The expert technical assistance of C&#233;line Gr&#252;ninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplin&#228;res Zentrum f&#252;r Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universit&#228;t Erlangen-N&#252;rnberg, and the University Library of Erlangen-N&#252;rnberg.

1. Isolamento di Xenopus ovociti e microiniezione di cRNA <ol><li> Ottenere ovociti da adulto di sesso femminile Xenopus laevis. Anestetizzare gli animali nel 0,2% MS222, e resecare lobi ovarici attraverso una piccola incisione addominale. </li><li> Isolare ovociti dai lobi ovarici mediante digestione enzimatica a 19 ° C per 3-4 ore con 600-700 U / ml di collagenasi di tipo 2 Clostridium histolyticum disciolti in soluzione OR2 calcio libero (ricetta in Tabella 1). </li><li> Per la selezione, posizionare gli ovociti defolliculated in una capsula di Petri sotto un microscopio binoculare in una soluzione contenente sodio alta (ND96: ricetta in Tabella 1). </li><li> Selezionare fase V-VI ovociti e metterli in un altro piatto di Petri con una pipetta Pasteur. NOTA: Blunt pipetta Pasteur da fiamme per evitare lesioni ovocita. </li><li> Iniettare ovociti con cRNA (ad esempio 0,2 ng per αβγENaC subunità). Sciogliere cRNA in acqua RNase-free. NOTA: Totalvolume iniettato in ciascun ovocita è di 46 nl. </li><li> Conservare iniettato ovociti a 19 ° C in una soluzione di sodio bassa da evitare il caricamento di sodio degli ovociti (ND9: ricetta in Tabella 1). Integrare la soluzione con penicillina 100 U / ml di sodio e 100 pg / ml di solfato di streptomicina per prevenire la crescita batterica. Maneggiare con cura gli ovociti per limitare la quantità di ovociti danneggiati o morti e mantenerli in singoli piccoli gruppi in un pozzo di 12 pozzetti riempiti con soluzione del bagno durante i due giorni dopo l&#39;iniezione cRNA. </li></ol> 2. Esecuzione a due elettrodi Esperimenti di tensione-clamp <ol><li> Misurare la ovociti due giorni dopo l&#39;iniezione. </li><li> Riempire una siringa di un sistema di perfusione gravità alimentata con soluzione ND96 e un&#39;altra siringa con soluzione ND96 contenente amiloride (2 mM). Mount siringhe 50 centimetri sopra la camera da bagno ovocita. NOTA: La concentrazione del amiloride inibitore ENaC è stato scelto per essere 20 volte superiore alla IC50 </sub&gt; (100 nm). </li><li> Accendere una sorgente di luce fredda alogena 150 W e regolarlo a 10 cm al di sopra della camera di bagno ovocita che consente una buona visualizzazione con il microscopio binoculare. Quindi accendere aspirante e regolare il tubo di aspirazione alla fine della camera di bagno ovocita. Individuare tubo di aspirazione opposta a superfusione tubi &#39;adattatore di entrare nel bagno ovocita. NOTA: Potenza di aspirazione deve essere sufficiente a sostenere il flusso continuo della soluzione superfusing l&#39;ovocita. </li><li> Regolare la velocità superfusione di ciascuna soluzione di 3-5 ml / min utilizzando il dispositivo di controllo del flusso iv gravità. Collegare i tubi superfusione con un adattatore alla camera bagno ovocita. </li><li> Tirare capillari di vetro con un estrattore micropipetta per ottenere diametri di punta di &lt;1 micron. Poi riempire capillari a ~ 1/4 con 3 M KCl. NOTA: Assicurarsi che la parte clorurato del filo d&#39;argento del titolare elettrodo è immerso in soluzione KCl. Verificare la presenza di bolle d&#39;aria nella punta del capillare. Le bolle d&#39;aria compromettono la misurement aumentando la resistenza capacità parassite. </li><li> Inserire i capillari nei supporti elettrodi della corrente e l&#39;elettrodo di tensione e metterli in ND96 contenente amiloride soluzione (2 micron) utilizzando i micro-manipolatori. </li></ol> 3. Misura delle Correnti Whole-cell Amiloride-sensibili <ol><li> Zero potenziale dell&#39;elettrodo dell&#39;elettrodo tensione (V m) e l&#39;elettrodo di corrente (V e) regolando la V m e V e compensati pulsanti. NOTA: La resistenza deve essere 1-2 mW per l&#39;elettrodo per misurare V e 0,5 m -1 mW per l&#39;elettrodo di iniezione di corrente. </li><li> Posizionare l&#39;ovocita nella camera bagno in prossimità dell&#39;elettrodo rilevamento della tensione. NOTA: Non danneggiare l&#39;ovocita durante una di queste operazioni di trasferimento. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire l&#39;ovocita. Per evitare di danneggiare l&#39;ovocita i bordi della pipetta deve essere smussati mediante esposizione alla fiamma. </li><li> Impale oociti delicatamente con entrambe le microelettrodi. </li><li> Impostare la potenziale partecipazione al amplificatore a -60 mV e accendere il registratore grafico. Accendere il amiloride (2 micron) contenente soluzione. NOTA: La corrente dovrebbe essere di circa 0 ± 0,5 μA. Correnti di fuga più grandi indicano un impalamento perde. Pertanto, questi ovociti devono essere respinti. Inoltre, le correnti di fuga misurata in presenza di amiloride (2 mM) dovrebbero essere simili in αβγ-WT esprimendo ovociti a quelle misurate in αβγ-mutante ENaC esprimere oociti. Ciò indica che le mutazioni non influiscono sulla amiloride-sensibilità del canale. </li><li> Avviare la registrazione. Se necessario regolare il guadagno. </li><li> Dopo la corrente misurata raggiunge un plateau stabile, passare alla soluzione senza amiloride. NOTA: deviazioni in corso al ribasso le tracce attuali corrispondono a correnti interiori, vale a dire il movimento di carica positiva (Na +) dal lato extracellulare nella cellula. </li><li> After un plateau di corrente viene raggiunto (dopo ~ 60 sec), accendere il superfusione torna alla soluzione contenente amiloride. Dopo la corrente del ovocita raggiunge la corrente di linea di base iniziale, spegnere il morsetto di tensione e delicatamente ritirare gli elettrodi. </li><li> Per consentire richiusura della membrana plasmatica nei siti di impalamento, posizionare l&#39;ovocita in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 100-150 ml di soluzione ND96 proteasi gratuito. </li><li> Dopo 5 min, trasferire oocita una proteasi contenente soluzione o di una soluzione di controllo senza proteasi per un tempo di incubazione di 30 min. NOTA: Il tempo di incubazione dipende dalla proteasi e il canale studiato. </li><li> Dopo la fase di incubazione ripetere la misura della corrente (vedere 3.2 e seguenti). NOTA: È possibile misurare&gt; 90% degli ovociti dopo incubazione in soluzione di proteasi. </li></ol> 4. Biotinilazione Assay <ol><li> Selezionare e scartare ovociti difettosi sotto il microscopio binoculare. NOTA: Utilizzare InjectEd ovociti dallo stesso lotto per le misure di corrente e per gli esperimenti biotinilazione. </li><li> Mantenere biotina a TA per almeno 20 minuti prima del suo uso nell&#39;esperimento. </li><li> Preparare le soluzioni: ND96 e ND96 contenente la proteasi appropriato. Preparare pipette Pasteur assegnando un&#39;etichetta e brevemente fiammeggiante loro consigli per evitare lesioni degli ovociti. NOTA: Qui, viene utilizzata la proteasi chimotripsina 2 ug / ml in ND96. Trattare ogni gruppo con una pipetta separato per evitare la contaminazione incrociata di soluzioni. </li><li> Riempire ogni pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 2,5 ml controllo ND96 ND96 o contenente una proteasi a RT. Poi depositare 30 ovociti per bene e li incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per le procedure successive è importante mantenere i campioni in ghiaccio in ogni momento. Tutte le fasi di centrifugazione sono al eseguite a 4 ° C. </li><li> Riempire ogni pozzetto di una nuova piastra da 6 pozzetti con 2,5 ml ND96 (ogni gruppo ha bisogno di 3 pozzi per le fasi di lavaggio) e pesare la biotina. NOTA: 2,5 mg biotina per bene è necessaria (1 mg / ml). Sciogliere la biotina nel buffer biotinylation (cioè 25 mg biotina (per 10 gruppi) in 25 ml di tampone biotinylation (ricetta in Tabella 1). </li><li> Trasferire ciascun gruppo di oociti di un pozzo riempito con 2,5 ml ND96. Trasferimento ovociti sequenziale in due pozzi aggiuntivi con ND96 per lavare via ogni residuo della proteasi. Incubare gli ovociti per 5 min in ND96. </li><li> Trasferire gli ovociti in un pozzo contenente 2,5 ml di soluzione di biotina e incubare con leggera agitazione (&#39;shaker&#39;) per 15 min. NOTA: Ridurre al minimo l&#39;ND96 trasferita con la pipetta per evitare la diluizione della soluzione di biotina. </li><li> Trasferire ciascun gruppo di oociti in un pozzo contenente 2,5 ml di tampone quench (ricetta in Tabella 1) per arrestare la reazione biotinilazione. Poi, il trasferimento di ciascun gruppo di ovociti in un secondo pozzo anche contenente 2,5 ml di placare il buffer e incubare per 5 minuti con agitazione. </li><li> Rimuovere ovociti danneggiati o morti. Nota:Scegliere lo stesso numero di ovociti per gruppo per la seguente procedura. </li><li> Trasferire ciascun gruppo di oociti in una provetta di plastica da 1,5 ml. NOTA: Ridurre al minimo la quantità di buffer di tempra che viene trasferito. </li><li> Successivamente, lisare gli ovociti facendoli passare attraverso un ago 27 G in 1 ml di tampone di lisi (ricetta vedi Tabella 1) integrato con inibitori della proteasi. </li><li> Centrifugare i lisati per 10 min a 1500 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 0,5% Triton-X-100 e 0,5% NP40. Eliminare il pellet rimanente. NOTA: Il surnatante contiene proteine ​​di membrana del plasma biotinilato e proteine ​​intracellulari non biotinilato. </li><li> Incubare le provette da microcentrifuga per 20 min in ghiaccio. Ripetutamente vortex le provette durante questo periodo per sciogliere completamente le proteine ​​NP40 e Triton-X-100. </li><li> Centrifuga 100 ml di agarosio per gruppo di ovociti per 3 minuti a 1500 x g. Dopo l&#39;centrifugazione Rimuovere il surnatante dalla soluzione perline e lavare tre volte con tampone di lisi per equilibrare le perline con tampone. </li><li> Pipettare 100 ml di perline lavati in ciascuna provetta contenente la proteina-detergente-soluzione preparata in 4.13 per consentire il legame delle proteine ​​biotinilati verso le perline. </li><li> Incubare le provette per microcentrifuga con testa di rotazione O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugare le provette da microcentrifuga per 3 minuti a 1500 x g. Poi trasferire il surnatante in una nuova provetta. NOTA: le proteine ​​intracellulari non sono etichettati con biotina. Il supernatante può essere conservato a -20 ° C. Non aspirare le perline. </li></ol> 5. Rilevazione dell&#39;Enac Decolleté frammenti sulla superficie cellulare tramite Western Blot analisi <ol><li> Lavare le perline tre volte con tampone di lisi e aggiungere 100 ml di 2x tampone campione SDS-PAGE. NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 ° C o immediatamente preparati per l&#39;analisi Western Blot. </li><li> Bollire samples per 5 min a 95 ° C e posizionare i tubi su ghiaccio. </li><li> Centrifugare i campioni per 3 min a 20.000 xg e pipetta il surnatante in una nuova provetta. NOTA: Questo surnatante contiene le proteine ​​della membrana plasmatica biotinilati dalla superficie cellulare dell&#39;ovocita. </li><li> Analizzare 30 ml di questa supernatante mediante western blot per indagare frammenti scissione sulla superficie cellulare. </li><li> Separare le proteine ​​biotinilati mediante SDS-PAGE (sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide) utilizzando un gel appropriato (8%, 10%, 12% a seconda del peso molecolare dei frammenti di scissione indagati). </li><li> Trasferire le proteine ​​di polivinilidene (PVDF), membrane per blotting semi-asciutto. </li><li> Sondare la membrana con un anticorpo specifico contro γENaC umano diretto contro un epitopo nel C-terminale (vedi figura 3 e 13). </li><li> Utilizzare anticorpo anti-coniglio perossidasi di rafano-marcato capra come anti secondariocorpo. </li><li> Rilevare i segnali chemioluminescenti. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In questo manoscritto un approccio metodologico che è stato applicato con successo per studiare i meccanismi alla base l&#39;attivazione dell&#39;Enac da proteasi è descritto 8,13. Il laevis sistema di espressione consolidata Xenopus ovocita è stato usato per funzionalmente espresso ENaC. Funzione ENaC è stata valutata con i due elettrodi tecnica voltage-clamp convenzionale. Mutagenesi sito-diretta è stato impiegato per identificare funzionalmente pertinenti siti di clivaggio della proteasi. Biotinylation esperimenti effettuati in parallelo con le misure elettrofisiologiche hanno permesso di correlare l&#39;aspetto di dell&#39;ENaC clivaggio prodotti sulla superficie cellulare con l&#39;attivazione proteolitica corrente. Una correlazione tra l&#39;andamento nel tempo di attivazione corrente e la comparsa di frammenti clivaggio proteolitico alla superficie cellulare supporta il concetto di attivazione del canale proteolitica. Due elettrodi di voltage-clamp richiedono l&#39;impalamento di un oocyte con due microelettrodi. Questa procedura viene di solito eseguita solo una volta in un individuo ovocita. Tuttavia, era possibile eliminare i microelettrodi dopo una registrazione corrente whole-cell iniziale senza danno apparente al ovocita. Infatti, la membrana plasmatica nei siti di impalements sembra richiudere in pochi minuti. Così, dopo aver completato una prima misura di tensione-clamp a due elettrodi, è possibile trasferire l&#39;ovocita dalla camera di flusso sperimentale della configurazione voltage-clamp a due elettrodi in una provetta da microcentrifuga o un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti riempiti con un piccolo volume di soluzione di prova o di controllo. Successivamente, lo stesso ovocita può essere trasferito di nuovo alla camera di flusso e può essere nuovamente impalata per eseguire una seconda misurazione di tensione-clamp a due elettrodi. Sorprendentemente, le correnti ENaC-mediate non variano molto tra la prima e la seconda misurazione quando l&#39;ovocita è stato mantenuto in soluzione di controllo. Al contrario, l&#39;incubazione del ovocita in una proteasi contenente solution dopo la prima misurazione comportato un aumento corrente ENaC-mediata nella seconda misurazione (Figura 2). Questa scoperta indica l&#39;attivazione del canale proteolitica. Esecuzione di due misure di corrente separati in un unico ovocita offre il vantaggio che l&#39;ovocita può essere esposta a proteasi o altri agenti farmacologici tra le due misurazioni per un tempo variabile in un piccolo volume di soluzione di prova. Questo è importante quando si usano agenti che sono costosi e / o non disponibile in grandi quantità, per esempio proteasi preparazioni purificate. La limitata disponibilità di farmaci può rendere impossibile (o sono troppo costosi) usarli in continuo due elettrodi voltage-clamp a causa dei grandi volumi di soluzione da esaminare per superfusing continuamente gli ovociti con portate di diversi millilitri al minuto. Inoltre, continui a due elettrodi misurazioni di tensione-clamp sono limitate dal fenomeno notoenon di fatiscente canale spontanea descritti anche per ENaC 15. Al contrario, esponendo gli ovociti di testare soluzioni tra due misurazioni distinte per un massimo di un&#39;ora o più in genere non rappresenta un problema (vedi Figura 4A). Infine, due misure sequenziali eseguite nello stesso ovocita permettono osservazioni accoppiate degli effetti del farmaco. Questo ha un vantaggio rispetto misurazioni spaiati da due distinti gruppi di ovociti (proteasi trattati e trattati con veicolo), perché riduce il problema della elevata variabilità tra ovociti, generalmente osservati in canali ionici. Con osservazioni accoppiati e la possibilità di normalizzare i dati per la prima misura, meno ovociti sono necessari per gruppo sperimentale di dimostrare un effetto significativo di un agente farmacologico. Normalizzazione dei dati rende anche più facile da riassumere i dati provenienti da diversi lotti di ovociti con diversi livelli di espressione del canale ionico e, quindi, diverse correnti di base (Figura 2D). Ovviamente, esperimenti di controllo sono necessari per questo approccio per dimostrare che l&#39;attività del canale ionico di interesse rimane stabile in oociti di controllo trattati con veicolo dalla prima alla seconda misura (vedi figura 2). Per dimostrare che l&#39;attivazione proteolitica corrente correla con la comparsa di dell&#39;ENaC clivaggio prodotti sulla superficie cellulare, un approccio biotinilazione originariamente descritto da Harris et al. 9 può essere utilizzato. Questa procedura (come descritto nella sezione del protocollo e mostrato in Figura 4) è stato adattato per dimostrare che l&#39;esposizione dei canali di proteasi e successiva attivazione di correnti dell&#39;ENaC-mediate è accompagnato dalla comparsa dipendente dal tempo di frammenti di scissione. Il metodo biotinylation permette anche l&#39;analisi di un aumento o una diminuzione complessiva di proteine ​​di membrana sulla superficie cellulare. Pertanto, questo metodo è adatto per studiare l&#39;effetto di proteasi e altri pharAgenti same momento dell&#39;inserimento canale nella membrana plasmatica o su recupero canale. Inoltre, l&#39;analisi Western blot delle proteine ​​della membrana plasmatica biotinilati permette di individuare i frammenti proteici (ad esempio frammenti proteolitici dell&#39;ENaC) o cambiamenti nel modello di glicosilazione che può essere funzionalmente rilevante. In conclusione, la combinazione dei metodi usati per studiare l&#39;effetto stimolatorio di proteasi sulle correnti di cellule intere ENaC-mediate e dimostrare una correlazione con il verificarsi di dell&#39;ENaC clivaggio prodotti sulla superficie cellulare può essere utile per una vasta gamma di applicazioni. In particolare, questi metodi possono essere adatti ad affrontare questioni analoghe per quanto riguarda la regolamentazione di altri canali ionici, trasportatori o recettori transmembrana (ad esempio proteasi-activated recettori PARs).

Le proteasi sono enzimi che sono coinvolti in varie reazioni fisiologiche che vanno dal noto degradazione proteolitica delle proteine, nel contesto della digestione, alle sofisticate cascate proteasi implicate in vie di segnalazione regolamentazione complesse. Le proteasi sono classificati in sette gruppi in base al loro sito attivo catalitico: aspartato, asparagina, cisteina, acido glutammico, metallo, serina, treonina e proteasi. Diverse proteasi bersaglio siti di taglio distinte non sempre facile prevedere dalla struttura primaria di una proteina. Il database MEROPS ( <a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a> ) fornisce informazioni dettagliate su una vasta gamma di proteasi e dei loro siti di taglio preferenziali. Siti di clivaggio funzionalmente rilevanti possono essere identificati mediante mutagenesi sito-diretta. E &#39;ben noto che l&#39;elaborazione proteolitica dell&#39;Enac è ​​un importante meccanismo di attivazione del secoloè particolare 1,2 canale ionico. È interessante notare, è evidente che la funzione del relativo acido-sensing canale ionico 1a (ASIC1a) può anche essere modificato da proteasi 3-5. Al momento resta una questione aperta se la scissione proteolitica canale gioca un ruolo fisiologico rilevante nel regolare l&#39;attività di altri canali ionici e trasportatori. Tuttavia, è ben noto che clivaggio proteolitico attiva un gruppo di G recettori accoppiati alla proteina, i recettori proteasi-attivato (PARs) 6. Diversi serina-proteasi (ad esempio proteasi canale attivazione (CAP1-3), chimotripsina, tripsina, Furin, plasmina, neutrofili elastasi e callicreina) sono stati indicati per attivare proteoliticamente ENaC 2. Oltre alla serina proteasi, altri gruppi di proteasi possono essere coinvolti nella attivazione proteolitica ENaC. Infatti, dati recenti mostrano che la metalloproteinasi meprin-β 7 e la cisteina proteasi catepsina S-8 può anche activaTE ENaC. Tuttavia, le (pato-proteasi) fisiologicamente rilevanti per l&#39;attivazione ENaC restano da definire e possono differire da tessuto a tessuto. Le proteasi sono noti per scindere preferenzialmente in particolari siti nella sequenza aminoacidica. Per esempio, la chimotripsina serina proteasi mostra un modello specifico di clivaggio clivaggio dopo il aminoacidi aromatici residui fenilalanina e tirosina. Al contrario, la serina proteasi tripsina preferenzialmente scinde dopo la residui di lisina o arginina base. Utilizzando mutanti costrutti γENaC umano generati da mutagenesi sito-diretta, siti di clivaggio funzionalmente pertinenti dell&#39;ENaC eterologhi espressi nel sistema di espressione ovocita potrebbero essere identificati 8-13. Iniettando cRNA per i tre subunità dell&#39;ENaC (αβγ) in oociti isolati, ENaC può esprimere funzionalmente in queste cellule e l&#39;attività dei canali presenti sulla membrana plasmatica può essere misurata medianteusando la tecnica voltage-clamp a due elettrodi. Utilizzando il amiloride diuretico, un inibitore ENaC specifico, il ENaC-mediata componente corrente whole-cell amiloride-sensibile (ΔI ami) possono essere separati dalle correnti di fuga aspecifiche o da correnti condotte da altri canali ionici. Così, i valori ΔI ami riflettono attività complessiva ENaC e possono essere determinati sottraendo correnti cellule intere misurati in presenza di amiloride dalle correnti di cellule intere corrispondenti registrate in assenza di amiloride. Per verificare se una proteasi ha un effetto stimolante sulla ENaC, ΔI ami viene misurato due volte nello stesso ovocita, cioè prima e dopo incubazione della ovocita in una soluzione contenente proteasi. Un aumento di ΔI ami dalla prima alla seconda misura indica l&#39;attivazione proteolitica ENaC. Chimotripsina tripsina o sono noti per stimolare massimo dell&#39;ENaC nel sistema di espressione ovocita 2,14 e possono essere usati per confirm che l&#39;attivazione proteolitica ENaC è rilevabile in un determinato lotto di ovociti. In parallelo a misure di corrente di cellule intere, un approccio biotinilazione 9 è stato utilizzato per studiare se l&#39;aumento ΔI ami rilevata dopo esposizione degli ovociti alle proteasi correla con la comparsa di dell&#39;ENaC clivaggio frammenti sulla superficie cellulare. Proteine ​​sulla superficie cellulare sono etichettati con biotina e possono essere separati dalle proteine ​​intracellulari legando le proteine ​​biotinilati di agarosio NeutrAvidin-etichettati. Le proteine ​​biotinilati possono essere analizzati mediante western blot. frammenti di scissione γENaC sulla superficie cellulare possono essere rilevate utilizzando un anticorpo specifico diretto contro un epitopo nel C-terminale della γENaC. Per identificare sito di scissione funzionalmente rilevanti (s), previsto siti di taglio possono essere mutati mediante mutagenesi sito-diretta. Canali di tipo selvatico e mutante sono confrontate in esperimenti paralleli utilizzando ovociti dalle slotto ame. Con questo approccio metodologico è stato dimostrato per la prima volta che l&#39;attivazione proteolitica di correnti di cellule intere dell&#39;ENaC-mediate correla con la comparsa dipendente dal tempo di dell&#39;ENaC clivaggio frammenti sulla superficie cellulare. Questi risultati suggeriscono un nesso di causalità tra la scissione del canale e l&#39;attivazione del canale. Inoltre, mediante mutagenesi sito-diretta di putativi siti di taglio in combinazione con la tecnica a due elettrodi voltage-clamp, siti di clivaggio funzionalmente rilevanti per plasmina, chimotripsina e catepsina 13-S 8 sono stati identificati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1446">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bath Clamp Headstage for OC-725C-V</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold light source - Schott KL 1500 LCD&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Schott&#160;</td>
			<td>#SCOC150200EU</td>
			<td>brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#ESW-F10v</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">left micromanipulator; MM-33L</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIH 1600 - computer interface</td>
			<td style="width:223px;">HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:644px;">magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA)</td>
			<td style="width:223px;">ALA Scientific Instruments, HEKA</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td>heat=550; velocity=22; time=200&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">right micromanipulator; MM-33R</td>
			<td style="width:223px;">Warner Instrument Corporation</td>
			<td>#64-0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Series Electrode Holder (45&#176;, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm)</td>
			<td style="width:223px;">ADinstruments</td>
			<td>#E45w-f10vh&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">STAT 2 IV Gravity Flow Controller</td>
			<td style="width:223px;">Conmed</td>
			<td>#P-S2V-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">vacuum generator ejector SEG - for suction to remove bath solution</td>
			<td style="width:223px;">Schmalz</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">INFUJECT 60ml pump syringes for solutions</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#22050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Injekt-F for lysing the oocytes</td>
			<td style="width:223px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">#9166033V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">standard wall borosilicate tubing with filament&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sutter Instruments</td>
			<td>#BF150-86-10</td>
			<td>outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:1445px;">Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td style="width:223px;">Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">#11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21217</td>
			<td style="width:460px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>#sc-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">NeutrAvidin Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#29200</td>
			<td>Neutravidin-labeled agarose beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP40 (Nonidet P-40)</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">#I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Roti-Load 1 (2&#215; SDS-PAGE sample buffer)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>#K929.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#34095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:644px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>#T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of proteolytic activation of the epithelial sodium channel (enac) by combining current measurements with detection of cleavage fragments

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel&#8217;s &#947;-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (&#916;Iami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of &#947;ENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a &#947;ENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in &#947;ENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Per verificare se la plasmina serina proteasi può attivare correnti ENAC-mediate, ΔI ami di singoli ovociti ENAC-esprimono è stata determinata prima e dopo 30 min di incubazione degli ovociti in libera-proteasi (controllo) (Figura 2A) o una soluzione contenente plasmina (Figura 2B) mediante la tecnica voltage-clamp a due elettrodi (vedere Figura 1). L&#39;esposizione a plasmina è aumentata ΔI ami in ogni ovocita misurato. Al contrario, in esperimenti di controllo, 30 min di incubazione di ovociti dell&#39;ENaC-esprimenti in soluzione priva di proteasi hanno un effetto trascurabile (Figura 2 C, D). Così, utilizzando questo metodo una stimolazione di corrente dell&#39;ENaC mediata da plasmina può essere rilevato. Per studiare gli effetti di mutanti putativi siti di clivaggio dall&#39;attivazione delle correnti ENaC-mediata, così come su clivaggio canale, l&#39;effetto della chimotripsina su WT-ENaC è stato confrontato con quello relativoun ENaC mutante con prostasin mutato e siti di taglio plasmina (γ RKRK178AAAA; K189A). La durata di attivazione del canale da chimotripsina e la comparsa di dell&#39;ENaC clivaggio prodotti sulla superficie cellulare è stata studiata utilizzando diversi tempi di incubazione proteasi (Figura 4A). È stato dimostrato che i ritardi canali mutanti e riduce l&#39;attivazione di corrente dell&#39;ENaC mediata da chimotripsina. Parallelamente si ha una comparsa ritardata di un peso γENaC scissione frammento molecolare inferiore di 67 kDa corrispondente alla subunità completamente scissa. Frammenti di scissione sono state rilevate utilizzando un anticorpo γENaC diretto contro un epitopo nel C-terminale (Figura 3). Questo approccio metodologico dimostra che l&#39;andamento nel tempo di attivazione proteolitica delle correnti dell&#39;ENaC-mediate correla con la comparsa di un prodotto di scissione 67 kDa γENaC sulla superficie cellulare (Figura 4 B, C). Questo supporta il concetto di unnesso di causalità tra scissione proteolitica canale e l&#39;attivazione del canale 13. Inoltre, combinando misure di corrente e la rivelazione di frammenti γENaC alla superficie delle cellule è stato dimostrato che i siti di clivaggio mutati sono funzionalmente rilevante per l&#39;attivazione del canale proteolitica. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Procedura di determinare l&#39;effetto stimolatorio di una proteasi su dell&#39;ENaC eterologhi espressi in oociti di Xenopus laevis. Attività dell&#39;ENaC è stimata misurando la cellula intera componente corrente amiloride sensibile ΔI ami. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2. Plasmina stimola valute ENAC-mediatets in oociti che esprimono ENaC. (AD) Gli oociti esprimenti dell&#39;ENaC umano sono state incubate per 30 min in soluzione priva di proteasi (controllo) o in soluzione contenente plasmina (10 mcg / ml). Per determinare ΔI ami prima (-) e dopo (+) incubazione, oociti sono stati fissati ad un potenziale di -60 mV (A, B) Quattro rappresentativi cellule intere tracce corrente da un lotto di ovociti.. Amiloride (AMI) era presente nella soluzione del bagno di inibire specificamente dell&#39;ENaC come indicato dalle barre nere. (C) punti dati ottenuti da un singolo ovocita sono collegati da una linea. (D) Sintesi di esperimenti simili, come mostrato in C. colonne rappresentano relativo effetto stimolante sulla ΔI ami calcolato come rapporto tra ΔI ami misurata dopo una incubazione di 30 min (ΔI ami 30 min) a quella iniziale ΔI ami (ΔI ami iniziale) misurata prima dell&#39;incubazione. Numeri nelle colonne indicano lanumero di singoli ovociti misurati. N indica il numero di diversi lotti di oociti. (Questa cifra è stata modificata da [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Modello dei γENaC subunità mostrando siti di taglio per l&#39;attivazione proteolitica e il sito di legame dell&#39;anticorpo utilizzato. Clivaggio proteolitico della convertasi furina Golgi-associata è importante per dell&#39;ENaC maturazione della via biosintetica prima che il canale raggiunge la membrana plasmatica. Dopo clivaggio da Furin un frammento di 76 kDa può essere rilevata sulla superficie cellulare utilizzando un approccio biotinylation e un anticorpo contro un epitopo nel C-terminale della subunità γ. L&#39;ultimo passo fondamentale nel proteolitici ENattivazione aC probabilmente prende posto a livello della membrana plasmatica dove γENaC viene scissa da proteasi extracellulari (es. plasmina o chimotripsina) in una regione distale al sito furin risultante in un frammento di clivaggio 67 kDa. (Questa cifra è stata modificata da [Haerteis et al 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:. 10.1085/jgp.201110763]) <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" /> Figura 4:. Mutazione sia la plasmina (K189) e il sito di clivaggio prostasina (RKRK178) ritarda l&#39;attivazione di correnti ENaC-mediata e l&#39;aspetto di un prodotto di scissione 67 kDa di γ-subunità del canale oociti esprimere WT (simboli aperti) e γ RKRK178AAAA; canale mutante K189A dell&#39;ENaC (simboli chiusi) sono state incubate per 30 min in soluzione priva di proteasi (controllo) o per 5, 30, o 60 min in una soluzione contenente chimotripsina (2 mg / ml). (A) Per determinare ΔI ami prima e dopo incubazione, gli ovociti sono stati fissata ad un potenziale di -60 mV. Cerchi rappresentano il rapporto di ΔI ami misurata dopo 5, 30, o 60 min di incubazione (ΔI ami min) a quella iniziale ΔI ami (ΔI ami iniziale) misurata prima dell&#39;incubazione. Ogni punto rappresenta la media ΔI ami misurata in 22-24 oociti individuali di quattro gruppi differenti. (BD) Parallelamente alla rilevazione di ΔI ami, espressione di γENaC biotinilato alla superficie cellulare è stata analizzata mediante SDS-PAGE. γENaC stato rilevato con un anticorpo contro un epitopo nel C-terminale della γENaC umana. Sono mostrati western blot rappresentativi di un lotto di ovociti. (CE) analisi densitometrica dei tre western blot simili a quelli mostrati in B o D. Per ogni corsia, le signals rilevati nelle regioni di 76 kD (colonne aperte) e 67 kD (colonne grigie) sono stati determinati e normalizzato alla somma totale del segnale rilevato. N indica il numero di diversi lotti di oociti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

L&#39;attivazione proteolitica del canale epiteliale del sodio (ENaC) eterologhi espressi in oociti di Xenopus laevis sono evidenziabili combinando misure di corrente con un approccio biotinylation per indagare la comparsa di prodotti di scissione del canale ionico sulla superficie cellulare. Funzionalmente importanti siti di taglio possono essere identificati usando mutagenesi sito-diretta.

Dimostrazione di Proteolytic attivazione della epiteliale di sodio Channel (ENAC), combinando misure di corrente con rilevamento di Decolleté Frammenti

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

12.8K Views.  Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU).  L'attivazione proteolitica del canale epiteliale del sodio (ENaC) eterologhi espressi in oociti di Xenopus laevis sono evidenziabili combinando misure di corrente con un approccio biotinylation per indagare la comparsa di prodotti di scissione del canale ionico sulla superficie cellulare. Funzionalmente importanti siti di taglio possono essere identificati usando mutagenesi sito-diretta. 

Video: Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel ENaC by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis. In some women the severe episodes of cyclic pain change and the resultant pain becomes continuous and this condition becomes known as Chronic Pelvic Pain. This state can be present even after the appropriate medical or surgical therapy has been instituted. It can be associated with pain and tenderness in the muscles of the abdomen wall and intra-pelvic muscles leading to severe dyspareunia. Additional symptoms of irritable bowel and interstitial cystitis are common. A common sign of the development of this state is the emergence of cutaneous allodynia which emerges from the so-called viscero-somatic reflex. A simple bedside test for the presence of cutaneous allodynia is presented that does not require excessive time or special equipment. This test builds on previous work associated with changes in sensation related to gall bladder function and the viscera-somatic reflex(1;2).
The test is undertaken with the subject s permission after an explanation of how the test will be performed. Allodynia refers to a condition in which a stimulus that is not normally painful is interpreted by the subject as painful. In this instance the light touch associated with a cotton-tipped applicator would not be expected to be painful. A positive test is however noted by the woman as suddenly painful or suddenly sharp. The patterns of this sensation are usually in a discrete pattern of a dermatome of the nerves that innervate the pelvis.
The underlying pathology is now interpreted as evidence of neuroplasticity as a consequence of severe and repeating pain with changes in the functions of the dorsal horns of the spinal cord that results in altered function of visceral tissues and resultant somatic symptoms(3). 
The importance of recognizing the condition lies in an awareness that this process may present coincidentally with the initiating condition or after it has been treated. It also permits the clinician to evaluate the situation from the perspective that alternative explanations for the pain may be present that may not require additional surgery.

Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain

A demonstration of the bedside test for cutaneous allodynia and its clinical implications.

Dimostrazione di Allodinia cutanea In associazione con dolore pelvico cronico

Pelvic pain is a common condition that is associated with dysmenorrhea and endometriosis.  In some women the severe episodes of cyclic pain change and the ...

Ricerca

Biologia

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Dimostrazione di Proteolytic attivazione della epiteliale di sodio Channel (ENAC), combinando misure di corrente con rilevamento di Decolleté Frammenti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Dimostrazione di Allodinia cutanea In associazione con dolore pelvico cronico

Rilevamento di proteine Ubiquitinazione

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C

Isolamento di cromatina Purificazione RNA (disturbo)

Elettroforesi su gel agarosio per la separazione di frammenti di DNA

Singola molecola di imaging del regolamento Gene

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Misure calcio citosolico nelle cellule epiteliali renali mediante citometria di flusso

Dimostrazione di Proteolytic attivazione della epiteliale di sodio Channel (ENAC), combinando misure di corrente con rilevamento di Decolleté Frammenti

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Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

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Rilevamento di proteine Ubiquitinazione