanina y tirosina. En contraste, la proteasa de serina tripsina escinde preferencialmente después de la lisina residuos básicos o arginina. El uso de constructos γENaC humana mutantes generados mediante mutagénesis dirigida al sitio, los sitios de escisión funcionalmente relevantes en ENaC heteróloga expresadas en el sistema de expresión de oocitos podrían ser identificados 8-13. Mediante la inyección de ARNc de las tres subunidades ENaC (αβγ) en oocitos aislados, ENaC se puede expresar funcionalmente en estas células y la actividad de los canales presentes en la membrana plasmática puede ser medida porutilizando la técnica de fijación de voltaje de dos electrodos. Mediante el uso de la amilorida diurético, un inhibidor específico de ENaC, la mediada por ENaC componente de la corriente de células enteras sensible a amilorida (ami Delta I) se puede separar de las corrientes de fuga no específicas o de las corrientes conducidas por otros canales iónicos. Por lo tanto, los valores de Delta I ami reflejan la actividad general de ENaC y pueden ser determinadas por restar las corrientes de células enteras medidos en presencia de amilorida partir de las corrientes de células enteras correspondientes grabadas en ausencia de amilorida. Para probar si una proteasa tiene un efecto estimulante sobre el ENaC, Delta I IAM se mide dos veces en el mismo oocito, es decir, antes y después de la incubación de los ovocitos en una solución que contiene proteasa. Un aumento de Delta I IAM de la primera a la segunda medición indica la activación de ENaC proteolítica. La quimotripsina o tripsina son conocidas por estimular al máximo ENaC en el sistema de expresión de ovocitos 2,14 y se pueden utilizar para confirm que la activación de ENaC proteolítica es detectable en un lote dado de ovocitos. En paralelo a las mediciones de corriente de células enteras, se utilizó un enfoque de biotinilación 9 Para investigar si el aumento en Delta I ami detectar tras la exposición de los ovocitos a las proteasas se correlaciona con la aparición de fragmentos de escisión de ENaC en la superficie celular. Las proteínas en la superficie celular se marcan con biotina y se pueden separar de las proteínas intracelulares mediante la unión de las proteínas biotiniladas a perlas de agarosa marcadas con neutravidina. Las proteínas biotiniladas pueden ser analizados por Western blot. fragmentos de escisión γENaC en la superficie celular se pueden detectar usando un anticuerpo específico dirigido contra un epítopo en el extremo C-terminal de la γENaC. Para identificar un sitio de escisión funcionalmente relevante (s), predijeron sitios de escisión se pueden mutar usando mutagénesis dirigida al sitio. Canales Wildtype y mutantes se comparan en experimentos paralelos utilizando ovocitos de los slote ame. Con este enfoque metodológico se demostró por primera vez que la activación proteolítica de las corrientes de células enteras mediadas por ENAC se correlaciona con la aparición dependiente del tiempo de ENaC de escisión de fragmentos en la superficie celular. Estos resultados sugieren una relación causal entre la división del canal y la activación del canal. Por otra parte, el uso de mutagénesis dirigida al sitio de supuestos sitios de escisión en combinación con la técnica de dos electrodos de fijación de voltaje, los sitios de escisión funcionalmente relevantes para la plasmina, quimotripsina y catepsina 13-S 8 se identificaron.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Para investigar si la plasmina proteasa serina puede activar las corrientes mediadas por ENAC, Delta I ami de ovocitos que expresan el ENaC individuales se determinó antes y después de 30 min de incubación de los ovocitos en-proteasa libre (de control) (Figura 2A) o una solución de plasmina que contiene (figura 2B) utilizando la técnica de fijación de voltaje de dos electrodos (véase la Figura 1). La exposición a la plasmina aumentó Delta I IAM en cada ovocito medido. En contraste, en los experimentos de control, 30 min de incubación de ENaC-expresan en oocitos de solución de proteasa libre tuvo un efecto insignificante (Figura 2 C, D). Por lo tanto, mediante el uso de este método, una estimulación de la corriente mediada por ENaC por la plasmina se puede detectar. Para estudiar los efectos de la mutación de los sitios de escisión putativo de la activación de las corrientes mediadas por ENAC, así como tras la escisión de canal, el efecto de la quimotripsina en WT-ENaC se comparó con la deun ENaC mutante con prostasina mutado y los sitios de escisión de la plasmina (RKRK178AAAA γ; K189A). El curso temporal de la activación del canal por quimotripsina, así como la aparición de ENaC de escisión productos en la superficie celular se investigó mediante el uso de diferentes tiempos de incubación de la proteasa (Figura 4A). Se demostró que los retrasos de los canales mutantes y reduce la activación de la corriente mediada por ENaC por quimotripsina. Esto es paralelo a una aparición retardada de un fragmento de escisión molecular inferior γENaC peso de 67 kDa correspondiente a la subunidad totalmente escindido. Fragmentos de escisión se detectaron utilizando un anticuerpo γENaC dirigido contra un epítopo en el extremo C-terminal (Figura 3). Este enfoque metodológico demuestra que el curso temporal de la activación proteolítica de las corrientes mediadas por ENAC se correlaciona con la aparición de un producto de escisión de 67 kDa γENaC en la superficie celular (Figura 4 B, C). Esto apoya el concepto de unrelación de causalidad entre la escisión proteolítica de canal y la activación del canal 13. Además, mediante la combinación de mediciones de corriente y la detección de fragmentos γENaC en la superficie celular se demostró que los sitios de escisión mutadas son funcionalmente relevante para la activación del canal proteolítica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Procedimiento de determinar el efecto estimulador de una proteasa en ENaC heteróloga expresada en oocitos de Xenopus laevis. Actividad de ENaC se estima mediante la medición de la de células enteras componente de corriente sensible a amilorida Delta I AMI. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Plasmina estimula curren mediadas por ENACts en oocitos que expresan ENAC. (Ad) Los ovocitos que expresan el ENaC humana se incubaron durante 30 minutos en solución de proteasa libre (control) o en solución que contiene plasmina (10 g / ml). Para determinar Delta I ami antes (-) y después (+) de incubación, los ovocitos se sujetaron a un potencial de mantenimiento de -60 mV (A, B) Cuatro de células enteras trazas de corriente representativas de un lote de ovocitos.. Amilorida (ami) estaba presente en la solución del baño para inhibir específicamente ENaC como se indica por barras negras. (C) Los puntos de datos obtenidos a partir de un oocito individuales se conectan por una línea. (D) Resumen de experimentos similares, como se muestra en C. Las columnas representan efecto estimulador relativa en Delta I ami calcula como la relación de Delta I ami medido después de una incubación de 30 min (Delta I IAM 30 min) para el AMI Delta I inicial (IAM Delta I inicial) medido antes de la incubación. Números dentro de las columnas indican elnúmero de ovocitos individuales medidos. N indica el número de diferentes lotes de oocitos. (Esta cifra se ha modificado a partir de [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Modelo de la subunidad que muestra sitios de escisión de γENaC para la activación proteolítica y el sitio de unión del anticuerpo utilizado. La escisión proteolítica por la furina convertasa asociado-de Golgi es importante para la maduración de ENaC en la ruta biosintética antes de que el canal llega a la membrana plasmática. Después de la escisión por furina un fragmento de 76 kDa puede ser detectada en la superficie celular utilizando un enfoque de biotinilación y un anticuerpo contra un epítopo en el extremo C-terminal de la subunidad γ-. El último paso fundamental en proteolítica ESactivación aC probablemente tiene lugar en la membrana plasmática donde γENaC se escinde por proteasas extracelulares (por ejemplo, plasmina o quimotripsina) en una región distal al sitio de furina como resultado un fragmento de escisión de 67 kDa. (Esta cifra se ha modificado a partir de [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> Figura 4:. La mutación tanto de la plasmina (K189) y el sitio de escisión prostasina (RKRK178) retarda la activación de las corrientes mediadas por ENAC y la aparición de un producto de escisión de 67 kDa de γ-subunidad del canal oocitos que expresan WT (símbolos abiertos) y γ RKRK178AAAA; canal mutante K189A ENAC (símbolos cerrados) se incubaron durante 30 minutos en una solución exenta de proteasa (control) o de 5, 30, o 60 min en una solución que contiene quimotripsina (2 g / ml). (A) Para determinar Delta I ami antes y después de la incubación, los ovocitos se sujetaron a un potencial de mantenimiento de -60 mV. Los círculos representan la relación de Delta I ami medida después de 5, 30, o 60 min de incubación (Delta I ami min) para el AMI Delta I inicial (IAM Delta I inicial) medido antes de la incubación. Cada punto de datos representa la media Delta I ami medido en 22-24 ovocitos individuales de cuatro lotes diferentes. (BD) En paralelo a la detección de Delta I IAM, la expresión de γENaC biotinilado en la superficie celular se analizó mediante SDS-PAGE. γENaC se detectó con un anticuerpo contra un epítopo en el extremo C-terminal de γENaC humana. Se muestran transferencias de Western representativas de un lote de ovocitos. (CE) El análisis densitométrico de tres transferencias de Western similares a los mostrados en B o D. Para cada carril, los signals detectados en las regiones de 76 kD (columnas en blanco) y 67 kD (columnas grises) se determinaron y se normalizó a la suma de la señal total detectado. N indica el número de diferentes lotes de ovocitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments at JoVE.c

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

La activación proteolítica del canal de sodio epitelial (ENaC) heterólogamente expresada en oocitos de Xenopus laevis se pueden demostrar mediante la combinación de mediciones de corriente con un enfoque de biotinilación para investigar la aparición de productos de escisión de los canales iónicos en la superficie celular. Sitios de escisión funcionalmente importantes pueden ser identificados mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio.

Demostración de la activación proteolítica del canal de sodio epitelial (ENaC) mediante la combinación de mediciones de corriente con detección de fragmentos de escisión

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K vistas.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  La activación proteolítica del canal de sodio epitelial (ENaC) heterólogamente expresada en oocitos de Xenopus laevis se pueden demostrar mediante la combinación de mediciones de corriente con un enfoque de biotinilación para investigar la aparición de productos de escisión de los canales iónicos en la superficie celular. Sitios de escisión funcionalmente importantes pueden ser identificados mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio. 

Video: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious agents, and the development of artheriosclerotic plaques.   In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.  Central to these studies is CD1d - the antigen presenting molecule that presents glycolipids to NKT cells.  The advent of CD1d tetramer technology, a technique developed by the Kronenberg lab, is critical for the sorting and identification of subsets of specific glycolipid-reactive T cells.  Mitch explains how glycolipid agonists are being used as therapeutic agents to activate NKT cells in cancer patients and how CD1d tetramers can be used to assess the state of the NKT cell population in vivo following glycolipid agonist therapy.  Current status of ongoing clinical trials using these agonists are discussed as well as Mitch's prediction for areas in the field of immunology that will have emerging importance in the near future.

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmunity, clearance of infection, and the development of artheriosclerotic plaques. In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.

Entrevista: Presentación antígeno Glicolípido por CD1d y el potencial terapéutico de la activación de las células NKT

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Investigación

Biología

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Demostración de La alodinia cutánea En asociación con el dolor pélvico crónico

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

La detección de ubiquitinación de proteínas

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

El análisis de la función de las pequeñas GTPasas de la microinyección de plásmidos en células epiteliales polarizadas

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...