אנו מודים ליאוני דה בור והבס Zaat (מרכז רפואי אקדמי) שספק לנו ש &#39; זן epidermidis O-47. אנו מודים לריקו Bongaarts, פרנסיס סמט ואנג&#39;לה Comas (איחוד Biometrica) לעזרה וייעוץ עם XL Copas וניתוח BioImager עצום. אנו מודים לדייוי דה ויט, אולריקה Nehrdich, ולורה ואן הולסט למטפל דגים, ועמיתים אחרים מאוניברסיטת ליידן לדיונים מועילים. מחקר זה מהווה חלק מפרויקט P5.03 IBIZA של תכנית המחקר של המכון ביו חומרים, שיתוף במימון המשרד ההולנדי לענייני כלכלה, ושל התכנית החכמה המיקס (NWOA_6QY9BM) של המשרד ההולנדי לענייני כלכלה ושל משרד הולנד חינוך, תרבות והמדע. תמיכה נוספות התקבלה מהפרויקט של האיחוד האירופי ZF-בריאות (FP7-בריאות 2009-242,048), וRMJ נתמכה על ידי מלגת מארי קירי כחוקר מנוסה באיחוד האירופי ההדרכה הרשת FishForPharma (PITN-GA-201 הראשוני1-289,209). SJR זכה למימון של תרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות חדשנית תחת n הסכם מענק ° 115337, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA במחברי contribution.The סוג להכיר נוסף תמיכה כספית מקרן אוניברסיטת ליידן (LUF) לרובוטיקה ומCyttron, בסבסוד תכנית Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, אשר בתורו נתמך כלכלית על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי למתקני הדמיה. רכישת מערכת Copas נתמכה באופן חלקי על ידי האגף לכדור הארץ ומדעי חיים (alw) עם סיוע כספי מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO, 834.10.004).

1. זני חיידקים ותנאי גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ס epidermidis הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה מושבות בודדות מס O-47 מתח epidermidis, המכיל pWVW189 נגזר וקטור mCherry ביטוי (דה בור ל &#39;לא פורסם) מBertani לוריא (LB) צלחת אגר בתוספת 10 מיקרוגרם / כלורמפניקול ותרבות מיליליטר הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס ב25 מיליליטר מדיום LB בתוספת 10 כלורמפניקול מיקרוגרם / מיליליטר לmidlog במה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות ב12,000 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם מי מלח 1 מיליליטר סטרילי פוספט (PBS) עם 0.3% (v / v) Tween-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600), ולדלל את ההשעיה החיידקים לOD 600 של 0.3 ב2% (w / v) polyvinylpyrrolidone 40 (PvP 40) ב-PBS. הערה: OD 600 של 0.3 מקבילה 1.0 x 10 8 מושבה להרכיב יחידות / מיליליטר (CFU / מיליליטר). </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ &#39; marinum הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה מושבות בודדות ממ &#39; M זן marinum או E11 המכיל את וקטור pSMT3-mCherry יציבות להביע mCherry 10 מצלחת אגר מידלברוק 7H10 עם 10% (v / v) העשרת מידלברוק OADC תוספת 50 מיקרוגרם עם / מיליליטר hygromycin ותרבות לילה על 28 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של מרק מידלברוק 7H9 עם 10% (v / v) העשרת מידלברוק ADC בתוספת hygromycin 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות ב12,000 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו 3x עם 1 מיליליטר סטרילי PBS עם 0.3% (v / v) Tween-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600, ולדלל את ההשעיה החיידקים לOD 600 של 0.3 ב2% PvP (w / v) 40 ב-PBS. הערה: OD 600 של 1 מקבילה x ל1.0 10 8 CFU / מיליליטר. </li></ol></li></ol> 2. הכן את דג הזברה ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מרבי של 70 זכר ו50 ty הפראי הנשיpe דג הזברה בנפרד לתוך כלי גידול הגדול. הערה: הנח את נקבת הדג בחלקו התחתון של כלי גידול הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המפריד למחרת בבוקר, כדי לאפשר לדג הזברה להתחיל רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים בחלק התחתון של כלי הרבייה הגדול באמצעות אספן הביצה בצינור 50 מיליליטר מלא במי ביצה (60 מיקרוגרם / מלח ים אוקיינוס ​​מיידי מיליליטר). </li></ol> 3. מחטי הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מחטים זמינות מסחרי מחוייט נימי זכוכית עם קוטר פנימי של 10 מיקרומטר. </li></ol> 4. מתאר ניסיוני של הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים של 1% 100 מיליליטר (w / v) agarose במי ביצה, וקריר עד כ 40 º C. יוצקים agarose לתוך צלחת microinjectors האוטומטית ולמקם את חותמת 1,024 היטב לתוך agarose. הערה: הצלחת מוכנה לשימוש כאשר התקררו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלחיצה האוטומטית microinjector ההפעלה תוכנה על &#39;כיול שלב&#39;,לאחר מכן לחץ על הרשת גם &#39;&#39;1024 ומניח את צלחת agarose בmicroinjector ולכייל את הצלחת על ידי לחיצה על המסך במיקום מרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &#39;תפריט מחט&#39; ולחץ על &quot;בעל מחט לכייל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מחט הזריקה באמצעות קצה microloader עם או PvP μl 10 40 המכיל ס 100 CFU / NL epidermidis או 30 CFU / מ NL marinum, או שימוש PvP 40 כמו הזרקה מדומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט במייקרו ההזרקה האוטומטית ולכייל את x, y עמדה על ידי הפחתה או הזזת המחט והלחיצה על המסך במיקום של המחט. ואז לכייל את עמדת z של המחט על ידי לחיצה על המסך במיקום של קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את הביצים מעל רשת agarose באמצעות pipet העברת פלסטיק, ולהסיר מים ביצה עודפים. הנח את רשת agarose בmicroinjector האוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &#39;injectioתפריט n &#39;ולהתאים את&#39; לחץ הזרקה &#39;הגדרת 200 hPa, &quot;זמן הזרקה&quot; 0.2 שניות ו&#39;לחץ פיצויים 15 hPa, אשר עולה בקנה עם NL 1, בתפריט הגדרות Femtojet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;להזריק כל &#39;להזריק כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים לאחר הזרקה על ידי שטיפתם לתוך צלחת פטרי (92 x 16 מ&quot;מ), עם מקסימום של 70 עובר לכל צלחת פטרי, ולדגור על 28 ° C. </li></ol> 5. ניתוח זרימת cytometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את זרימת חלקיקים הגדולה cytometer על פי הוראות היצרן ולמלא את הכוס מדגם ומכל נוזל נדן עם מים ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת ההפעלה, ללכת לתפריט &quot;PMT &#39;ולהשתמש בהגדרות הבאות: 650 V עבור הערוץ&#39; האדום &#39;ו0 V עבור&#39; הירוק &#39;והערוצים&#39; הצהוב &#39;. ואז ללכת לתפריט &quot;הספים &#39;ולהשתמש בהגדרות הבאות:&#39; אופטיקהצפיפות l &#39;אות סף: 975 mV (ערך Copas XL: 50) ו&#39;זמן מעוף של&#39; מינימום (TOF) ל320 μsec (ערך Copas XL: 800) על מנת לצמצם את ההשפעה של פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ללא מיון העוברים עבור לשלב 5.4, לניתוח ומיון העוברים לתוך צלחת פטרי עבור לשלב 5.5 או לצורך הניתוח ומיון העוברים לתוך צלחת 96 היטב עבור לשלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולחץ על &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את הניתוח. כאשר כל העוברים מנותחים לעצור את הניתוח על ידי לחיצה על &#39;עצור&#39;. לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על &#39;חנות כל&#39;. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולהגדיר את המקסימום של 70 עובר לכל צלחת להיות מסודרת על ידי הזנת 70 בתפריט &#39;מיון&#39;. מניחים צלחת פטרי ריקה מתחת לסדרן ולחץ על &quot;מיין ידני &#39;. כאשר די פטרי<html> sh מלא, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על &#39;חנות כל&#39;. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולהגדיר את המקסימום של עובר 1 לכל גם להיות מסודרת על ידי הזנת 1 בתפריט &#39;מיון&#39;. מניחים צלחת 96 היטב ריקה לבעל צלחת השמאל ולחץ על &quot;מלא את הצלחת&quot;. כאשר צלחת 96 היטב מלאה, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על &#39;חנות כל&#39;. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את קובץ TXT כדי לעבד את הנתונים הגולמיים, להשתמש בהגדרות סינון הנתונים הבאות: &#39;מצב בחר&#39;: 40, ואם שימוש במודול מהסוג &quot;סוג הסטטוס &#39;:. 6 ואז להשתמש במספרים מסך הכל אות הקרינה מ&#39;האדום &#39;ערוץ כדי לחשב את הממוצע וסטיית ההתקן של הממוצע. עלילה ערכות נתונים אלה לתוך גרף עמודות או פיזור. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. טיפול התרופתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח והודעה מסוג ב 3 ימי הזרקה (dpi), מ &#39; marinum נגוע עוברים בשתי קבוצות שווה שימוש בחלקיקים הגדולים cytometer זרימה (שלב 5.5). טיפול בקבוצה אחת עם תרכובת של עניין בממס המוביל שלה ואחרת עם ספק ממס לבד (שליטה). החל טיפולים דומים ללעוג שליטה הזריק לבדיקה לתופעות לוואי של אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 4 ו -5 dpi הניתוח (שלב 5.5) ולרענן את המים ביצה או מים ביצה המכילים את התרכובת. </li></ol> 7. הדמיה ברזולוציה גבוהה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי את העוברים עם 0.02% (w / v) שנאגרו אסתר 3-aminobenzoic אתיל החומצה (Tricaine) במי ביצה 10 דקות לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת טכנולוגיית הקרנת חוליות אוטומטית וסמפלר החלקיקים גדול פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תמונות ההתייחסות המתאימות לגיל של העוברים מ&#39;הדמיה - האובייקט211; תפריט הגדרות איתור &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את כמות תמונות וכיוון שבוצע במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית מ&#39;הדמיה - תמונות חנות אוטומטית &#39;בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת 96 היטב מלא בעוברים (משלב 5.6) לבעל הצלחת השמאלי של החלקיקים הדגם גדול, ולחץ על &quot;צלחת הפעל &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עובר הוא זוהה כראוי ומיקומו; תמונת הראש והזנב בנפרד עם CLSM באמצעות מטרה רגילות יבשה 10X ולתפור את התמונות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li><li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages.">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li><li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection.">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li><li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+infection:+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface.">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li><li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1.">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li><li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS הוא הבעלים של מדעי החיים שיטות BV שמייצר מכשירים המשמשים במאמר זה.

המתודולוגיה התפוקה הגבוהה שתוארה במאמר זה מספקת צינור יעיל מהיר ועלות למסך מספר גבוה של עוברי דגים וזחלים עם סוגים שונים של זיהומים. שימוש בכלי הגידול הגדול במקום טנקי גידול בודדים או משפחה מסורתיים הקל על שליטה בתהליך ההשרצה ודור של מספר גדול יותר של ביצי סינכרוני. עם גרסה משופרת של מערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית 7, ניתן להזריק עד 2,500 ביצים כמעט כולם באותו שלב התאים בתוך שעה 1. עם עדכונים אלה ותוכנה משופרת זה אפשרי להזריק יותר ביצים מאשר היה אפשרי בעבר שבו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי סמים גדולים עם התפשטות חיידקים כהקריאו. אולם שיטה זו עדיין מוגבלת לחלמון הזרקה, מסלולי הזרקה אחרים לדוגמא שתוארו על ידי ברנארד ואח&#39;. (2012) 6, יהיו בתקווה להיות משולבים במערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית בעתיד הקרוב. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; למרות שהשיטות אלה השוותה להקרנת דג הזברה, שזה יהיה שימושי עבור יישומים עם מיני דגים אחרים גם כן. לדוגמא, קרפיון הנפוץ כבר ציין שיש יתרונות למסכים בסמים. כמו דג הזברה, ביצים ועוברים בשלב מוקדם מקרפיון הנפוץ הם שקופות, אבל עם היתרון העיקרי של גודל שרצים הגדול של מאה אלפי ביצים ואת הזמינות של קווים טהורים המציעים רקע גנטי קבוע יותר 16. הניתוח של כמויות גדולות של עוברים נגועים נעשה עם זרם חלקיקים גדול תפוקה הגבוהה cytometer. מכשיר זה יכול למיין ניתח עוברים לתוך צלחות גם רב או צלחת פטרי שהופך אותו מתאים במיוחד לבדיקת מספרים גדולים של תרכובות. אם יש צורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, מאשר ההתקנה מותאמת באופן שזרימת חלקיקים הגדול cytometer הטכנולוגיה יכולה לשמש לטרום הקרנה ולאחר מכן לנתח את הדגימות במדיום שדרךלשים ברזולוציה גבוהה יותר. ניתן לעשות זאת באמצעות הטכנולוגיה חוליות אוטומטי הקרנת 17, 18. מכשיר זה יכול באופן אוטומטי לאסוף עובר חי או קבוע בין הודעה 2 ו -7 ימי הפריה מצלחת רב גם מיכל או בתפזורת, תמונה 360 ° דרך נימים באמצעות CLSM או מיקרוסקופ סטריאו ולהשליך שוב ב2 מכולות בתפזורת המאפשרות מיון ידני של העוברים מבוססים על התמונות מיקרוסקופיות. שיפורים עתידיים יאפשר המיון של העובר לאחר ההדמיה לתוך הצלחת גם רב, ולכן מה שמאפשר למסך באופן אוטומטי מספר הגדול של עוברים בודדים לאורך זמן עם CLSM. בהנחה שביישומים עתידיים במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית יכולה גם להיות מחוברת לזרימה הגדולה של חלקיקי cytometer הטכנולוגיה ללא הצורך של זחלים מחלק לפני לתוך צלחות גם רב, יוביל למיון מתקדם יותר. מאמר זה מתאר את הקמתהאופטימיזציה של ד של התקנת תפוקה גבוהה ללמוד ס epidermidis ומ &#39; זיהום marinum כמודל לגילוי סמים. זה מוכיח שהתוצאה של חיידקים אלו מוזרקים לתוך החלמון תלוי בשלב ההתפתחותי של הביצים בזמן הזרקה. הזרקה מ &#39; marinum E11 בשלב תא 16-128 או זן M בשלב תא 16-64 מוביל לאותו דפוס הזיהום כזריקת הזנב וריד 2, 6. עם זאת הגדרה זו אינה מוגבלת להתפשטות של חיידקים פתוגנים בלבד. היא הוצגה לפני שניתן להזריק רובוט פתרונות המכילים DNA, RNA או morpholinos לtransgenesis, מחקרים על ביטוי גנים ולדפוק למטה, בהתאמה 13. יתר על כן, זה היה הראה כי התקנה זו היא גם שימושית לחקר התפשטות תאי הסרטן והגירה. לכן צינור זה מציג שיטה תכליתית למסכי תפוקה גבוהה של מגוון רחב של מנגנוני איתות בהקשרשל חסינות מולדת, הוחל למחלות זיהומיות והתפתחות הסרטן. ניתן לשלב במסכים אלה עם אחרים לגילוי תרופה אבל גם עם ניתוח של השפעות רעילות אפשריות של תרופות החלים מזוהות.

עד כה דג הזברה (Danio rerio) כבר נקבע בהצלחה כמודל יעיל ללמוד מגוון רחב של מחלות זיהומיות 1. עובר דג הזברה מציע ייחודי באפשרויות ההדמיה vivo בשל השקיפות והמספר הגדול של קווי כתב מהונדסים קיימים לבטא חלבוני ניאון שלהם. שילוב רב עוצמה זה מאפשר לעקוב אחר סוגי תאים חיסוניים שונים בזמן תוך אינטראקציה עם גורמי מחלה כגון Mycobacterium marinum, יחסית הקרובים ביותר של מ &#39; שחפת 2, או סטפילוקוקוס epidermidis, סיבתי העיקרית לזיהום קשור ביולוגי 3-5. מסלולים שונים של זיהום ניתן להשתמש בעוברי דג הזברה בהתאם למטרות של המחקר 6. אחד ממסלולי זיהום אלה הוא הזרקת חלמון של החיידקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בהשוואה לאחרים הוא שinfecti החלמוןיכול להתבצע באופן אוטומטי באמצעות הזרקה רובוטית, צמצום משמעותי של זמן ההזרקה ומאפשר שחזור גבוה של הזיהום 7, 8. עבודה קודמת, תוך שימוש בדג הזברה כתפוקה גבוהה במערכת מודל vivo ללימוד ס epidermidis ומ &#39; זיהום marinum הראה כדי להצליח 7, 8. מערכת זו היא מסוגלת להקרין להתקדמות מחלה באמצעות הזרקה רובוטית חלמון של עוברים מוקדמים ושימוש בקריאת נתוני הקרינה כאמצעי לעומס החיידקים. בהסכם עם הרעיון הזה, התקנה זה כבר מותאם והקימה צינור תפוקה גבוהה יעיל ביותר עם הפוטנציאל ליצירת מספר גדול של עוברים נגועים homogenously ולעקוב אחר ההתקדמות של הזיהום במהלך הזמן לאחר טיפול עם מספר רב של תרכובות. עם ההתקנה הוקמה זה אפשרי לייצר עד 8,000 עוברי סינכרוני למסךלהתקדמות מחלה, עיבוד בדרך עד 2,500 עוברים לשעה זו. עוברים מסודרים מבוססים על עומס החיידקים שלהם באמצעות מערכת אוטומטית, מה שמבטיח קבוצות הומוגניות של זחלים נגועים. יתר על כן, כדי לאמת את ההתקנה, השפעות של התייחסות הידועה כדי למנוע את התקדמות מחלת השחפת ביונקים נבדקו על עוברים נגועים במ &#39; זן marinum E11 או זן M הארסי יותר 9. מחקר זה מתאר בפירוט את צינור התפוקה הגבוה שהוקם כדי להיות מסוגל לייצר מספר גדול של עוברים נגועים וניתוח בדיעבד של התקדמות החיידקים במהלך פיתוח ולאחר טיפול מתחם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

דג הזברה הופך כלי רב ערך בשלב קליני של הקרנות גילוי סמים כמודל חיה שלמה עם אפשרויות הקרנת תפוקה גבוהה. הם יכולים לשמש כדי לגשר על הפער בין מבחני תא מבוסס בשלבים מוקדמים יותר ובאימות vivo במודלים של יונקים, צמצום, בדרך זו, מספר התרכובות שעברו לבדיקות במודלים של מכרסמים הרבה יותר יקר. לאור זאת, בכתב היד הנוכחי מתואר צינור תפוקה גבוהה חדש באמצעות דג הזברה כמערכת מודל בvivo לחקר Staphylococcus epidermidis וזיהום marinum Mycobacterium. הגדרה זו מאפשרת לדור והניתוח של מספר הגדול של עוברי סינכרוני נגוע homogenously. יתר על כן הגמישות של הצינור מאפשרת למשתמש ליישם פלטפורמות אחרות כדי לשפר את הרזולוציה של הניתוח בעת הצורך בקלות. שילוב של דג הזברה יחד עם te תפוקה גבוה החדשניchnologies פותח את תחום בדיקות סמים וגילוי לאפשרויות חדשות לא רק בגלל כוחו של שימוש במודל של בעלי חיים כולו, אלא גם בגלל המספר הגדול של קווים זמינים מהונדסים שניתן להשתמש בם כדי לפענח את אופן פעולה של תרכובות חדשות.

התוצאות הנוכחיות מראות כי צינור העברת נתונים הגבוה ללימודי ס epidermidis ומ &#39; זיהום marinum כבר נקבע בהצלחה ושניתן להארכה לדגמי זיהום אחרים. ראשית, השימוש בכלי הגדול רבייה (איור 1 א), המבוסס על המערכת שפורסמה על ידי אדטו et al. (2011) 11, מאפשר לייצר כמויות גדולות של ביצי סינכרוני באירועים בודדים והנותן שליטה גבוהה של תהליך ההשרצה. הבא כדי להיות מסוגל להזריק מספר גדול של עוברים בתקופה קצרה של זמן, גרסה משופרת של המערכת שפותחה בעבר מיקרו ההזרקה האוטומטית 7 הייתה בשימוש (איור 1 א). כדי להעריך שהיא שלב התפתחותי הטוב ביותר לזיהום חלמון, הזריקות עם ס &#39; epidermidis ומ &#39; marinum בוצע בכל השלבים השונים בין שלב תא 1 ו512, על פי התיאור שנעשה על ידי קימל et al. (1995) 12 </sup&gt;. זריקות עם 100 CFU ס epidermidis בין שלב 16 ו128 תא סיפק את דפוס הזיהום הטוב ביותר (איור 2). החיידקים התרבו בתוך החלמון במשך 3 ימים והתפשטו לתוך הגוף מ3 dpi ואילך. ביצוע זריקות לפני שלב 16 התא הוביל לתמותה גבוהה מ4 dpi, והזרקה לאחר שלב תא 256 הראה צמיחה בעיקר חיידקים בתוך החלמון עם כמעט כל חיידקים מתפשטים בתוך הגוף של העובר. כימות של נטל חיידקים בוצעה על ידי ניתוח עוצמת הקרינה באמצעות החלקיקים הגדולים cytometer זרימה כפי שתוארו על ידי ונמן et al. 8 (איור 3) (2013). תצפיות הראו כי שלב ההתפתחות האופטימלי לזריקה של 30 מ &#39;CFU הזרקת marinum היא בין 16-128 שלב תא למתח E11 (איור 4 א) ובין שלב תא 16-64 עם strai M האלים יותרn (איור 4). עוברים מוזרקים בשלבים אלה הראו התפתחות חיידקים בתוך החלמון והתפשטות החיידקים דרך העובר (איור 7). הידבקות בשני הזנים בשלבים מוקדמים יותר הציגה צמיחת חיידקים כללית ספציפיות מובילה את העוברים למות אחרי 4 dpi. מצד השני, בעוברים שהוחדרו בשלבים מאוחר יותר נטל חיידקים הוגבל לחלמון. בשלב הבא, presorting עם חלקיקים גדולים cytometer זרימה (איור 1) שנוצר קבוצות הומוגניות גדולות של דגים נגועים לא כולל עוברים שאינם נגועים או גבוה (5A דמויות ו6A). לאחר presorting, מ &#39; טופלו עוברים נגועים marinum עם ריפאמפיצין, תרופה נגד שחפת השורה ראשונה. מחקרים קודמים הראו כי טיפול עם ריפאמפיצין במינון של 200 מיקרומטר ביעילות מפחית מ &#39; זיהום marinum בדג הזברה 7, 13. לקחת advantagדואר של המספר הגדול של עוברים נגועים homogenously שנוצרו עם קצב העברת נתונים הגבוה התקנה, הטיפול עם מינונים שונים בוצעו. עוברים נגועים במ &#39; זן marinum M והתייחס ל48 שעות עם 12, 24, ו200 מיקרומטר ריפאמפיצין הראו כדי להפחית את הזיהום ביעילות mycobacterial באופן תלוי מינון (איור 5). לאור ההפחתה היעילה של הזיהום באמצעות ריפאמפיצין במינון של 200 מיקרומטר ריכוז זה שימש לניסויים העתידיים. בקנה אחד עם התוצאה הקודמת, לומד התקדמות נטל חיידקים באמצעות מ &#39; זן marinum E11 שעה הפחתת 24 משמעותית ואילך לאחר טיפול עם 200 מיקרומטר ריפאמפיצין נצפה (איור 6). יתר על כן, אם נדרש הדמיה בהגדלה גבוהה של עוברים אלה, הם יכולים להיות מוצג באופן אוטומטי בלוחות 96 היטב (איור 1 ג), ממקום שבי ניתן לנתח הדגימות באמצעותמערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית עם החלקיקים הדגם גדול רכוב על גבי CLSM. מערכת הטכנולוגיה הקרנת החוליות אוטומטית עם סמפלר החלקיקים גדול היא מערכת שיכול להיות מותקן על גבי CLSM או מיקרוסקופ סטריאו. מכשיר זה מאפשר הטעינה של עובר לחיות או קבוע מצלחת 96 היטב או מיכל בתפזורת באופן אוטומטי דרך נימי זכוכית, וorientates את זה מול המצלמה בזווית הרצויה (למשל, גב או לרוחב). תמונות של העובר בכל האוריינטציות יכולות להתבצע עם המצלמה הלוח או עם CLSM חיצוני (איור 7). עוברים יהיו בהמשך הועברו במכלים המיוחדים לאיסוף או פסולת. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> איור 1. Outl ניסיוני הרגילהine. א) דגים בוגרים הם ביחד להזדווג, ביצים נאספות, מיושרת לתוך צלחת agarose ומוזרקת. ב &#39;) הביצים מוזרקות מודגרת על 28 מעלות צלזיוס ותהיה מראש מסודרים לטיפול תרופתי אפשרי. ג) ניתוח לאחר על ידי גדול חלקיקים לזרום cytometer ו / או דגם / חוליות טכנולוגיה חלקיקים גדולות אוטומטית הקרנה עם CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> איור 2. הקמת שלב התא הטוב ביותר עבור ס epidermidis חלמון הזרקה. עוברי דג הזברה הוזרקו בחלמון בשלבי התפתחותיים שונים 1-512 שלב תא עימו של ס &#39;100 CFU epidermidis. עוברים מוזרק בין 1nd 8 שלב תא הראה התפתחות חיידקים בחלמון ותמותה גבוהה מ4 dpi. עוברים מוזרק בין 16 ו128 שלב תא הראה התפתחות חיידקים בחלמון ובתוך הגוף החל מהשעה 3 dpi. עוברים מוזרק בין שלב 256 ו512 תא הראה הרבה התפתחות חיידקים בתוך החלמון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> איור 3. כימות של נטל חיידקים באמצעות זרימת חלקיקים גדולה cytometer. 100 של ס &#39;CFU epidermidis הוזרק לתוך החלמון של עוברי דג הזברה.) עד 5 dpi, בכל יום, קבוצות של 10 עוברים היו הומוגני ומצופים באופן ישיר, המציגות את הצמיחה המעריכית הממוצעת מבוססת על שני העתקים ביולוגיים (ברים שגיאה= SEM). ב &#39;) זרימת חלקיקים גדולה cytometer הניתוח מראה אותות הקרינה הממוצע מאינם מוזרק וס epidermidis הזריק עוברים. 30-160 עובר לכל מצב נותחו (סורגי שגיאה = SEM), אותיות שונות מצביעים על הבדלים משמעותיים סטטיסטיים בדרך אחד ANOVA ואחרי הבדיקה של Tukey שלאחר מעשה (P &lt;0.001), NS: מתאם לא הבדלים משמעותיים C) בין CFU ו. אות הקרינה ממוצעת של קבוצות של 10 ס epidermidis נגוע עוברים (ברים שגיאה = SEM). נתון זה שונה מנמן et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> איור 4. Establishment של שלב התא הטוב ביותר עבור מ &#39; marinum חלמון הזרקה. עוברי דג הזברה הוזרקו בכל שלבי ההתפתחות השונים 1-512 שלב תא עם 30 CFU של מ &#39; marinum E11 ומתח M., B) עוברים מוזרק משלב תא 1-8 הראו דומה מתפשט ותמותה עם שני הזנים.) עוברים מוזרקת בין שלב תא 16-128 עם זן E11 הראה היווצרות של גרנולומות וזיהום מערכתי תוך הזריקו אלה 256-512 שלב תא המשיך נטל חיידקים לתוך החלמון. ב &#39;) עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם זן M הראה היווצרות גרנולומה כמו מבנים וזיהום מערכתי ואילו אלה שהוחדרו מ128 לשלב תא 512 המשיכו נטל חיידקים לתוך החלמון . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; src איור 5. טיפול של מ &#39; זיהום חריף marinum עם תרופה נגד שחפת קו ראשון. עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם 30 CFU של מ &#39; זן marinum M היה לרוץ דרך החלקיקים הגדולים לזרום cytometer ב3 dpi להיות מסודר בשתי קבוצות לאחר השלכת שאינה ו / או העוברים נגועים מאוד.) הקרינה של עוברי אדם בשני הקבוצות. עוברי B) שטופלו עם ריפאמפיצין (RIF ) ל48 שעות במינונים של 12, 24, ו200 מיקרומטר נותח ב 4 dpi; עומס החיידקים שלהם מצטמצם באופן משמעותי. C) פרופילי נציג Copas של עוברי מטופלים עם DMSO וריפאמפיצין במינונים של 12, 24, ו200 מיקרומטר ל24 שעות. עומס והפצת חיידקים מצויינים על ידי הפסגות האדומות. קו כחול מייצג את הפרופיל של האלמנט מסודרים (DPF 4 דואר דג הזברהmbryo) על ידי Copas. 60-90 עובר לכל מצב נותחו. כל נקודת נתונים מייצגת עובר בודד. ערכים הם ציינו ממוצע ± SEM. NS: הבדלים לא משמעותיים. ניתוח המובהקות סטטיסטיות של הבדלים בוצע על ידי דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן posthoc של Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> איור 6. טיפול של מ &#39; זיהום כרוני marinum עם תרופה נגד שחפת השורה ראשונה. עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם 30 CFU של מ &#39; זן marinum E11 היה לרוץ דרך זרימת חלקיקים הגדולה cytometer ב3 dpi להיות מסודר בשתי קבוצות לאחר השלכת העוברים נגועים מאוד לא ו / או.<html> א) הקרינה של עוברי אדם בשתי הקבוצות. ב &#39;) עוברים מטופלים עם ריפאמפיצין (RIF) ב200 מיקרומטר במהלך 4 ימים נותחו מראה הפחתה משמעותית של עומס החיידקים לאחר יום 1 של טיפול. 90 עובר לכל מצב נותחו. ערכים הם ציינו ממוצע ± SEM. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין נקודות של אותו הטיפול בזמן. * מצביע על הבדלים משמעותיים בקבוצת ביקורת. NS: הבדלים לא משמעותיים. ניתוח המובהקות סטטיסטיות של הבדלים בוצע על ידי דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן posthoc של Tukey. (P &lt;0.05). איור ב &#39;) שונה מSpaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Src =&quot; hres.jpg / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. תוצאה של מ &#39; הזרקת חלמון marinum E11 הדמיה באמצעות טכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית וCLSM. ערימת Confocal Z (תפרה 3 תמונות) של עובר 14 5 fli1-egfp dpi. התפשטות מראה עובר בשידור חי) של מ &#39; חיידקי marinum E11 (אדום) בכל גוף. B) עובר fli-egfp 5 dpi קבוע מראה M. חיידקי marinum E11 (אדום) בכל הגוף שיתוף לוקליזציה עם leucocytes (תכלת) זוהה על ידי L-plastin immunostaining 15.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discover

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

establishment-optimization-high-throughput-setup-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K Views.  Leiden University.  מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה. 

Video: Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

שימוש<em&gt; Mellonella Galleria</em&gt; כאורגניזם מודל לחקר<em&gt; הלגיונלה pneumophila</em&gt; זיהום

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

ניתוח של 18FDG PET/CT הדמיה ככלי לימודי שחפת Mycobacterium זיהום וטיפול פרימטים לא אנושית

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

מידול שחפת ב דג נגוע זברה בוגרת התחממות עולמית

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

דגם העכבר כדי להעריך מולדת התגובה החיסונית לזיהום Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...