Somos gratos a Leonie de Boer e Bas Zaat (Academic Medical Centre) para fornecer-nos com o S. epidermidis O-47 tensão. Agradecemos Rico Bongaarts, Francis Smet e Angela Comas (União Biométrica) para ajuda e conselhos com a COPAS XL e análise BioImager vasto. Agradecemos Davy de Witt, Ulrike Nehrdich e Laura van Hulst para guarda pescar, e outros colegas da Universidade de Leiden para discussões úteis. Esta pesquisa faz parte do Projeto P5.03 IBIZA do programa do BioMedical Materiais instituto, co-financiado pelo Ministério dos Assuntos Económicos holandês de pesquisa e do Programa Mix Inteligente (NWOA_6QY9BM) do Ministério dos Assuntos Económicos neerlandês e de O Ministério Holandês de Educação, Cultura e Ciência. Apoio adicional foi obtida a partir do projecto da UE ZF-Saúde (FP7-Saúde-2009-242048) e RMJ foi apoiado por bolsa Marie Curie como pesquisador experiente na Formação Inicial Rede FishForPharma (PITN-GA-201 UE1-289209). SJR recebeu financiamento da Medicamentos Inovadores empresa comum Iniciativa sob contrato de subvenção n ° 115337, os recursos dos quais são compostos de contribuição financeira do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) e empresas EFPIA em autores contribution.The amáveis ​​também reconhece apoio financeiro do Fundo Universidade de Leiden (LUF) para robótica e de Cyttron, no programa de Subsídios Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, que por sua vez é apoiado financeiramente pela Organização Holandesa para Pesquisa Científica para instalações de imagem. A aquisição do sistema COPAS foi parcialmente financiado pela Divisão de Ciências da Terra e da Vida (ALW) com ajuda financeira da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO, 834.10.004).

1. Estirpes bacterianas e condições de crescimento <ol><li> Prepare S. epidermidis inóculo <ol><li> Tome várias colônias individuais de S. epidermidis estirpe S-47, que contém um derivado pWVW189 mCherry vector de expressão (De Boer L. não publicados) a partir de um Luria Bertani (LB) placa de agar suplementado com 10 ug / ml de cloranfenicol e cultura durante a noite a 37 ° C em 25 ml de meio LB suplementado com 10 ug / ml de cloranfenicol a fase midlog. </li><li> Centrifugar 1 ml de cultura a 12000 xg durante 1 min e, subsequentemente, lavar 3x deles com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) com 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir a densidade óptica a 600 nm (OD 600), e dilui-se a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,3 a 2% (w / v), polivinilpirrolidona 40 (PVP 40) em PBS. Nota: Uma OD600 de 0,3 corresponde a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colónias / ml (UFC / ml). </li></ol&gt; </li><li> Prepare M. marinum inóculo <ol><li> Tome várias colônias individuais de M. marinum estirpe M ou E11 contendo o vector pSMT3-mCherry expressando estavelmente mCherry 10 a partir de uma placa de agar Middlebrook 7H10 com 10% (v / v) Middlebrook OADC enriquecimento suplementado com 50 ug / ml de higromicina e cultura durante a noite a 28 ° C em 10 ml de caldo Middlebrook 7H9 com 10% (v / v) suplemento Middlebrook ADC suplementado com 50 ug / ml de higromicina. </li><li> Centrifugar 1 ml de cultura a 12000 xg durante 1 min e, subsequentemente, lavar 3x com 1 ml de PBS estéril com 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir a OD 600, e dilui-se a suspensão bacteriana para uma DO 600 de 0,3 a 2% (w / v) de PVP 40 em PBS. Nota: Uma OD600 de 1 corresponde a 1,0 x 10 8 ufc / mL. </li></ol></li></ol> 2. Prepare Zebrafish Eggs <ol><li> Coloque um máximo de 70 do sexo masculino e 50 do sexo feminino ty selvagempe zebrafish separadamente para o grande navio de reprodução. Nota: Coloque o peixe fêmea na parte inferior do vaso grande de reprodução. </li><li> Retire o separador no dia seguinte, pela manhã, para deixar o peixe-zebra iniciar a reprodução. </li><li> Recolher os ovos na parte inferior do recipiente grande de reprodução através do colector de ovo em um tubo de 50 ml cheio com água do ovo (60 ug / ml de sal do mar do oceano instante). </li></ol> 3. Agulhas de injeção <ol><li> Obter comercialmente disponíveis à medida capilares de vidro agulhas com um diâmetro interno de 10 um. </li></ol> 4. Delineamento experimental de Injeção <ol><li> Ferva 100 ml de 1% (w / v) de agarose em água ovo e fresco até cerca de 40 º C. Despeje de agarose em placa de microinjetores automatizado e colocar a 1.024 bem selo na agarose. Nota: A placa está pronta para usar quando arrefecido. </li><li> Por software operacional clique microinjetor automatizado em &#39;Calibrar palco &quot;,em seguida, clique em &#39;1024 &#39;bem grade e colocar a placa de agarose no microinjetor e calibrar a placa clicando na tela na posição central do poço. </li><li> Ir para &#39;menu de agulha&#39; e clique em &#39;porta-agulhas calibrar&#39;. </li><li> Preencha a agulha de injeção usando uma dica microloader com 10 mL pvp 40 contendo 100 ufc / nl S. epidermidis ou 30 ufc / nl M. marinum ou uso pvp 40 como injeção simulada. </li><li> Coloque a agulha no micro-injector automático e calibrar a posição x, y, diminuindo ou mover a agulha para cima e clicando na tela na posição da agulha. Em seguida, calibrar a posição z da agulha clicando na tela na posição da ponta da agulha. </li><li> Distribua os ovos sobre a grade de agarose, utilizando uma pipeta de transferência de plástico e retire o excesso de água do ovo. Coloque a grade de agarose na microinjetor automatizado. </li><li> Vá para a &#39;injectioMenu n &#39;e ajustar a &quot;pressão de injeção&#39; definindo a 200 hPa,&quot; tempo de injeção &quot;0,2 seg e &#39;pressão Compensação&#39; 15 hPa, o que se correlaciona com um nl, no menu de configurações FemtoJet. </li><li> Clique em &#39;Injetar tudo&#39; para injetar toda a placa. </li><li> Recolher os ovos depois da injecção, lavando-as em placas de Petri (92 x 16 mm), com um máximo de 70 embriões por placa de Petri, e incuba-se a 28 ° C. </li></ol> 5. Análise de Fluxo-citômetro <ol><li> Prepare o grande fluxo de partículas citômetro de acordo com as instruções do fabricante e encher o copo de amostra e recipiente de fluido do invólucro com água de ovo. </li><li> No software operacional, vá ao menu &quot;PMT&quot; e use as seguintes configurações: 650 V para o canal &#39;Red&#39; e 0 V para o &quot;verde&quot; e os canais de &#39;amarelo&#39;. Em seguida, vá ao menu &quot;Limites&quot; e use as seguintes configurações: &#39;Optical densidade &quot;sinal limiar: 975 mV (valor COPAS XL: 50) eo&quot; Time of Flight &quot;(TOF) mínimo de 320 ms (valor COPAS XL: 800), a fim de reduzir a influência de detritos. </li><li> Para a análise, sem classificar os embriões vá para o passo 5.4, para análise e classificação dos embriões em uma placa de Petri vá para o passo 5.5 ou para análise e classificação dos embriões em uma placa de 96 poços vá para o passo 5.6. </li><li> Coloque os embriões no copo de amostra e clique em &#39;start&#39; para iniciar a análise. Quando se analisam todos os embriões parar a análise, clicando em &#39;stop&#39;. Salve os dados clicando em &#39;loja all&#39;. Nota: Todos os dados são armazenados como TXT, LMD, DAT, CSV e arquivos BSRT. Siga o protocolo no passo 5.7. </li><li> Coloque os embriões no copo de amostra e definir o máximo de 70 embriões por placa para ser resolvido inserindo 70 no menu &#39;Ordenar&#39;. Coloque um prato vazio Petri sob o classificador e clique em &#39;Ordenar Manual&#39;. Quando o di Petri<html> sh é preenchido, salvar os dados clicando em &#39;loja all&#39;. Nota: Todos os dados são armazenados como TXT, LMD, DAT, CSV e arquivos BSRT. Siga o protocolo no passo 5.7. </li><li> Coloque os embriões no copo de amostra e definir o máximo de 1 embrião por poço para ser resolvido inserindo 1 no menu &#39;Ordenar&#39;. Coloque um vazio placa de 96 poços no suporte da placa esquerda e clique em &#39;Preencher placa&#39;. Quando a placa de 96 poços está cheio, salvar os dados clicando em &#39;loja all&#39;. Nota: Todos os dados são armazenados como TXT, LMD, DAT, CSV e arquivos BSRT. Siga o protocolo no passo 5.7. </li><li> Obter o arquivo TXT para processar os dados brutos, use as seguintes configurações de filtro de dados: &#39;Status selecionar&#39;: 40, e se estiver usando o módulo de tipo &#39;tipo de Status&#39;:. 6 Em seguida, use os números do sinal total de fluorescência do &#39;Red &#39;canal para calcular a média e o erro padrão da média. Enredo esses conjuntos de dados em bar ou dispersão gráficos. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Tratamento Medicamentoso <ol><li> Analisar e injeção tipo em 3 dias após (dpi), M. marinum embriões infectados em dois grupos iguais usando o fluxo de partícula grande citômetro (passo 5.5). Tratar um grupo com um composto de interesse na sua solvente transportador e outro com veículo solvente sozinho (controlo). Aplicar tratamentos semelhantes para zombar controle injetado para testar os efeitos colaterais de antibióticos. </li><li> Repita a 4 e 5 de dpi a análise (passo 5.5) e refrescar a água de ovo ou água ovo contendo o composto. </li></ol> 7. Alta resolução de imagem <ol><li> Anestesiar os embriões com 0,02% (w / v) tamponada de éster etílico do ácido 3-aminobenzóico (tricaina) em água ovo 10 min, antes da análise. </li><li> Prepare o sistema de rastreio tecnologia automatizada de Vertebrados ea partícula grande amostrador de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Selecione as imagens de referência correspondente à idade dos embriões do &quot;Imaging - Objeto211; Menu de configuração de detecção ». </li><li> Selecione a quantidade de fotos e orientação a ser feita pelo sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados Automated do &quot;Imaging - loja Auto imagens &#39;menu. </li><li> Coloque uma placa de 96 poços cheios de embriões (a partir do passo 5.6) para o suporte da placa esquerda do Grande Particle Sampler, e clique em &#39;placa funcionar &quot;. </li><li> Quando um embrião é detectado e correctamente posicionado; imagem da cabeça e do rabo separadamente com o CLSM usando um 10X objetivo planície seca e costurar as imagens depois usando o software de processamento de imagem. </li></ol>

<ol>
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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. 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JS é proprietário de Life Science Métodos BV que produz instrumentos utilizados neste artigo.

A metodologia de alto rendimento descrito neste artigo fornece um pipeline eficaz rápido eo custo para a tela grande número de embriões e larvas de peixes com diferentes tipos de infecções. Usando o grande vaso de reprodução em vez de tanques tradicionais individuais ou familiares de reprodução facilitado o controlo do processo de reprodução e geração de um maior número de ovos síncronos. Com uma versão aperfeiçoada do sistema de micro-injecção automático 7, é possível injectar-se a 2.500 ovos quase todos na mesma fase de células dentro de uma hora. Com essas atualizações e software melhorado é viável para injetar mais ovos do que antes era possível, que podem ser utilizados para a realização de grandes telas de drogas com a proliferação de bactérias como a ler. No entanto, este método é ainda limitada a gema de injecção, outras vias de injecção, por exemplo, descritos por Benard et al. (2012) 6, venha a ser incorporado no sistema de micro-injeção automatizada em um futuro próximo. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Embora estes métodos são referenciados para a triagem de peixe-zebra, que seria útil para aplicações com outras espécies de peixes também. Por exemplo, a carpa comum foi indicado para ter vantagens para as telas de drogas. Como peixe-zebra, ovos e embriões em estágio inicial de carpa comum são transparentes, mas com a principal vantagem de seu grande tamanho desova de centenas de milhares de ovos e da disponibilidade de linhas puras, que oferecem uma base genética mais constante 16. A análise de grandes quantidades de embriões infectados é feito com a alta taxa de grande fluxo de partículas citómetro. Este dispositivo pode embriões espécie analisada em placas de cavidades múltiplas ou uma placa de Petri, tornando-o especialmente adequado para testar um grande número de compostos. Se for necessária uma resolução de imagem maior, do que a configuração é adaptado de maneira que o fluxo de partículas grande citómetro tecnologia pode ser utilizada para pré-triagem e posteriormente analisar as amostras de um meio atravéscolocar em uma resolução maior. Isso pode ser feito usando a tecnologia de Triagem de Vertebrados Automated 17, 18. Este dispositivo pode automaticamente coletar embriões vivos ou fixas, entre 2 e 7 dias após a fecundação de uma placa de multi bem ou contentor para granel, imagem 360 ° através de um capilar usando CLSM ou microscopia estéreo e dispor de novo em dois contentores para granel, permitindo triagem manual dos embriões com base nas imagens microscópicas. Futuras melhorias permitirão a classificação do embrião após imagiologia no poço da placa multi, portanto, tornando-se possível a tela automaticamente grande número de embriões individuais ao longo do tempo com CLSM. Supondo que, em aplicações futuras do sistema Tecnologia Triagem Vertebrados automatizada pode também ser ligado ao grande fluxo de partículas citómetro tecnologia, sem a necessidade de distribuição de larvas antes em placas de multi-poços, irá conduzir a uma classificação mais avançada. Este artigo descreve a um estabelecimentootimização d de uma configuração de alto rendimento para estudar S. epidermidis e M. infecção marinum como um modelo para a descoberta da droga. Isto demonstra que os resultados destas bactérias injectadas na gema depende do estágio de desenvolvimento dos ovos, no momento da injecção. Injetando M. marinum E11 em 16-128 estágio de célula ou a tensão M em 16-64 estágio de célula leva o mesmo padrão de infecção como a injeção veia caudal 2, 6. No entanto, esta configuração não está limitado a apenas a proliferação de bactérias patogénicas. Foi demonstrado anteriormente que é possível injectar roboticamente soluções contendo ADN, ARN ou morpholinos para transgénese, sobre-expressão e o gene knock-down estudos, respectivamente 13. Além disso, demonstrou-se que esta configuração é também útil para o estudo da proliferação de células cancerosas e a migração. Portanto, esta conduta apresenta um método versátil para telas de elevada capacidade de uma variedade de mecanismos de sinal no contextoda imunidade inata, aplicada a doenças infecciosas eo desenvolvimento de câncer. Estas telas podem ser combinados com outros para a descoberta de medicamentos, mas também com a análise de possíveis efeitos tóxicos de drogas aplicáveis ​​identificados.

Até à data, o peixe-zebra (Danio rerio) foi estabelecida com sucesso, como um modelo eficiente para estudar uma variedade de doenças infecciosas 1. O embrião de peixe-zebra oferece possibilidades de imagem única em vivo devido à sua transparência e ao grande número de linhas repórter transgênicas existentes que expressam proteínas fluorescentes. Esta poderosa combinação torna possível controlar diferentes tipos de células imunes no tempo, enquanto interagindo com patógenos, como Mycobacterium marinum, o parente mais próximo de M. tuberculose 2 ou Staphylococcus epidermidis, o principal causador do biomaterial associado infecção 3-5. Diferentes vias de infecção pode ser usado em embriões de peixe-zebra, dependendo dos propósitos do estudo 6. Uma dessas vias de infecção é gema de injecção das bactérias. A principal vantagem deste método em comparação com os outros é que infecti gemana pode ser realizada automaticamente através da injecção robótico, reduzindo significativamente o tempo de injecção e permitindo alta reprodutibilidade da infecção por 7, 8. Trabalhos anteriores utilizando o peixe-zebra como um elevado rendimento no sistema de modelo in vivo para o estudo de S. epidermidis e M. infecção marinum mostrou-se bem-sucedido 7, 8. Este sistema é capaz de seleccionar para a progressão da doença por meio de injecção de gema robótico de embriões precoces e usando fluorescência de leitura como uma medida para a carga bacteriana. De acordo com esta noção, esta configuração foi optimizado e estabelecido um gasoduto de alto rendimento altamente eficiente, com o potencial para gerar grandes números de embriões infectados de forma homogénea e rastrear a evolução da infecção, durante o tempo após o tratamento com uma série de compostos. Com a configuração estabelecida, é possível gerar até 8.000 embriões sincronizadas para a telapara a progressão da doença, o tratamento desta forma até 2.500 embriões por hora. Os embriões são classificados com base na sua carga bacteriana utilizando um sistema automatizado, assegurando grupos homogéneos de larvas infectadas. Além disso, para validar a configuração, efeitos de referência conhecidos para evitar a progressão da tuberculose em mamíferos foram testados em embriões infectados com M. marinum E11 tensão ou o mais virulento M tensão 9. Este estudo descreve em pormenor o elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida a ser capaz de gerar um grande número de embriões infectados e a subsequente análise da progressão bacteriana durante o desenvolvimento e depois de tratamento com o composto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Zebrafish estão se tornando uma ferramenta valiosa na fase pré-clínica de exames de descoberta de drogas como um modelo animal inteiro com possibilidades de rastreio de elevada capacidade. Eles podem ser usados ​​para fazer a ponte entre os ensaios baseados em células em fases anteriores e na validação in vivo em modelos de mamíferos, reduzindo, desta forma, o número de compostos que passam através de testes sobre os modelos de roedores muito mais caros. A esta luz, no presente manuscrito é descrito um novo gasoduto de alto rendimento utilizando zebrafish como in vivo sistema modelo para o estudo de Staphylococcus epidermidis e infecção Mycobacterium marinum. Esta configuração permite a geração e análise de grande número de embriões sincronizadas homogeneamente infectado. Além disso, a flexibilidade da conduta permite ao utilizador aplicar facilmente outras plataformas de melhorar a resolução da análise, quando necessário. A combinação do peixe-zebra com elevado rendimento te inovadorchnologies abre o campo de teste de drogas e para a descoberta de novas possibilidades não só por causa da força da utilização de um modelo animal, mas também devido ao grande número de linhas transgénicas disponíveis que podem ser usadas para decifrar o modo de acção dos novos compostos.

Os resultados deste estudo mostram que o gasoduto de transferência de alta para estudar S. epidermidis e M. infecção marinum foi estabelecida com sucesso e que pode ser estendida a outros modelos de infecção. Em primeiro lugar, o uso de um grande vaso de criação (Figura 1A), com base no sistema publicada por Adatto et al. (2011) 11, permite a geração de grandes números de ovos síncronos em eventos individuais que proporcionam um elevado controlo do processo de desova. Em seguida ser capaz de injectar grande número de embriões num curto período de tempo, foi utilizada uma versão melhorada do sistema automatizado anteriormente desenvolvido micro-injecção 7 (Figura 1A). Para avaliar qual é a melhor fase de desenvolvimento para a infecção gema, injeções com S. epidermidis e M. marinum foram realizadas em todas as diferentes fases de entre 1 e 512 fase celular, de acordo com a descrição feita por Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Injeções com 100 ufc S. epidermidis entre a fase 16 e 128 células, desde que o melhor padrão de infecção (Figura 2). As bactérias proliferam no interior da gema por 3 dias e se espalhou para o corpo a partir de 3 dpi em diante. Realizando injecções antes da etapa de 16 células conduziu à elevada taxa de mortalidade de 4 dpi, e depois da fase de injecção de células 256 apresentaram crescimento bacteriano, principalmente no interior da gema com quase todas as bactérias propagação no interior do corpo do embrião. Quantificação da carga bacteriana foi realizada por análise de intensidade de fluorescência usando o fluxo de partícula grande citómetro como descrito por Veneman et al. (2013) 8 (Figura 3). As observações mostraram que o estádio de desenvolvimento ideal para a injecção de 30 CFU M. injecção marinum é entre 16 a 128 fase da célula para a estirpe E11 (Figura 4A) e entre 16-64 fase célula com o M strai mais virulenton (Figura 4B). Os embriões injectados nestas fases mostrou o crescimento bacteriano dentro da gema e propagação das bactérias através do embrião (figura 7). A infecção com ambas as cepas em fases anteriores apresentaram crescimento bacteriano generalizada inespecífica levando os embriões a morrer depois de 4 dpi. Por outro lado, em embriões injectados em fases posteriores da carga bacteriana foi restrita à gema. Em seguida, pré-triagem com grande partícula citometria de fluxo (Figura 1B) gerou grandes grupos homogéneos de peixes infectados excluindo embriões não-ou altamente infectados (figuras 5A e 6A). Depois de pré-ordenação M. embriões infectados marinum foram tratados com rifampicina, um fármaco de primeira linha anti-tuberculose. Estudos anteriores demonstraram que o tratamento com rifampicina numa dose de 200 uM reduz eficientemente M. marinum infecção em peixes-zebra 7, 13. Tomando advantage do grande número de embriões homogeneamente infectadas gerados com o elevado rendimento de configuração, o tratamento com doses diferentes foi realizada. Os embriões infectados com M. M marinum estirpe e tratados durante 48 horas com 12, 24, e 200 uM Rifampicina mostrou reduzir a infecção por micobactérias eficiente de uma forma dependente da dose (Figura 5B). Tendo em vista a redução eficiente da infecção utilizando rifampicina numa dose de 200 uM esta concentração foi usada para as futuras experiências. Em linha com o resultado anterior, estudando progressão carga bacteriana usando M. marinum E11 tensão uma redução significativa de 24 horas em diante após o tratamento com 200 mM Rifampicina foi observado (Figura 6B). Além disso, se a imagem de alta ampliação é necessária destes embriões, podem ser exibidos automaticamente em placas de 96 poços (Figura 1C), a partir dos quais as amostras podem ser analisadas usandoo sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizado com o Grande Particle Sampler montado em um CLSM. O sistema de Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizado com o Grande Particle Sampler é um sistema que pode ser montado em um CLSM ou microscópio estéreo. Este dispositivo permite o carregamento de embriões vivos ou fixas a partir de uma placa de 96 poços ou recipiente de volume automaticamente por meio de um capilar de vidro, e orienta-o em frente da câmara para o ângulo desejado (por exemplo, dorsais ou laterais). Imagens do embrião em todas as orientações podem ser feitos com a câmara na placa ou com um CLSM externa (Figura 7). Os embriões serão posteriormente transferidos na coleção ou resíduos recipiente. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figura 1. Outl experimental Mainstreamine. A) peixes adultos são colocados juntos para acasalar, os ovos são recolhidos, alinhados em uma placa de agarose e injectado. B) Os ovos injectados são incubados a 28 ° C e irá ser pré-ordenada para possível tratamento da toxicodependência. C) A análise posterior por grande fluxo de partículas citômetro e / ou Grande Particle Sampler / Vertebrate Tecnologia Triagem Automatizada com CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figura 2. Estabelecimento de melhor estágio de célula para S. epidermidis gema injeção. embriões Zebrafish foram injetados na gema em diferentes estágios de desenvolvimento de 1 a 512 estágio de célula com 100 ufc de S. epidermidis. Embriões injetados entre 1 a8 ª etapa células apresentaram crescimento bacteriano na gema e elevada mortalidade de 4 dpi. Os embriões injectados entre 16 e 128 estágio celular mostraram crescimento bacteriano na gema e no interior do corpo a partir de 3 dpi. Embriões injetados entre fase 256 e 512 células mostraram muitos o crescimento bacteriano no interior da gema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figura 3. Quantificação da carga bacteriana usando o grande fluxo de partículas citômetro. 100 ufc de S. epidermidis foram injectadas na gema de embriões de peixes-zebra. D) até 5 dpi, cada dia, os grupos de 10 embriões foram homogeneizados e plaqueados directamente, mostrando o crescimento exponencial média, com base em duas réplicas biológicas (barras de erro= SEM). B) Grande fluxo de partículas citômetro análise mostra o sinal de fluorescência média de não-injetado e S. epidermidis injetado embriões. Foram analisados ​​30-160 embriões por condição (barras de erro = SEM), letras diferentes indicam diferença significativa pelo one way ANOVA seguido pelo teste de Tukey post-hoc (P &lt;0,001), ns:. Não diferenças significativas C) Correlação entre ufc e sinal de fluorescência média de 10 grupos de S. epidermidis infectado embriões (barras de erro = SEM). Este valor foi modificado a partir Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figura 4. Establishment da melhor fase da célula para M. marinum gema de injeção. embriões Zebrafish foram injetados em todos os diferentes estágios de desenvolvimento de 1 a 512 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum E11 e M tensão. A, B) Embriões injetados 1-8 estágio de célula mostrou semelhante espalhando e mortalidade com as duas cepas. A) Embriões injetados entre 16-128 estágio de célula com E11 cepa mostrou formação de granulomas e infecção sistêmica, enquanto aqueles injetados 256-512 estágio de célula mantida carga bacteriana na gema. B) Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com M cepa mostrou formação de granuloma como estruturas e infecção sistêmica, enquanto aqueles injetado 128-512 estágio de célula mantida carga bacteriana na gema . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo: Conteúdo-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Tratamento de M. infecção aguda marinum com uma primeira linha anti-tuberculose de drogas. Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum M tensão foram executados através da partícula grande citômetro de fluxo em 3 dpi a ser classificado em dois grupos após descartar os embriões não e / ou altamente infectadas. A) fluorescência de embriões individuais em ambos os grupos. B) Os embriões tratados com rifampicina (RIF ) durante 48 horas, em doses de 12, 24, e 200 ^ M foram analisados ​​em 4 dpi; a carga bacteriana é significativamente reduzida. C) Perfis COPAS representativos de embriões tratados com DMSO e rifampicina em doses de 12, 24, e 200 uM, durante 24 horas. Carga e distribuição de bactérias é indicada pelos picos vermelho. Linha azul representa o perfil do elemento classificado (4 dpf zebrafish embryo) pelos COPAS. Foram analisadas 60-90 embriões por condição. Cada ponto de dados representa um embrião individual. Os valores são indicados como média ± SEM. ns: diferenças não significativas. Análise de significância estatística das diferenças foi realizada por ANOVA seguido pelo teste de Tukey posthoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figura 6. Tratamento de M. infecção crônica marinum com uma primeira linha de drogas antituberculose. Embriões injetados entre 16-64 estágio de célula com 30 ufc de M. marinum E11 tensão foram executados através do grande fluxo de partículas citômetro de 3 dpi a ser classificado em dois grupos após descartar os embriões não e / ou altamente infectadas.<html> A) A fluorescência de embriões individuais, em ambos os grupos. B) Os embriões tratados com rifampicina (RIF) a 200 uM durante 4 dias foram analisadas, mostrando uma redução significativa da carga bacteriana após 1 dia de tratamento. Foram analisados ​​90 embriões por condição. Os valores são indicados como média ± SEM. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre pontos de tempo do mesmo tratamento. * Indica diferenças significativas com o grupo controle. ns: diferenças não significativas. Análise de significância estatística das diferenças foi realizada por ANOVA seguido por teste post hoc de Tukey. (P &lt;0,05). Figura B) tenha sido modificado a partir Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Resultado de M. marinum E11 injeção gema fotografada usando Tecnologia de Triagem de Vertebrados automatizada e CLSM. pilha Z confocal (costurado 3 imagens) de um 5 dpi FLI1-egfp 14 embrião. A) embrião vivo mostrando proliferação de M. bactérias marinum E11 (vermelho) em todo o corpo. B) Fixa 5 dpi fli-egfp embrião mostrando M. bactérias marinum E11 (vermelho) em todo o corpo co-localização com leucócitos (azul claro) detectada pelo L-plastin imunomarcação 15.

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

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