Name: establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery
Uploaded: 2014-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discover

Biz S. ile bize sağlamak için Leonie de Boer ve Bas Zaat (Academic Medical Centre) minnettarız epidermidis O-47 suşu. Biz COPAS XL ve GENİŞ BioImager analizi ile yardım ve tavsiye için Rico Bongaarts, Francis Smet ve Angela COMAS (Union Biometrica) teşekkür ederim. Biz balık kapıcılık ve yararlı tartışmalar için Leiden Üniversitesi&#39;nden diğer meslektaşları için Davy de Witt, Ulrike Nehrdich ve Laura van Hulst teşekkür ederim. Bu araştırma Biyomedikal Malzeme Enstitüsü, Ekonomik İşler Hollandalı Bakanlığı tarafından ortaklaşa finanse edilen araştırma programının Proje P5.03 IBIZA bölümünü oluşturur ve Ekonomik İşler Hollanda Bakanlığı Smart Mix Programı (NWOA_6QY9BM) ve bir Eğitim, Kültür ve Bilim Bakanlığı, Hollanda. Ek destek AB projesi ZF-Sağlık (FP7-Sağlık-2009-242048) elde edilmiştir, ve RMJ AB Başlangıç ​​Eğitim Ağı FishForPharma (PITN-GA-201 Tecrübeli Araştırıcı olarak Marie Curie bursu ile desteklenmiştir1-289209). SJR 115.337 ° hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Teşebbüsün fon aldı, kaynakların hangi Avrupa Birliği&#39;nin Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve tür contribution.The yazarların EFPIA şirketlerden daha fazla kabul mali katkı oluşmaktadır robotik için Leiden Üniversitesi Fonu (LUF) dan ve Cyttron gelen mali destek, sırayla mali görüntüleme tesisleri için Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü tarafından desteklenen Besluit Sübvansiyonlar Investeringen Kennisinfrastructuur programda. COPAS sistem edinimi kısmen Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO, 834.10.004) mali yardımı ile Dünya&#39;da ve Yaşam Bilimleri (ALW) için Bölümü tarafından desteklenmiştir.

1.. Bakteriyel türler ve Büyüme Koşullar <ol><li> S. hazırlayın epidermidis Aşı <ol><li> S. birkaç ayrı ayrı koloniler, alın epidermidis suşu O-47, bir pWVW189 içeren Luria Bertani (LB) 25 ml LB ortamı içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca 10 ug / ml kloramfenikol ve kültür ile takviye agar plaka ile takviye edilmiş ikinci MCherry ekspresyon vektörü (De Boer L. yayınlanmamış) türetilmiş aşama midlog için 10 ug / ml kloramfenikol. </li><li> 1 dakika boyunca 12,000 x g ve daha sonra kültür santrifüj 1 ml onları% 0.3 (v / v) Tween-80 ile 1 ml steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3 kez yıkayın. </li><li> 600 nm (OD 600) de optik yoğunluğunun ölçülmesi, ve (ağırlık / hacim) polivinilpirrolidon 40 (PVP 40) PBS içinde% 2 bir 0.3 OD 600 için bakteriyel süspansiyonun seyreltin. Not: Bir OD 600 x 10 8 ila 1.0 arasında koloni karşılık 0.3 birim / ml (cfu / ml) oluşturulması. </li></ol&gt; </li><li> M. hazırlayın marinum Aşı <ol><li> M. birkaç ayrı ayrı koloniler, alın marinum soy M veya stabil bir şekilde (v / v) Middlebrook OADC zenginleştirme 50 ug ile takviye /, 10 ml 28 ° C&#39;de gece boyunca kültür ml higromisin ve% 10 ile bir Middlebrook 7H10 agar plakasından 10 mCherry ifade pSMT3 mCherry vektörü içeren E11 50 ug / ml higromisin ile takviye edilmiş,% 10 (v / v) Middlebrook ADC zenginleştirme ile Middlebrook 7H9 suyu. </li><li> 1 dakika boyunca 12,000 x g ve daha sonra kültür santrifüj 1 ml, 0.3% (v / v) Tween-80 ile 1 ml steril PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> OD 600 ölçün ve PBS (w / v) 40% 2 pvp bir 0.3 OD 600 için bakteriyel süspansiyonun seyreltin. Not: Bir 1 OD karşılık gelir 600 8 ila 10 x 1,0 cfu / ml. </li></ol></li></ol> 2.. Zebra balığı Yumurta hazırlayın <ol><li> 70 erkek ve 50 dişi yaban ty maksimum yerleştirinbüyük yetiştirme kabına ayrı ayrı zebrafish pe. Not: büyük yetiştirme kabın alt kısmında, dişi balık yerleştirin. </li><li> Zebra balığı üreme başlayalım, sabah ertesi gün ayırıcısını sökün. </li><li> Yumurta, su (60 ug / ml anında okyanus deniz tuzu) ile doldurulmuş bir 50 ml tüp içinde yumurta toplayıcı aracılığıyla büyük yetiştirme kabın altındaki yumurta toplayın. </li></ol> 3.. Enjeksiyon İğneleri <ol><li> 10 um arasında bir iç çapa sahip ticari olarak temin edilebilen özel yapılmış bir cam kılcal damar iğneler elde edilir. </li></ol> Enjeksiyon 4. Deneysel Anahat <ol><li> Yaklaşık olarak 40 ° C kadar, 100 ml% 1 yumurta, su (ağırlık / hacim) agaroz ve serin kaynatın Otomatik mikroenjektörler plaka içine agaroz dökün ve agaroz içine 1.024-iyi damgası yer. Not: levha soğuduktan kullanıma hazırdır. </li><li> Üzerinde otomatik mikroenjektör işletim yazılımı tıklayın &#39;sahne Kalibre&#39;sonra &#39;1024 &#39;de ızgara üzerine tıklayın ve mikroenjektör de agaroz plaka yerleştirmek ve iyi merkezi konumunda ekranda tıklayarak plaka kalibre. </li><li> &#39;Iğne menüsüne&#39; gidin ve &#39;kalibre iğne tutucu&#39; üzerine tıklayın. </li><li> 100 kob / nl S ihtiva eden 10 ul pvp 40 biriyle bir Microloader ucu kullanılarak enjeksiyon iğnesi doldurun epidermidis veya 30 kob / nl M. marinum veya sahte enjeksiyon gibi kullanım pvp 40. </li><li> Otomatik mikro enjektör iğnesi koyun ve aşağı veya yukarı hareket eden iğne ve iğnenin konumunda ekranda tıklayarak, y pozisyonlar x kalibre edin. Daha sonra, iğnenin ucunun konumunda ekranda tıklayarak iğnenin z konumunu kalibre edin. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanılarak agaroz ızgara üzerinde yumurta dağıtmak, ve fazla yumurta su çıkarmak. Otomatik bir mikropüskürtücü içerisinde agaroz ızgara yerleştirin. </li><li> &#39;Injectio gitn menüsü &#39;ve ayarlayın&#39; FemtoJet ayarları menüsünden, 1 nl ile ilişkilidir &#39;200 hPa ayarı&#39; Enjeksiyon basıncı Enjeksiyon süresi &#39;0.2 sn ve&#39; Tazminat basıncı &#39;15 hPa,. </li><li> Tüm plaka enjekte etmek &#39;, tüm enjekte&#39; üzerine tıklayın. </li><li> Yumurta toplamak Petri tabağı başına 70 embriyo, maksimum bir Petri kabı (92 x 16 mm) içine yıkama ve 28 ° C de inkübe edilir göre enjeksiyon sonrasında </li></ol> 5. Akış-sitometresiyle Analizi <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre sitometresi büyük bir tanecik akışı hazırlamak ve yumurta su ile bir numune kabı ve kılıf sıvı kabı doldurun. </li><li> Işletim yazılımı de, &#39;PMT&#39; menüsüne gidin ve aşağıdaki ayarları kullanın: &#39;Yeşil&#39; ve &#39;sarı&#39; kanalları için 650 &#39;Kırmızı&#39; kanalı için V ve 0 V. Ardından &#39;eşikleri&#39; menüsüne gidin ve aşağıdaki ayarları kullanın: &#39;Opticaenkaz etkisini azaltmak amacıyla l yoğunlukta &#39;eşik sinyali: 975 mV (COPAS XL değeri: 50) ve &quot;320 mikro-saniye (800 COPAS XL değeri) Flight Of Time&#39; (TOF) minimum. </li><li> Embriyolar analizi için, 5.4 adıma gidin sıralama ve bir Petri kabı içine embriyolar sıralama 5,5 veya analiz için adıma gidin ve bir 96-plaka içine embriyolar sıralama olmadan analiz için 5.6 adıma gidin. </li><li> Numune fincan embriyolar yerleştirin ve analizine başlamak için &#39;start&#39; üzerine tıklayın. Tüm embriyolar bakıldığında &#39;dur&#39; tıklayarak analizini durdurun. &#39;Bütün Store&#39; tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 &#39;protokolünü uygulayın. </li><li> Numune fincan embriyolar yerleştirin ve &#39;Sıralama&#39; menüsünde 70 girerek sıralanmasını plaka başına 70 embriyo maksimum tanımlar. Sıralayıcı altında boş bir Petri kabı yerleştirin ve &#39;Elle sırala&#39; üzerine tıklayın. Ne Petri di<html> sh doldurulur, &#39;bütün Store&#39; tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 &#39;protokolünü uygulayın. </li><li> Numune fincan embriyolar yerleştirin ve &#39;Sıralama&#39; menüsünde 1 girerek sıralanmasını yuva başına 1 embriyo maksimum tanımlar. Sol plaka tutucu içine boş bir 96-plaka koyun ve &#39;plaka Doldur&#39; üzerine tıklayın. 96-plaka dolduğunda, &#39;bütün Store&#39; tıklayarak verileri kaydetmek. Not: Tüm veriler TXT, LMD, DAT, CSV ve BSRT dosyaları olarak depolanır. Adım 5.7 &#39;protokolünü uygulayın. </li><li> &#39;Durum seç&#39;: Aşağıdaki veri filtre ayarlarını kullanmak, ham verilerin işlenmesi için TXT dosyasını alın. 6 Ardından &#39;Kırmızı gelen toplam floresan sinyal numaralarını kullanabilirsiniz: 40, ve sıralama modül&#39; Durum çeşit &#39;kullanıyorsanız ortalama ve ortalamanın standart hatasını hesaplamak için &#39;kanalı. Çubuk veya saçmanız grafikler içine bu veri setleri çizilir. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. İlaç Tedavisi <ol><li> Analiz ve sıralama 3 gün sonrası enjeksiyon (dpi), M. marinum büyük bir tanecik (adım 5.5) akış sitometresi kullanılarak iki eşit gruba embriyolar etkilemiştir. Bir taşıyıcı ile bir çözücü içerisinde ilgi çekici bir bileşik grubu ile ve tek başına çözücü taşıyıcı (kontrol) ile diğer tedavi. Antibiyotik yan etkileri test etmek için enjekte kontrolü taklit benzer tedavileri uygulanır. </li><li> 4 ve 5 dpi&#39;de analizi tekrar (5.5 adım) ve yumurta su veya bileşiği içeren yumurta su yenileyin. </li></ol> 7. Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme <ol><li> % 0.02 ile embriyolar anestezisi (ağ / hac) analiz öncesi yumurta su içinde 10 dakika boyunca 3-aminobenzoik asit etil ester (Tricaine) tamponlu. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak Omurgalı otomatik tarama Technology sistemi ve büyük parçacık Sampler hazırlayın. </li><li> Nesne - &#39;Görüntüleme gelen embriyoların yaşına karşılık gelen referans görüntüleri seçin211; Algılama Kurulum &#39;menüsü. </li><li> Menüsünden - &#39;Auto mağaza görüntüleri Görüntüleme&#39; dan Omurgalı Otomatik Tarama Teknoloji sistemi tarafından yapılacak resimlerin miktarını ve yönünü seçin. </li><li> Büyük Parçacık Sampler sol plaka tutucuya (adım 5.6) embriyolar ile dolu bir 96-plaka yerleştirin ve &#39;Run plaka&#39; üzerine tıklayın. </li><li> Bir embriyo tespit ve doğru yerleştirildiğinde; görüntü baş ve CLSM bir 10X sade kuru objektif kullanarak ve görüntü işleme yazılımı kullanarak sonradan görüntüleri dikiş ile ayrı ayrı kuyruk. </li></ol>

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li><li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages.">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li><li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection.">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li><li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+infection:+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface.">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li><li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1.">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li><li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS Bu makalede kullanılan aletleri üreten Yaşam Bilimi Yöntemleri BV&#39;nin sahibi.

Bu yazıda anlatılan yüksek verimlilik metodoloji enfeksiyonları farklı tipleri ile balık embriyoları ve larvaları yüksek sayıda taranması için hızlı ve uygun maliyetli boru hattı sağlar. Yerine geleneksel tek veya aile üreme tankların büyük yetiştirme kabı kullanarak yumurtlama sürecinin kontrolü ve senkron yumurta daha fazla sayıda nesil kolaylaştırdı. Otomatik mikro-enjeksiyon sistemi 7 geliştirilmiş bir versiyonu ile, 1 saat içinde aynı hücre aşamasında hemen hemen tüm 2500 yumurta kadar enjekte etmek mümkündür. Bu güncellemeler ve geliştirilmiş yazılımı ile bir okuyabilirisiniz olarak bakteriyel çoğalması ile büyük ilaç ekranlar gerçekleştirmek için kullanılabilecek önceden mümkün olandan daha fazla yumurta enjekte etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu yöntem yine enjeksiyon, Benard ve arkadaşları tarafından tarif edilen, örneğin diğer enjeksiyon yolları sarısı ile sınırlıdır. (2012) 6, umarım yakın gelecekte otomatik mikro-enjeksiyon sistemine dahil edilecektir. &lt;Bu yöntemler zebrafish tarama için Benchmarking rağmen p class = &quot;jove_content&quot;&gt;, hem de diğer balık türleri ile uygulamalar için yararlı olacaktır. Örneğin, ortak sazan ilaç ekranlar için avantajlara sahip olduğu gösterilmiştir. Zebra balığı gibi, yumurta ve ortak sazan erken evre embriyolar şeffaf ama yüz binlerce yumurta ve daha sabit bir genetik zemini 16 teklif kendilenmiş hatlarının kullanılabilirliği geniş spawn boyutu ana avantajı ile vardır. Enfekte embriyolarının büyük miktarlarının analizi sitometresi yüksek miktarda, büyük bir tanecik akışı ile yapılır. Bu cihaz, sıralama çok gözlü levhalar ya da bileşiklerin çok sayıda test edilmesi için özellikle uygun hale getiren bir Petri kabı içine embriyolar analiz edilebilir. Daha yüksek bir görüntüleme çözünürlük gerekli ise, kurulum tekniği sitometresi büyük bir tanecik akış ön tarama için kullanılabilecek bir şekilde adapte edilmiş ve daha sonra da ortam ile örnekleri analiz edilir dahayüksek çözünürlükte koydu. Bu Omurgalı otomatik tarama Teknolojisi 17, 18 kullanılarak yapılabilir. Bu cihaz, otomatik, çok oyuklu bir plaka veya toplu bir kap, resim CLSM veya stereo mikroskobu kullanarak bir kılcal boyunca 360 ° &#39;den 2 ve 7 gün sonra fertilizasyon arasında canlı ya da sabit embriyolar toplayıp göre embriyoların manuel ayırma sağlayan 2 dökme kaplarda tekrar bertaraf edebilir mikroskopik görüntülerde. Gelecek gelişmeler bu nedenle mümkün CLSM ile, zaman içinde embriyo otomatik olarak çok sayıda taranması için yapım çok iyi plaka içine görüntüleme sonra embriyonun sıralama sağlayacaktır. Gelecekteki uygulamalarda Omurgalılar Otomatik tarama Technology sistemi, aynı zamanda, çok gözlü levhalar içine önce dağıtma larvalarının gerek kalmadan teknoloji sitometresi büyük bir tanecik akımının bağlanabilir varsayılarak, daha gelişmiş bir sıralama yol açacaktır. Bu kağıt tesis bir açıklarS. incelemek için yüksek bir verim kurulum d optimizasyonu epidermidis ve M. ilaç keşfi için bir model olarak marinum enfeksiyonu. Bu yumurta sarısı enjekte bu bakterilerin sonucu enjeksiyonu da yumurta gelişim aşamasına bağlı olduğunu göstermektedir. M. enjekte 16-128 hücre aşamasında ya da 16-64 hücre aşamasında M gerilimde marinum E11 kuyruk damarı enjeksiyonu 2, 6 ile aynı enfeksiyon ortaya çıkarır. Ancak bu kurulum sadece bakteriyel patojenlerin çoğalması ile sınırlı değildir. Bu robot, sırasıyla, 13, aşırı ifadesi ve gen knock-down çalışmaları genetik dönüştürme için DNA, RNA veya morpholinos içeren çözeltiler enjekte mümkün olduğu daha önce gösterilmiştir. Ayrıca, bu kurulum, kanser hücresi çoğalma ve yer değiştirme çalışmaları için yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu boru hattı bağlamında sinyal çeşitli mekanizmalar yüksek verimli taramalar için çok yönlü bir yöntem sunardoğuştan gelen bağışıklık, enfeksiyon hastalıkları ve kanser gelişimine uygulanır. Bu ekranlar ilaç keşfi için başkaları ile değil, aynı zamanda tespit uygulanabilir ilaçların olası toksik etkileri analizi ile kombine edilebilir.

Zebra balığı Bugüne kadar (Br.rerio) başarıyla bulaşıcı hastalıklar 1. çeşitli çalışma için verimli bir model olarak kurulmuştur. Zebra balığı embriyo nedeniyle şeffaflık ve floresan proteinleri eksprese eden transjenik mevcut raportör hatlarının çok sayıda vivo görüntüleme imkanı benzersiz sunmaktadır. Bu güçlü kombinasyon Miyobakteryum marinum, M. yakın akrabası olarak patojenler ile etkileşim sırasında bu sürede farklı bağışıklık hücre türlerini izlemek için yapar tüberküloz 2 veya Staphylococcus epidermidis, biyomalzeme ilişkili enfeksiyon 3-5 ana etken. Enfeksiyon farklı yolları çalışmanın 6 amaçları bağlı zebra balığı embriyolar kullanılabilir. Bu enfeksiyon yollarından biri, bakterilerin sarısı enjeksiyon. Diğerlerine göre bu yöntemin temel avantajı sarısı enfeksiyonu olduğunuönemli ölçüde enjeksiyon süresini azaltmak ve enfeksiyonun 7, 8, yüksek tekrarlanabilirlik sağlayan, robot enjeksiyon yoluyla otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Önceki çalışma, S. ve çalışma için in vivo model sisteminde yüksek bir verim olarak zebrafish kullanarak epidermidis ve M. marinum enfeksiyon 7, 8 başarılı olduğunu gösterdi. Bu sistem, robot sarısı erken embriyo enjeksiyon ve bakteri yükü için bir ölçüt olarak floresan sonucu kullanılarak yoluyla hastalık ilerlemesine taranması edebilmektedir. Bu kavram ile uyumlu olarak, bu kurulum optimize edilmiş ve homojen enfekte embriyolarının büyük sayılar üretmek ve bileşikler bir dizi ile muamele edildikten sonra bir süre boyunca enfeksiyonun ilerleyişini izlemek için potansiyeli olan bir yüksek verimli yüksek verimli bir boru hattı kurulmuştur. Kurulan kurulum sayesinde ekrana 8.000 senkron embriyolar kadar üretmek mümkündürhastalığın ilerlemesi için, saat başına 2,500 embriyo kadar bu şekilde işlem. Embriyolar enfekte larva homojen gruplar sağlanması, otomatik bir sistem kullanarak bakteri yüküne göre sıralanır. Ayrıca, kurulum doğrulamak için, memelilerde, tüberküloz ilerlemesini önlemek için bilinen referans etkileri M. bulaşmış embriyo üzerinde test edilmiştir marinum E11 gerginlik veya daha öldürücü M suşu 9. Bu çalışmada ayrıntılı olarak enfekte embriyo sayıda ve gelişme sırasında ve bileşik işlemden sonra bakteriyel ilerlemesinin sonraki analizi elde edebilmek için kurulmuştur yüksek verimli boru hattını açıklar.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H10 agar</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td><td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>L5542</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>L3022</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td><td>16785.03</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td><td>25966.01</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>P1754</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone40</td><td>Calbiochem, San Diego, California, USA</td><td>529504</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td><td>S103</td><td>Multiple suppliers</td></tr><tr><td>Instant ocean sea salt</td><td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td><td>5460</td><td></td></tr><tr><td>iSPAWN</td><td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td><td>iSPAWN</td><td></td></tr><tr><td>Automated microinjection system</td><td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td><td>Automated microinjection system</td><td></td></tr><tr><td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>COPAS XL</td><td></td></tr><tr><td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>VAST BioImager</td><td></td></tr><tr><td>LP Sampler</td><td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td><td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Injection needle 10 &amp;micro;m inner diameter</td><td>Qvotek, Mississauga, Canada</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

Zebra balığı, yüksek kapasiteli tarama olanakları ile bir bütün hayvan modeli olarak ilaç keşif taramaları preklinik aşamasında değerli bir araç haline gelmektedir. Bunlar, bu şekilde azaltılması, memeli modellerinde erken aşamalarında hücre bazlı deneyler arasında boşluk ve in vivo doğrulama köprü için kullanılabilir, çok daha pahalı kemirgen modellerinde testten geçen bileşiklerin sayısı. Bu açıdan, bu metin içindeki Staphylococcus epidermidis çalışma ve Mycobacterium marinum enfeksiyonu için in vivo model sistem olarak zebrafish kullanarak yeni bir yüksek veri akışı boru hattı tarif edilmektedir. Bu kurulum senkron embriyo çok sayıda üretim ve analiz homojen enfekte sağlar. Ayrıca boru hattının esnek, kullanıcının kolayca gerektiğinde analiz çözünürlüğünü artırmak için başka platformlar uygulamasına olanak tanır. Birlikte yenilikçi yüksek verim te olan Zebra balığı kombinasyonuchnologies, bu yeni bileşiklerin etki moduna çözmek için kullanılabilecek transjenik sayıda için bütün bir hayvan modeli kullanılarak değil, aynı zamanda mukavemet, sadece ilaç test ve yeni olanaklar keşif alanı açar.

Bu sonuçlar yüksek kapasiteli boru hattı S. çalışma olduğunu göstermektedir epidermidis ve M. marinum enfeksiyon başarıyla kurulmuş ve diğer enfeksiyon modellerine uzatılabilir. İlk olarak, Adatto ve arkadaşları tarafından yayınlanmış sistemine göre büyük yetiştirme kabına (Şekil 1A). (2011) 11 kullanımının, yumurtlama işleminin yüksek bir kontrolü elde tek olaylar senkron yumurtaların büyük sayılar üretmek için olanak sağlar. Daha önce geliştirilen otomatik mikro-enjeksiyon sistemi 7 geliştirilmiş bir versiyonu (Şekil 1A) kullanıldı, kısa bir süre içinde embriyo çok sayıda enjekte edebilmek için yanında. Sarısı enfeksiyon için en iyi gelişimsel aşamada, S. ile enjeksiyonları olduğunu değerlendirmek için epidermidis ve M. marinum Kimmel ve diğerleri tarafından yapılan açıklamaya göre, 1 ve 512 hücre aşamasında arasındaki tüm farklı safhalarında gerçekleştirilmiştir. (1995) 12 </sup&gt;. 100 cfu S ile Enjeksiyonlar epidermidis 16 ve 128 hücre aşamasında arasında en iyi enfeksiyon modeli (Şekil 2) temin etmiştir. Bakteriler 3 gün boyunca sarısı içinde çoğaldı ve sonrası 3 dpi vücuda yayılır. 256 hücre aşamasında embriyo gövde içine yayılan neredeyse herhangi bir bakteri ile yumurta sarısı içinde esas olarak bakteri büyüme gösterdi sonra 16 hücre aşamasından önce enjeksiyon yapılması 4 dpi ve enjeksiyon yüksek mortaliteye neden oldu. Bakteriyel yük miktarının Veneman ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, büyük bir tanecik akış sitometresi kullanılarak flüoresan yoğunluğu analizi ile gerçekleştirilmiştir. (2013) 8 (Şekil 3). Gözlemler göstermiştir ki 30 cfu M. püskürtülmesi için uygun gelişim aşamasında marinum enjeksiyon E11 suşu (Şekil 4A) ve daha öldürücü M Strai ile 16-64 hücre aşamasına arasında 16-128 hücre aşamasında arasındadırn (Şekil 4B). Bu aşamalarda enjekte embriyolar yumurta sarısı içinde bakteri büyüme gösterdi ve embriyo (Şekil 7) yoluyla bakterilerin yayılmasını. Erken aşamalarında hem cinsleri ile Enfeksiyon 4 dpi sonra ölmeye embriyoların lider nonspesifik jeneralize bakteriyel büyümeyi sundu. Diğer taraftan, daha sonraki aşamalarda enjekte edilen embriyolar bakteri yükü sarısı sınırlıydı. Daha sonra, büyük parçacık ön düzenlemesine (Şekil 1 B)-olmayan ya da yüksek derecede enfekte embriyolar (Şekiller 5A ve 6A) hariç enfekte balıkların büyük homojen gruplar oluşturulur akış sitometresi. Ön düzenlemesine sonra, M. marinum enfekte embriyolar Rifampisin, bir birinci hat antitüberküloz ilaç ile muamele edilmiştir. Önceki çalışmalar, 200 uM&#39;lik bir dozda Rifampicin ile tedavi, etkin bir M. azalttığını göstermiştir zebrabalıkları 7, 13 marinum enfeksiyonu. Advantag alarakFarklı dozlarda uygulandı ile yüksek verimlilik ayarlaması, tedavi ile oluşturulan homojen bir şekilde enfekte edilmiş embriyoların sayıda e. M. ile enfekte embriyolar marinum M gerilme ve 12, 24 ile 48 saat boyunca muamele edilmiş ve 200 uM Rifampisin, doza bağlı bir şekilde (Şekil 5B) etkili bir şekilde azaltmak için mikobakteriyel enfeksiyonu gösterdi. Bu konsantrasyon, gelecekteki deneyler için kullanılmıştır 200 uM&#39;lik bir dozda Rifampisin ile enfeksiyonun etkili bir azalma göz önüne alındığında. Önceki sonuca paralel olarak, bakteriyel yükü ilerlemesini okuyan M. kullanarak marinum E11 gerginlik belirgin bir azalma 24 saat ve sonrasında 200 mcM Rifampicin tedaviden sonra (Şekil 6B) gözlenmiştir. Yüksek büyütme görüntüleme bu embriyoların gerekmektedir Ayrıca, eğer, bu numuneler kullanılarak analiz edilebilir yerden 96 oyuklu plakalar içinde (Şekil 1 C), otomatik olarak görüntülenebilirBüyük Parçacık Sampler ile Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi sistemi CLSM üzerine monte edilmiş. Büyük Parçacık Sampler ile Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi sistemi ya bir CLSM veya stereo mikroskop üzerine monte edilebilir bir sistemdir. Bu cihaz, otomatik olarak, bir cam kılcal yoluyla, 96 oyuklu bir plaka ya da dökme kabından, canlı ya da sabit embriyoların yüklenmesini sağlar ve istenen açıda (örneğin, dorsal ve lateral) de kameranın önüne yönlendirir. Bütün yönlerde embriyonun Görüntüler kamera ile ilgili kartı ya da harici bir CLSM (Şekil 7) ile yapılabilir. Embriyolar daha sonra toplama veya atık konteynere transfer edilecektir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Şekil 1.. Yaygın deneysel outline. Büyük A) Yetişkin balık yumurtası toplanmış, bir agaroz plaka içine hizalanmış ve enjekte edilir, çiftleşmeye birlikte konur. B) enjekte yumurta 28 ° C&#39;de kuluçkaya yatırılır ve olası ilaç tedavisi için önceden sıralanacaktır. ° C) daha sonraki analizi parçacık CLSM ile sitometresinin ve / veya Büyük Partikül Numune / Omurgalı Otomatik Eleme Teknolojisi akar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> S. iyi cep evre 2. Kurulması Şekil epidermidis enjeksiyon sarısı. Zebrafish embriyolar S. 100 cfu ile 1 512 hücre aşamasından farklı gelişim aşamalarında sarısı enjekte edildi epidermidis. 1 a arasına enjekte embriyolarnd 8 hücreli evre 4 dpi sarısı ve yüksek mortalite bakteriyel büyüme gösterdi. 16 ve 128 hücre aşamasına arasına enjekte Embriyolar sarısı ve 3 dpi başlayan vücudun içinde bakteri büyüme gösterdi. 256 ve 512 hücre aşamasına arasına enjekte Embriyolar sarısı içinde birçok bakteri büyüme gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> S. sitometresinin büyük parçacık akışı kullanılarak bakteri yükünün Şekil 3.. Kantitasyonu. 100 kob epidermidis zebrafish embriyoların sarısı içine enjekte edilmiştir. A) 5 dpi kadar, her gün, 10 embriyo grupları iki biyolojik kopyaları (hata çubukları göre ortalama üstel büyüme gösteren, homojenize edilir ve direkt olarak kaplanmıştırAnaliz sitometresiyle = SEM). B) Büyük parçacık akışı olmayan enjekte ve S&#39;den ortalama floresan sinyalini göstermektedir epidermidis embriyolar enjekte. . Değil önemli farklılıklar C) mikroorganizma arasındaki korelasyon ve: durum başına 30-160 embriyolar (hata çubukları = SEM), farklı harf ANOVA Tukey post-hoc testi (P &lt;0.001), ns tarafından izlenen bir arada istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermektedir analiz edildi 10 S. gruplarının ortalama floresans sinyali epidermidis (hata çubukları = SEM) embriyolar bulaşmış. Bu rakam Veneman ark modifiye edilmiştir. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Şekil 4. EstablisM. için iyi cep sahnenin taşınma süreleri marinum sarısı enjeksiyon. Zebrafish embriyolar M. 30 cfu ile 1 512 hücre aşamasında tüm farklı gelişim aşamalarında enjekte edilmiştir marinum E11 ve M suşu. A, B) Embriyolar gösterdi 1-8 hücreli aşamasında enjekte benzer yayılan ve bu enjekte ederken E11 gerginlik granülomlar ve sistemik enfeksiyon oluşumunu gösterdi hem cinsleri ile mortalite. A) Embriyolar 16-128 hücre aşamasına arasına enjekte 256 512 hücre aşaması. B) sarısı içine bakteri yükünü tuttu Embriyolar 512 hücre aşamasına kadar 128 enjekte olanlar sarısı içine bakteri yükünü tutarken yapıları ve sistemik enfeksiyon gibi granülom oluşumunu gösterdi M suşu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo: Src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt;: fo içerik-width = &quot;5in&quot; Şekil 5,. M. tedavisi marinum akut enfeksiyon birinci basamak anti-tüberküloz ilaç ile. Embriyolar M. 30 cfu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte marinum M soy Her iki grupta da, bireysel embriyoların olmayan ve / veya yüksek derecede enfekte embriyolar. A) Floresans attıktan sonra iki grupta kriteri için 3 dpi akış sitometresi büyük parçacık aracılığıyla çalıştırılmıştır. B) Embriyolar Rifampicin (RIF ile muamele ), 12, 24 ve 200 uM 4 dpi&#39;de analiz edildi dozlarında 48 saat boyunca; bunların bakteri yükü önemli ölçüde. C) Örnek COPAS 12, 24&#39;ün dozlarda DMSO ile muamele edilmiş ve Rifampicin embriyo profilleri ve 24 saat boyunca 200 uM azalır. Bakteriyel yük ve dağıtım kırmızı zirveleri ile belirtilir. Mavi hat Zebrafish e dpf&#39;e kriteri elemanının profili (4 temsilmbryo) COPAS tarafından. Koşul başına 60-90 embriyo analiz edilmiştir. Her bir veri noktası tek bir embriyo temsil eder. ± SEM olarak değerleri belirtilmiştir. ns: anlamlı değil farklılıklar. Farklılıkların istatistiksel anlamlılık Analizi ANOVA Tukey posthoc testinin ardından tek yönlü tarafından yapıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Şekil 6,. M. tedavisi marinum kronik enfeksiyon birinci basamak antitüberküloz ilaç ile. Embriyolar M. 30 cfu ile 16-64 hücre aşamasına arasına enjekte marinum E11 suşu olmayan ve / veya yüksek oranda enfekte embriyolar attıktan sonra iki grup halinde sıralanır 3 dpi sitometresini büyük parçacık akışı ile çalıştırıldı.<html> A) her iki grupta da bireysel embriyolar Floresans. B) 4 gün boyunca 200 uM Rifampicin (RIF) ile muamele Embriyolar tedavi 1 gün sonra bakteri yükünün önemli bir azalma gösteren analiz edilmiştir. Koşul başına 90 embriyo analiz edilmiştir. ± SEM olarak değerleri belirtilmiştir. Farklı harfler aynı tedavinin zaman noktaları arasında önemli farklılıklar göstermektedir. * Kontrol grubu ile anlamlı farklılıklar gösterir. ns: anlamlı değil farklılıklar. Farkların istatistiksel farkları, ANOVA analizi Tukey testi posthoc ardından bir şekilde gerçekleştirildi. (P &lt;0.05). Şekil B) Spaink ark modifiye edilmiştir. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; M. Şekil 7. Sonucu marinum E11 sarısı enjeksiyon Omurgalı Otomatik Tarama Teknolojisi ve CLSM kullanarak görüntülü. 5 dpi FLI1-EGFP 14 embriyo (3 görüntülerini dikişli) Eşodaklı Z yığını. M. A) Canlı embriyo gösteren çoğalması vücut. B genelinde marinum E11 bakteriler (kırmızı)) M. gösteren Sabit 5 dpi fli-EGFP embriyo vücutta marinum E11 bakteriler (kırmızı) lökositlerin L-plastin 15 immün ile tespit (açık mavi) ile ko-lokalize.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discover

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır.

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Ve<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Enfeksiyon İlaç Keşif için bir model olarak

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

establishment-optimization-high-throughput-setup-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K Görüntüleme.  Leiden University.  Bu video makalede, başarılı bir bütün omurgalı hayvan organizmayı kullanarak bileşik test ve ilaç keşfi için yeni bir güçlü bir araç sağlayan Zebra balığı embriyolarının büyük sayıda bulaştırmak ve analiz etmek için kurulmuştur yüksek kapasiteli boru hattı açıklanır. 

Video: Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Biyomühendislik

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mycobacterium abscessus için Çift Raportör Kullanarak Yüksek Verimli Tarama Testi

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: M. abscessus Tedavilerinin Etkili Keşfi için Ölçeklenebilir İlaç Tarama Protokolü

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Kuruluş ve Eğitim için bir Yüksek Verimli Kur Optimizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme