The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

1. عزل البويضات القيطم Microinjection من وكرنا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البويضات من الإناث البالغات القيطم المورق. تخدير الحيوانات في 0.2٪ MS222، ويقطع فصوص المبيض من خلال شق في البطن الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البويضات من المبيض عن طريق فصوص الهضم الأنزيمي في 19 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة مع 600-700 U / مل من النوع 2 كولاجيناز من نسج كلوستريديوم الكالسيوم المذاب في حل OR2 الحرة (وصفة في الجدول رقم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للاختيار، ووضع البويضات defolliculated في طبق بتري تحت المجهر مجهر في الصوديوم عالية تحتوي على محلول (ND96: صفة في الجدول رقم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المرحلة البويضات V-VI ووضعها في طبق بتري أخرى مع ماصة باستور. ملاحظة: بلانت باستور ماصة بواسطة المشتعلة لمنع الإصابة البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن البويضات مع كرنا (على سبيل المثال 0.2 نانوغرام لكل αβγENaC الوحيدات). تذوب في الماء cRNAs ريبونوكلياز خالية. ملاحظة: إجماليحجم تحقن كل بويضة هو 46 NL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر حقن البويضات في 19 درجة مئوية في حل الصوديوم منخفضة الصوديوم لمنع التحميل من البويضات (ND9: صفة في الجدول رقم 1). تكملة الحل مع البنسلين 100 U / مل الصوديوم و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين كبريتات لمنع نمو البكتيريا. التعامل بعناية البويضات للحد من كمية من البويضات التالفة أو الميتة والمحافظة عليها في مجموعات صغيرة الفردية في الآبار 12 جيدا لوحة مليئة حل حمام خلال اليومين بعد الحقن كرنا. </li></ol> 2. أداء ثنائي القطب التجارب الجهد المشبك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس البويضات بعد يومين من الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة واحدة من خطورة تغذية نظام الارواء بمحلول ND96 وحقنة أخرى مع ND96 محلول يحتوي على الأميلوريد (2 ميكرومتر). جبل المحاقن 50 سم فوق غرفة حمام البويضة. وقد تم اختيار تركيز الأميلوريد ENAC المانع أن تكون أعلى 20 مرة من لIC 50: ملاحظة </الفرعية&gt; (100 نانومتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر ضوء بارد 150 W الهالوجين وتعديله إلى 10 سم فوق غرفة حمام البويضة مما يسمح التصور جيدة مع المجهر مجهر. ثم اتجه على شفط وضبط أنبوب شفط في نهاية الغرفة حمام البويضة. تحديد موقع أنبوب الشفط مقابل superfusion أنابيب &quot;محول دخول الحمام البويضة. ملاحظة: يجب أن تكون قوة الشفط كافية لدعم تدفق مستمر من الحل superfusing البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط سرعة superfusion كل حل ل3-5 مل / دقيقة باستخدام جهاز التحكم في التدفق الرابع الجاذبية. توصيل أنابيب superfusion مع محول إلى غرفة حمام البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الشعيرات الدموية الزجاج مع مجتذب micropipette للحصول على أقطار غيض من &lt;1 ميكرون. ثم ملء الشعيرات الدموية إلى ~ 1/4 مع 3 M بوكل. ملاحظة: تأكد من أن الجزء المكلورة من الأسلاك الفضية لصاحب القطب مغمورة في محلول بوكل. التحقق من وجود فقاعات الهواء في غيض من الشعرية. فقاعات الهواء تنال من قنينةrement عن طريق زيادة مقاومة السعة طائشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الشعيرات الدموية في أصحاب الكهربائي للتيار الكهربائي والجهد ووضعها في ND96 تحتوي على الأميلوريد (2 ميكرومتر) الحل باستخدام المتلاعبين الصغيرة. </li></ol> 3. قياس الأميلوريد تراعي التيارات خلية كاملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صفر إمكانات الكهربائي من القطب الجهد (V م) والقطب الحالي (V ه) عن طريق ضبط م V V ه وتعويض الأزرار ملاحظة: إن المقاومة يجب أن تكون 1-2 MΩ عن القطب لقياس V م و 0.5 -1 MΩ عن القطب الحقن الحالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البويضة في غرفة الحمام على مقربة من القطب الاستشعار الجهد. ملاحظة: لا يضر البويضة خلال أي من هذه الخطوات نقل. استخدام ماصة باستور لنقل البويضة. لتجنب إتلاف البويضة حواف ماصة ينبغي اضعافها عن طريق المشتعلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسعد OOcytes بلطف مع كل microelectrodes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المحتملة عقد في مكبر للصوت ل-60 بالسيارات وتشغيل مسجل التخطيط. بدوره على الأميلوريد (2 ميكرومتر) التي تحتوي على الحل. ملاحظة: يجب أن يكون الحالية حوالي 0 ± 0.5 أمبير. تسرب التيارات أكبر تشير إلى وجود التطويق تتسرب منها المياه. وبالتالي، ينبغي رفض هذه البويضات. وعلاوة على ذلك، ينبغي للتيارات تسرب يقاس بحضور الأميلوريد (2 ميكرون) تكون مشابهة في αβγ-WT معربا عن البويضات لتلك التي قيست في αβγ-ENAC متحولة معربا عن البويضات. هذا يشير إلى أن الطفرات لا تؤثر على الأميلوريد حساسية للقناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التسجيل. إذا لزم الأمر ضبط الربح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تصل الحالي يقاس هضبة مستقرة، تغيير الحل خالية من الأميلوريد. ملاحظة: الانحرافات الحالية النزولية في آثار الحالية تتوافق مع التيارات الداخل، أي حركة شحنة موجبة (+ نا) من الجانب خارج الخلية إلى داخل الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالعربيةثالثا يتم التوصل إلى هضبة الحالي (بعد ~ 60 ثانية)، تبديل superfusion إلى حل الأميلوريد تحتوي على. بعد تيار البويضة تصل إلى خط الأساس الأولي الحالي، إيقاف المشبك الجهد وسحب بلطف الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسماح إعادة إغلاق غشاء البلازما في مواقع التطويق، ووضع البويضة في بئر واحدة من 96 لوحة جيدا تحتوي على 100-150 ميكرولتر من الحل البروتيني الحرة ND96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5 دقائق، ونقل البويضة إلى البروتيني تحتوي على الحل أو حل التحكم دون البروتيني لفترة الحضانة 30 دقيقة. ملاحظة: فترة حضانة يعتمد على الأنزيم البروتيني وقناة دراستها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة الحضانة تكرار القياس الحالي (انظر 3.2 وما بعدها). ملاحظة: من الممكن لقياس&gt; 90٪ من البويضات بعد الحضانة في حل البروتيني. </li></ol> 4. Biotinylation الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وتجاهل البويضات معيبة تحت المجهر مجهر. ملاحظة: استخدام حقنإد البويضات من نفس دفعة للقياسات الحالية والتجارب biotinylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على البيوتين في RT لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل استخدامه في التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول: ND96 ND96 والتي تحتوي على الأنزيم البروتيني المناسب. إعداد ماصات باستور بواسطة اصفة إياهم والمشتعلة لفترة وجيزة نصائح لتجنب الإصابة من البويضات. ملاحظة: وهنا، يتم استخدام البروتيني كيموتربسين 2 ميكروغرام / مل في ND96. علاج كل مجموعة مع ماصة منفصلة لتجنب التلوث المتبادل من الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 2.5 مل السيطرة ND96 ND96 أو تحتوي على الأنزيم البروتيني في RT. ثم إيداع 30 البويضات لكل بئر واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT. ملاحظة: بالنسبة للإجراءات اللاحقة فمن المهم للحفاظ على عينات على الجليد في جميع الأوقات. يتم في تنفيذ جميع الخطوات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من جديد لوحة 6 جيدا مع 2.5 مل ND96 (يحتاج كل مجموعة 3 آبار للخطوات الغسيل) وتزن البيوتين. ملاحظة: 2.5 ملغ البيوتين عإيه جيدا (1 ملغ / مل) هو مطلوب. حل البيوتين في المخزن المؤقت biotinylation (أي 25 ملغ البيوتين (لمدة 10 مجموعات) في 25 مل biotinylation عازلة (وصفة في الجدول رقم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل مجموعة من البويضات لشغل جيدا مع 2.5 مل ND96. نقل البويضات بالتتابع في بئرين إضافية مع ND96 ليغسل أي البروتيني المتبقية. احتضان البويضات لمدة 5 دقائق في ND96. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات إلى 2.5 مل من محلول يحتوي على البيوتين جيدا واحتضان لهم مع الإثارة لطيف (&#39;شاكر&#39;) لمدة 15 دقيقة. ملاحظة: تصغير ND96 نقل مع ماصة لتجنب تخفيف من الحل البيوتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل مجموعة من البويضات إلى 2.5 مل تحتوي كذلك إخماد عازلة (وصفة في الجدول 1) لوقف رد الفعل biotinylation. ثم، ونقل كل مجموعة من البويضات في بئر ثانية تحتوي أيضا إرواء 2.5 مل العازلة واحتضان لمدة 5 دقائق مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البويضات التالفة أو ميتا. ملاحظة:اختيار نفس العدد من البويضات في كل مجموعة لالإجراء التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل مجموعة من البويضات إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge البلاستيك. ملاحظة: تصغير كمية من العازلة إخماد التي يتم نقلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق، ليز البويضات عن طريق تمريرها من خلال إبرة 27 G في 1 مل العازلة تحلل (وصفة انظر الجدول 1) تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لست] لمدة 10 دقيقة في 1،500 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف نضح وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 0.5٪ تريتون-X-100 و 0.5٪ NP40. تجاهل بيليه المتبقية. ملاحظة: طاف تحتوي على بروتينات غشاء البلازما والبروتينات داخل الخلايا البيروكسيديز غير البيروكسيديز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنابيب microcentrifuge لمدة 20 دقيقة على الجليد. مرارا وتكرارا دوامة الأنابيب خلال هذه الفترة لتذوب تماما البروتينات في NP40 وتريتون-X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 100 ميكرولتر من الخرز الاغاروز لكل مجموعة البويضة لمدة 3 دقائق في ز × 1،500. بعدالطرد المركزي إزالة طاف من حل الخرز ويغسل ثلاث مرات مع العازلة تحلل لكي تتوازن مع حبات العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من الخرز غسلها في كل أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على البروتين المنظفات الحل أعد 4.13 للسماح ملزمة من البروتينات البيروكسيديز إلى الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنابيب microcentrifuge مع النفقات العامة التناوب O / N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي أنابيب microcentrifuge لمدة 3 دقائق في ز × 1،500. ثم نقل طاف في أنبوب جديد. ملاحظة: لا يتم المسمى البروتينات داخل الخلايا مع البيوتين. ويمكن تخزين طاف في -20 درجة مئوية. لا نضح الخرز. </li></ol> 5. الكشف عن عناق الشق شظايا على سطح الخلية عن طريق ويسترن تحليل لطخة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات ثلاث مرات مع العازلة تحلل وإضافة 100 ميكرولتر من 2X SDS-PAGE عينة العازلة. ملاحظة: يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية أو مباشرة إعداده للتحليل لطخة غربية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي لياليamples لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية ثم أنابيب مكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 20،000 XG وماصة طاف في أنبوب microcentrifuge جديدة. ملاحظة: هذا طاف يحتوي على البروتينات البيروكسيديز غشاء البلازما من سطح الخلية من البويضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل 30 ميكرولتر من هذا طاف بواسطة لطخة غربية للتحقيق في شظايا الانقسام على سطح الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل البروتينات البيروكسيديز بواسطة SDS-PAGE (الصوديوم كبريتات دوديسيل بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام) باستخدام هلام المناسب (8٪، 10٪، 12٪ اعتمادا على الوزن الجزيئي للشظايا الانقسام التحقيق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتينات إلى difluoride البولي فينيل (PVDF) الأغشية بواسطة النشاف شبه الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث الغشاء مع الأجسام المضادة المحددة ضد γENaC الإنسان الموجهة ضد حاتمة في محطة سي (انظر الشكل 3 و 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفجل البيروكسيداز المسمى الماعز المضادة للأرنب الضد كما المضادة الثانويةالجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن إشارات chemiluminescent. </li></ol>

<ol>
	<li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENaC+at+the+cutting+edge:+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases.">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li><li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+serine+proteases.">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li><li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases.">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li><li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating.">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li><li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase.">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li><li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-activated+receptors:+contribution+to+physiology+and+disease.">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li><li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+&#946;-subunit.">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin &#946;-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li><li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+(ENaC)+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S.">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li><li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes.">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li><li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+epithelial+Na++channels+by+cleaving+the+&#947;-subunit.">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the &#947;-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li><li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel.">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li><li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel.">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li><li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+&#947;-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel.">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the &#947;-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li><li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes.">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li><li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Na++removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na+-channel+(ENaC)+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval.">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

في هذه المخطوطة يوصف نهج المنهجية التي تم تطبيقها بنجاح لدراسة الآليات الكامنة وراء تفعيل ENAC بواسطة البروتياز 8،13. تم استخدام القيطم المورق البويضة نظام التعبير راسخة لصريحة وظيفيا عناق. تم تقييم وظيفة عناق مع التقليدية يومين القطب تقنية الجهد المشبك. كان يعمل موقع الموجه الطفرات لتحديد المواقع البروتيني انشقاق ذات الصلة وظيفيا. أدلى التجارب Biotinylation يقوم بالتوازي مع القياسات الكهربية من الممكن ربط ظهور ENAC الانقسام المنتجات على سطح الخلية مع تنشيط بروتين الحالي. هناك ارتباط بين بالطبع وقت التنشيط الحالية وظهور شظايا الانقسام بروتين على سطح الخلية تدعم مفهوم التنشيط قناة بروتين. يومين القطب تسجيلات الجهد المشبك تتطلب التطويق من سocyte مع اثنين من microelectrodes. وعادة ما يتم تنفيذ هذا الإجراء مرة واحدة فقط في بويضة الفردية. ومع ذلك، كان من الممكن إزالة microelectrodes بعد خلية كاملة تسجيل الأولي الحالي دون ضرر واضح للبويضة. في الواقع، غشاء البلازما في مواقع التطويق يبدو أن ختم في غضون بضع دقائق. وهكذا، بعد الانتهاء من أول يومين القطب قياس الجهد المشبك، فمن الممكن لنقل البويضة من غرفة تدفق التجريبية من يومين القطب الإعداد الجهد المشبك إلى أنبوب microfuge أو بئر من لوحة 96 جيدا مليئة كمية صغيرة من الاختبار أو السيطرة الحل. بعد ذلك، ونفس البويضة يمكن نقلها إلى غرفة التدفق ويمكن مخوزق مرة أخرى لإجراء ثاني يومين القطب قياس الجهد المشبك. بشكل ملحوظ، لم التيارات ENAC بوساطة لا تختلف كثيرا بين القياس الأول والثاني عندما تمت المحافظة على البويضة في حل السيطرة. في المقابل، حضانة البويضة في البروتيني تحتوي على سولution بعد القياس الأول أسفر عن زيادة الحالي ENAC بوساطة في القياس الثاني (الشكل 2). هذه النتيجة تشير إلى تفعيل قناة بروتين. أداء اثنين من القياسات الحالية منفصلة في بويضة واحدة يوفر ميزة أن البويضة يمكن أن يتعرض لالبروتياز أو وكلاء الدوائية الأخرى بين القياسين لفترة من الزمن المتغير في حجم صغير من محلول الاختبار. هذا هو المهم عند استخدام وكلاء والتي هي مكلفة و / أو غير متوفر بكميات كبيرة، مثل الاستعدادات البروتيني المنقى. محدودية توافر عوامل قد تجعل من المستحيل (أو لا يمكن تحمله) لاستخدامها في استمرار يومين القطب تسجيلات الجهد المشبك بسبب كميات كبيرة من محلول الاختبار المطلوبة لsuperfusing باستمرار البويضات مع معدلات تدفق من عدة ملليلتر في الدقيقة الواحدة. وعلاوة على ذلك، واثنين من القطب قياسات الجهد المشبك المستمر تقتصر من قبل ظاهرة معروفةينون عفوية قناة المتهدمة وصفها أيضا لENAC 15. في المقابل، كشف البويضات لاختبار الحلول بين اثنين من القياسات منفصلة لمدة تصل إلى ساعة أو أكثر لا يشكل مشكلة بصفة عامة (انظر الشكل 4A). أخيرا، واثنين من قياسات متتابعة يؤديها في نفس البويضة تسمح الملاحظات المقترنة من آثار المخدرات. هذا له ميزة على القياسات المفردة من مجموعتين منفصلتين من البويضات (المعاملة البروتيني والمعالجة السيارة)، لأنه يقلل من مشكلة التباين الشديد بين البويضات، لاحظ عادة في القناة الايونية التعبير. مع الملاحظات تقرن وإمكانية تطبيع البيانات إلى القياس الأول، وهناك حاجة إلى عدد أقل من البويضات في المجموعة التجريبية ليبرهن على وجود تأثير كبير لعامل الدوائية. تطبيع البيانات أيضا يجعل من السهل تلخيص البيانات من دفعات مختلفة من البويضات مع مختلف مستويات التعبير القناة الايونية والتيارات خط الأساس وبالتالي مختلفة (الشكل 2D). من الواضح، والتجارب السيطرة ضرورية لهذا النهج لإثبات أن النشاط قناة أيون ذات الاهتمام لا تزال مستقرة في البويضات ضبط تعامل مركبة من الأول إلى الثاني القياس (انظر الشكل 2). لإثبات أن تفعيل بروتين يرتبط الحالي مع ظهور ENAC الانقسام المنتجات على سطح الخلية، وهو نهج biotinylation وصف في الأصل من قبل هاريس وآخرون. 9 يمكن استخدامها. وقد تم تكييف هذا الإجراء (كما هو مفصل في قسم البروتوكول ويظهر في الشكل 4) لإثبات أن التعرض للقنوات لالبروتياز وبموازاة تفعيل لاحقة من التيارات ENAC بوساطة من قبل تعتمد على الوقت مظهر من شظايا الانقسام. طريقة biotinylation يسمح أيضا تحليل زيادة أو نقصان الشاملة للبروتينات غشاء على سطح الخلية. وهكذا، وهذه الطريقة مناسبة للتحقيق في تأثير البروتياز وصيدلاني أخرىوكلاء macological على قناة الإدراج في غشاء البلازما أو عند استرجاع القناة. علاوة على ذلك، تحليل لطخة الغربي من البيروكسيديز بروتينات غشاء البلازما يسمح الكشف عن شظايا البروتين (مثل شظايا ENAC بروتين) أو تغييرات في نمط ارتباط بالغليكوزيل والتي قد تكون ذات صلة وظيفيا. في الختام، فإن الجمع بين الأساليب المستخدمة لدراسة تأثير تنشيطية من البروتياز على ENAC بوساطة تيارات خلية كاملة لإثبات وجود علاقة مع وقوع انشقاق ENAC المنتجات على سطح الخلية قد تكون مفيدة لمجموعة واسعة من التطبيقات. على وجه الخصوص، قد تكون هذه الطرق المناسبة لمعالجة مسائل مماثلة بشأن تنظيم القنوات الأيونية الأخرى، نقل أو مستقبلات عبر الغشاء (على سبيل المثال تنشيط مستقبلات الأنزيم البروتيني بارس).

البروتياز هي الأنزيمات التي تشارك في مختلف التفاعلات الفسيولوجية بدءا من تدهور بروتين معروفة من البروتينات، في سياق عملية الهضم، إلى شلالات البروتيني متطورة للغاية المشاركة في مجمع مسارات الإشارات التنظيمية. تصنف البروتياز إلى سبع مجموعات وفقا لموقع نشط التحفيزي على: اسبارتاتي، الأسباراجين، السيستين وحمض الجلوتاميك، فلزية، سيرين، والبروتياز ثريونين. البروتياز مختلفة تستهدف مواقع متميزة الانقسام التي ليست دائما سهلة للتنبؤ من الهيكل الأساسي للبروتين. قاعدة بيانات MEROPS ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> يوفر) معلومات مفصلة عن مجموعة واسعة من البروتياز والمواقع الانقسام التفضيلية الخاصة بهم. ويمكن تحديد المواقع ذات الصلة الانقسام وظيفيا باستخدام الطفرات الموجهة الموقع. ومن الثابت أن معالجة بروتين عناق هو آلية هامة من تفعيل الهو خاص القناة الايونية 1،2. ومن المثير للاهتمام، وهناك أدلة على أن وظيفة الاستشعار حمض ذات الصلة قناة أيون 1A (ASIC1a) ويمكن أيضا تعديلها من قبل البروتياز 3-5. في الوقت الحاضر يبقى السؤال مطروحا عما إذا كان الانقسام قناة بروتين يلعب دورا الفسيولوجية ذات الصلة في تنظيم نشاط القنوات الأيونية أو غيرها من شركات النقل. ومع ذلك، فإنه من الثابت أيضا أن الانقسام بروتين ينشط مجموعة من G مستقبلات البروتين يقترن، المستقبلات تنشيط الأنزيم البروتيني (بارس) 6. العديد من البروتياز سيرين (مثل البروتياز-تفعيل قناة (CAP1-3)، كيموتربسين، التربسين، فورين، بلازمين، العدلة إيلاستاز، وكاليكريين) وقد ثبت لتفعيل proteolytically ENAC 2. بالإضافة إلى البروتياز سيرين، يمكن أن تشارك مجموعات أخرى من البروتياز في تفعيل ENAC بروتين. في الواقع، تظهر البيانات الأخيرة أن الفلزي meprin-β 7 والسيستين البروتيني كاتيبسين-S 8 ويمكن أيضا ACTIVAالشركة المصرية للاتصالات عناق. ومع ذلك، تظل (المرضية) البروتياز ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لتفعيل ENAC يتم تحديدها ويمكن أن تختلف من الأنسجة إلى الأنسجة. ومن المعروف البروتياز ليلتصق بشكل تفضيلي في مواقع معينة في تسلسل الأحماض الأمينية. على سبيل المثال، يظهر كيموتربسين سيرين البروتياز نمط انشقاق الشق محددة بعد العطرية الأمينية حمض الفينيل ألانين والتيروزين مخلفات. في المقابل، فإن سيرين البروتيني التربسين تفضيلي يشق بعد مخلفات يسين الأساسية أو أرجينين. باستخدام متحولة يبني γENaC الإنسان الناتجة عن الطفرات الموجهة الموقع، ويمكن تحديد المواقع ذات الصلة الانقسام وظيفيا في عناق أعرب heterologously في نظام التعبير البويضة 8-13. عن طريق حقن كرنا لمفارز عناق الثلاثة (αβγ) إلى البويضات معزولة، ENAC يمكن التعبير عنها وظيفيا في هذه الخلايا والنشاط من قنوات موجودة في غشاء البلازما يمكن أن تقاسباستخدام اثنين من القطب تقنية الجهد المشبك. باستخدام الأميلوريد مدر للبول، مثبط ENAC محددة، وعناق بوساطة خلية كاملة المكون الحساسة للأميلوريد الحالية (ΔI عامي) يمكن فصلها عن تسرب التيارات غير محددة أو من التيارات التي أجرتها القنوات الأيونية الأخرى. وبالتالي، والقيم ΔI عامي تعكس النشاط ENAC الشاملة ويمكن تحديده من خلال طرح تيارات خلية كاملة يقاس بحضور الأميلوريد من التيارات خلية كاملة المقابلة سجلت في غياب الأميلوريد. لاختبار ما إذا كان البروتيني له تأثير تنشيطية على ENAC، يتم قياس ΔI عامي مرتين في نفس البويضة، أي قبل وبعد حضانة البويضة في محلول يحتوي على الأنزيم البروتيني. بزيادة قدرها ΔI عامي من الأول إلى الثاني يشير قياس تنشيط بروتين عناق. ومن المعروف كيموتربسين التربسين أو الحد الأقصى لتحفيز ENAC في نظام التعبير البويضة 2،14 ويمكن استخدامها لconfiجمهورية مقدونيا أن تنشيط بروتين ENAC قابلا للاكتشاف في دفعة معينة من البويضات. بالتوازي مع القياسات الحالية خلية كاملة، تم استخدام نهج biotinylation 9 إلى التحقيق في ما إذا كانت الزيادة في ΔI عامي الكشف عند التعرض للالبويضات لالبروتياز يرتبط ظهور ENAC الانقسام شظايا على سطح الخلية. وصفت البروتينات على سطح الخلية مع البيوتين ويمكن فصلها عن البروتينات داخل الخلايا بواسطة ربط البروتينات البيروكسيديز إلى حبات الاغاروز Neutravidin المسمى. ويمكن تحليل البروتينات البيروكسيديز بواسطة لطخة غربية. ويمكن الكشف عن γENaC شظايا الانقسام على سطح الخلية باستخدام الأجسام المضادة المحددة الموجهة ضد حاتمة في محطة سي من γENaC. لتحديد موقع انشقاق ذات الصلة وظيفيا (ق)، ويمكن توقع تحور مواقع انشقاق باستخدام الطفرات الموجهة الموقع. تتم مقارنة قنوات Wildtype ومتحولة في التجارب المتوازية باستخدام البويضات من لياليدفعة آمي. مع هذا الأسلوب المنهجي وقد تجلى ذلك لأول مرة أن تنشيط بروتين من ENAC بوساطة تيارات خلية كاملة يرتبط مع تعتمد على الوقت ظهور ENAC الانقسام شظايا على سطح الخلية. هذه النتائج تشير إلى وجود علاقة سببية بين قناة الانقسام وتفعيل القناة. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الطفرات الموجهة موقع من المواقع الانقسام المفترضة في تركيبة مع اثنين من القطب تقنية الجهد المشبك، والمواقع ذات الصلة الانقسام وظيفيا لبلازمين، كيموتربسين كاتيبسين و13-S 8 تم تحديدها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

للتحقيق في ما إذا كان بلازمين البروتيني سيرين يمكن تنشيط التيارات ENAC بوساطة، تقرر ΔI عامي الفردية البويضات ENAC، معربا عن قبل وبعد 30 دقيقة حضانة البويضات في خالية من الأنزيم البروتيني (السيطرة) (الشكل 2A) أو التي تحتوي على حل بلازمين (الشكل 2B) باستخدام يومين القطب تقنية الجهد المشبك (انظر الشكل 1). التعرض لبلازمين زيادة ΔI عامي في كل بويضة قياسها. في المقابل، في تجارب السيطرة، وكان 30 دقيقة حضانة ENAC، معربا عن البويضات في محلول خالية من البروتيني له تأثير يذكر (الشكل 2 C، D). وبالتالي، باستخدام هذه الطريقة يمكن الكشف عن التحفيز الحالية ENAC بوساطة بلازمين. لدراسة آثار تحور المواقع الانقسام المفترضة على تفعيل التيارات ENAC بوساطة، وكذلك على قناة الانقسام، وتمت مقارنة تأثير كيموتربسين على WT-ENAC مع ذلك علىوENAC متحولة مع prostasin تحور والمواقع الانقسام بلازمين (γ RKRK178AAAA؛ K189A). وكان التحقيق مجرى وقت التنشيط قناة كتبها كيموتربسين فضلا عن ظهور انشقاق ENAC المنتجات على سطح الخلية باستخدام مختلف الأوقات البروتيني الحضانة (الشكل 4A). وقد تبين أن التأخير قناة متحولة ويقلل من تفعيل الحالية ENAC بوساطة كيموتربسين. ويتوازى ذلك من خلال مظهر تأخر انخفاض الوزن الجزيئي γENaC انشقاق جزء من 67 كيلو دالتون الموافق الوحيدات المشقوق بالكامل. تم الكشف عن شظايا الانقسام باستخدام الأجسام المضادة γENaC الموجهة ضد حاتمة في محطة سي (الشكل 3). يوضح هذا النهج المنهجية التي مدار الساعة من تفعيل بروتين التيارات ENAC بوساطة يرتبط مع ظهور منتج انشقاق 67 كيلو دالتون γENaC على سطح الخلية (الشكل 4 B، C). هذا يدعم مفهومالعلاقة السببية بين قناة بروتين الانقسام وتفعيل القناة 13. علاوة على ذلك، من خلال الجمع بين القياسات الحالية والكشف عن شظايا γENaC على سطح الخلية وقد تبين أن المواقع الانقسام تحور ذات الصلة وظيفيا لتفعيل قناة بروتين. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. إجراءات تحديد تأثير تنشيطية لالبروتيني على ENAC أعرب heterologously في القيطم المورق البويضات. ويقدر النشاط ENAC عن طريق قياس حساسة للالأميلوريد خلية كاملة المكون الحالي ΔI عامي. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> الشكل 2. بلازمين يحفز CURREN ENAC بوساطةTS في البويضات معربا عن عناق. وحضنت (AD) البويضات معربا عن عناق الإنسان لمدة 30 دقيقة في محلول خالية من الأنزيم البروتيني (السيطرة) أو في محلول يحتوي على بلازمين (10 ميكروغرام / مل). لتحديد ΔI عامي قبل (-) وبعد (+) الحضانة، وفرضت البويضات في إمكانية عقد -60 بالسيارات (A، B) أربعة خلية كاملة آثار الحالية ممثلة من دفعة واحدة من البويضات. كان الأميلوريد (عامي) موجودة في حل حمام لمنع تحديدا ENAC كما يتبين من أشرطة سوداء. (C) وترتبط نقطة البيانات التي تم الحصول عليها من بويضة الفردية عن طريق خط (D) ملخص تجارب مماثلة كما هو مبين في C. أعمدة تمثل تأثير تنشيطية النسبي على ΔI عامي تحسب كنسبة من ΔI عامي يقاس بعد 30 دقيقة الحضانة (ΔI عامي 30 دقيقة) إلى ΔI عامي الأولي (ΔI عامي الأولي) قياس قبل الحضانة. الأرقام داخل الأعمدة تشير إلىعدد من البويضات الفردية قياسها. يشير N عدد من دفعات مختلفة من البويضات. (تم تعديل هذا الرقم من [Haerteis وآخرون 2012 J الجنرال الفيزيولوجيا 140، 375-389، دوى: 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="الرقم 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> الشكل 3. نموذج من γENaC الوحيدات تبين مواقع الانقسام لتنشيط بروتين وموقع ملزم من الأجسام المضادة المستخدمة. انشقاق بروتين من قبل فورين كونفيرتاز جولجي المصاحب مهم لعناق النضج في مسار السكروز قبل أن تصل القناة غشاء البلازما. بعد الانقسام من قبل فورين 76 كيلو دالتون جزء يمكن الكشف على سطح الخلية باستخدام نهج biotinylation والأجسام المضادة ضد حاتمة في محطة سي من γ-الوحيدات. الخطوة النهائية محوريا في بروتين ENتفعيل تيار متناوب ربما يقام في غشاء البلازما حيث المشقوق γENaC بواسطة البروتياز خارج الخلية (مثل بلازمين أو كيموتربسين) في المنطقة البعيدة إلى موقع فورين مما أدى إلى انشقاق جزء 67 كيلو دالتون. (تم تعديل هذا الرقم من [Haerteis وآخرون 2012 J الجنرال الفيزيولوجيا 140، 375-389، دوى: 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="الرقم 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> الشكل 4: تحور كل من بلازمين (K189) وموقع الانقسام prostasin (RKRK178) يؤخر تفعيل التيارات ENAC بوساطة وظهور منتج انشقاق 67 كيلو دالتون من القناة γ-الوحيدات البويضات معربا عن WT (حرف مفتوح) و γ RKRK178AAAA؛ حضنت K189A ENAC قناة متحولة (الرموز المغلقة) لمدة 30 دقيقة في محلول خالية من الأنزيم البروتيني (السيطرة) أو 5، 30، أو 60 دقيقة في محلول يحتوي على كيموتربسين (2 ميكروغرام / مل). (A) لتحديد ΔI عامي قبل وبعد الحضانة، وفرضت البويضات في إمكانية عقد -60 بالسيارات. الدوائر تمثل نسبة ΔI عامي قياس بعد 5 أو 30 أو 60 دقيقة الحضانة (ΔI عامي دقيقة) إلى ΔI عامي الأولي (ΔI عامي الأولي) قياس قبل الحضانة. كل نقطة بيانات يمثل متوسط ​​ΔI عامي 22-24 في قياس البويضات الفردية أربع دفعات مختلفة. (BD) وبالتوازي مع الكشف عن ΔI عامي التعبير عن γENaC البيروكسيديز على سطح الخلية وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. تم الكشف عن γENaC مع الأجسام المضادة ضد حاتمة في محطة سي من γENaC الإنسان. وتظهر البقع ممثل الغربي من دفعة واحدة من البويضات. (CE) تحليل الكثافة من ثلاثة البقع الغربية مشابهة لتلك التي تظهر في باء أو دال على كل حارة، لياليتم تحديد ignals الكشف في مناطق 76 دينار كويتي (أعمدة مفتوحة) و 67 دينار (الأعمدة الرمادي) وتطبيع للمجموع الكلي الكشف عن إشارة. يشير N عدد من دفعات مختلفة من البويضات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments at JoVE.c

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

تنشيط بروتين للقناة الصوديوم الظهارية (عناق) أعرب heterologously في القيطم المورق يمكن البرهنة البويضات عن طريق الجمع بين القياسات الحالية مع نهج biotinylation للتحقيق في ظهور منتجات انشقاق القناة الايونية على سطح الخلية. ويمكن تحديد مواقع انشقاق مهم وظيفيا باستخدام الطفرات الموجهة الموقع.

مظاهرة من بروتين تفعيل قناة الصوديوم الظهارية (عناق) من خلال الجمع بين المقاييس الحالية مع الكشف عن الشق شظايا

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K Views.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  تنشيط بروتين للقناة الصوديوم الظهارية (عناق) أعرب heterologously في القيطم المورق يمكن البرهنة البويضات عن طريق الجمع بين القياسات الحالية مع نهج biotinylation للتحقيق في ظهور منتجات انشقاق القناة الايونية على سطح الخلية. ويمكن تحديد مواقع انشقاق...

Video: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Interview: Glycolipid Antigen Presentation by CD1d and the Therapeutic Potential of NKT cell Activation

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious agents, and the development of artheriosclerotic plaques.   In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.  Central to these studies is CD1d - the antigen presenting molecule that presents glycolipids to NKT cells.  The advent of CD1d tetramer technology, a technique developed by the Kronenberg lab, is critical for the sorting and identification of subsets of specific glycolipid-reactive T cells.  Mitch explains how glycolipid agonists are being used as therapeutic agents to activate NKT cells in cancer patients and how CD1d tetramers can be used to assess the state of the NKT cell population in vivo following glycolipid agonist therapy.  Current status of ongoing clinical trials using these agonists are discussed as well as Mitch's prediction for areas in the field of immunology that will have emerging importance in the near future.

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmunity, clearance of infection, and the development of artheriosclerotic plaques. In this interview, Mitch Kronenberg discusses his laboratory's efforts to understand the mechanism through which NKT cells are activated by glycolipid antigens.

مقابلة : شحمي سكري تقديم المستضد بواسطة CD1d والعلاجية المحتملة لتنشيط الخلايا NKT

Natural Killer T cells (NKT) are critical determinants of the immune response to cancer, regulation of autioimmune disease, clearance of infectious ...

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

مظاهرة Allodynia الجلدية في الشراكة مع ألم مزمن في الحوض

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

تحليل وظيفة GTPases الصغيرة التي Microinjection من البلازميدات إلى الخلايا الظهارية المستقطب

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

الاغاروز الكهربائي للهلام لفصل أجزاء الحمض النووي

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...