نحن ممتنون ليوني دي بوير وباس زات (المركز الأكاديمي الطبي) لتزويدنا S. البشروية O-47 سلالة. نشكر ريكو بونجارتس، فرانسيس سميت وأنجيلا كوماس (الاتحاد Biometrica) طلبا للمساعدة والمشورة مع COPAS XL وتحليل BioImager الشاسعة. نشكر ديفي دي ويت، أولريك Nehrdich، ولورا فان هولست للأسماك كالة الاشراف على العقار، وزملاء آخرين من جامعة ليدن لإجراء مناقشات مفيدة. يشكل هذا البحث جزء من مشروع P5.03 IBIZA من برنامج البحوث في المعهد المواد الطبية الحيوية، بتمويل مشترك من قبل وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية، وبرنامج ميكس الذكية (NWOA_6QY9BM) من وزارة الشؤون الاقتصادية الهولندية و وزارة هولندا التعليم والثقافة والعلوم. تم الحصول على دعم إضافي من مشروع الاتحاد الأوروبي ZF-الصحية (FP7-الصحية 2009-242048)، وكان مدعوما من قبل RMJ ماري كوري الزمالة كما شهدت باحث في التدريب الأولي شبكة FishForPharma (PITN-GA-201 الاتحاد الأوروبي1-289209). تلقى SJR التمويل من الأدوية المبتكرة المبادرة المشتركة التعهد بموجب اتفاق منحة رقم 115337، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) والشركات EFPIA في الكتاب contribution.The نوع تقر الدعم المالي من صندوق جامعة ليدن (LUF) لالروبوتات ومن Cyttron، في برنامج الإعانات Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit، والذي بدوره يدعم ماليا من قبل المنظمة الهولندية للأبحاث العلمية لمرافق التصوير. وأيد اقتناء نظام COPAS جزئيا من قبل شعبة علوم الأرض والحياة (ALW) مع مساعدات مالية من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO، 834.10.004).

1. السلالات البكتيرية وشروط النمو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد S. البشروية اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق عدة مستعمرات فردية من S. المستمدة سلالة البشروية O-47، التي تحتوي على pWVW189 mCherry ناقلات التعبير (دي بوير L. غير منشورة) من لوريا BERTANI (LB) لوحة أجار تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط ​​25 مل LB تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول لmidlog المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 1 مل من ثقافة في 12،000 x ج لمدة 1 دقيقة ثم يغسل لهم 3x أخرى مع 1 مل العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 0.3٪ (V / V) توين-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600)، وتمييع تعليق البكتيرية إلى OD 600 من 0.3 في 2٪ (ث / ت) بوفيدون 40 (حماية الأصناف النباتية 40) في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: إن OD 600 من 0.3 إلى 1.0 يتوافق × 10 8 مستعمرة / مل (كفو / مل). </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد م. marinum اللقاح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق عدة مستعمرات فردية من M. marinum السلالة M أو E11 تحتوي على ناقلات pSMT3-mCherry معربا عن ثابت mCherry 10 من لوحة أجار 7H10 ميدلبروك مع 10٪ (V / V) لتخصيب ميدلبروك OADC تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين والثقافة بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية في 10 مل من ميدلبروك 7H9 مرق مع 10٪ (V / V) لتخصيب ميدلبروك ADC تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 1 مل من ثقافة في 12،000 x ج لمدة 1 دقيقة ثم يغسل 3x أخرى مع 1 مل PBS العقيمة مع 0.3٪ (V / V) توين-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600، وتمييع تعليق البكتيرية إلى OD 600 من 0.3 في 2٪ (ث / ت) حماية الأصناف النباتية 40 في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: إن OD 600 من 1 إلى 1.0 يتوافق × 10 8 كفو / مل. </li></ol></li></ol> 2. إعداد الزرد بيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حد أقصى قدره 70 من الذكور و 50 من الإناث البرية تايالمؤسسة العامة الزرد بشكل منفصل في الإناء تربية الكبيرة. ملاحظة: ضع السمك الإناث في الجزء السفلي من السفينة تربية الكبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فاصل في اليوم التالي في الصباح، للسماح للبدء تربية الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض في الجزء السفلي من السفينة من خلال تربية كبيرة جامع البيض في أنبوب 50 مل مملوءة بالماء البيض (60 ميكروغرام / مل ملح البحر المحيط لحظة). </li></ol> 3. إبر الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول المتاحة تجاريا العرف الشعيرات الدموية الزجاج الإبر مع قطرها الداخلي 10 ميكرون. </li></ol> 4. مخطط التجريبية من حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي 100 مل من 1٪ (ث / ت) الاغاروز في الماء البيض، وبارد حتى ما يقرب من 40 درجة مئوية. صب الاغاروز في microinjectors وحة الآلي ووضع ختم 1،024 جيدا في الاغاروز. ملاحظة: لوحة جاهزة للاستخدام عند تبريده. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على microinjector التشغيل الآلي البرامج، انقر على &quot;معايرة المرحلة &#39;،ثم انقر على &#39;1024 &#39;الشبكة بشكل جيد ووضع لوحة الاغاروز في microinjector ومعايرة لوحة من خلال النقر على الشاشة في موقف وسط من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اذهب إلى &quot;القائمة إبرة&quot; وانقر على &#39;حامل معايرة الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء إبرة الحقن باستخدام تلميح microloader إما مع 10 ميكرولتر حماية الأصناف النباتية 40 تحتوي على 100 ​​وت م / NL S. البشروية أو 30 وت م / م NL marinum، أو استخدام الحقن حماية الأصناف النباتية 40 كما وهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إبرة في الآلية الدقيقة حاقن ومعايرة س، ذ الموقف عن طريق خفض أو نقل ما يصل إبرة والنقر على الشاشة في موقف الإبرة. ثم معايرة موقف ض من الإبرة من خلال النقر على الشاشة في موقف غيض من الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع البيض على الشبكة الاغاروز باستخدام الماصة نقل البلاستيك، وإزالة المياه الزائدة البيض. وضع الشبكة الاغاروز في microinjector الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى &quot;مباشرة صبن القائمة &quot;وضبط&quot; الضغط حقن &#39;الإعداد ل200 HPA،&#39; الوقت حقن &#39;0.2 ثانية و&#39; ضغط التعويض &#39;15 HPA، الذي يرتبط مع 1 NL، في قائمة الإعدادات Femtojet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &#39;حقن جميع&#39; لحقن وحة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البيض بعد الحقن عن طريق غسلها في طبق بتري (92 × 16 ملم)، وبحد أقصى 70 الأجنة في طبق بيتري، واحتضان عند 28 درجة مئوية. </li></ol> 5. تحليل تدفق عداد الكريات- <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وملء كوب عينة وغمد حاوية السائل مع الماء البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في برنامج التشغيل، انتقل إلى القائمة &quot;PMT &#39;واستخدام الإعدادات التالية: 650 V ل&#39; الأحمر &#39;وقناة V 0 ل&#39; الأخضر &#39;وقنوات&#39; صفراء &#39;. ثم انتقل إلى القائمة &quot;العتبات&quot; واستخدام الإعدادات التالية: &#39;بصرياتل كثافة &#39;إشارة عتبة: 975 بالسيارات (القيمة COPAS XL: 50) و &quot;وقت الرحلة&quot; (TOF) الحد الأدنى إلى 320 μsec (COPAS XL القيمة: 800) وذلك للحد من تأثير الحطام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحليل دون فرز الأجنة انتقل إلى الخطوة 5.4، لتحليل وفرز الأجنة في طبق بتري انتقل إلى الخطوة 5.5 أو للتحليل وفرز الأجنة في لوحة 96 جيدا انتقل إلى الخطوة 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في كأس عينة وانقر على &quot;ابدأ&quot; لبدء التحليل. عندما يتم تحليل جميع الأجنة وقف التحليل عن طريق النقر على &#39;توقف&#39;. حفظ البيانات عن طريق النقر على &#39;تخزين جميع&#39;. ملاحظة: يتم تخزين كافة البيانات في TXT، LMD، DAT، CSV وملفات BSRT. اتباع البروتوكول في خطوة 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في كأس العينة وتحديد الحد الأقصى للأجنة في 70 لوحة ليتم فرزها عن طريق إدخال 70 في القائمة &#39;ترتيب&#39;. وضع طبق بيتري فارغة تحت فارز وانقر على &#39;دليل الترتيب. عندما دي بتري<html> شغل في ركلات الترجيح، وتوفير البيانات عن طريق النقر على &#39;تخزين جميع&#39;. ملاحظة: يتم تخزين كافة البيانات في TXT، LMD، DAT، CSV وملفات BSRT. اتباع البروتوكول في خطوة 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة في كأس العينة وتحديد الحد الأقصى ل1 الجنين لكل بئر ليتم فرزها عن طريق إدخال 1 في القائمة &#39;ترتيب&#39;. وضع فارغة لوحة 96 جيدا في حامل لوحة اليسار وانقر على &#39;املأ وحة&#39;. عندما يتم تعبئة وحة 96 جيدا، وحفظ البيانات عن طريق النقر على &#39;تخزين جميع&#39;. ملاحظة: يتم تخزين كافة البيانات في TXT، LMD، DAT، CSV وملفات BSRT. اتباع البروتوكول في خطوة 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ملف TXT لمعالجة البيانات الخام، واستخدام إعدادات التصفية البيانات التالية: &quot;الحالة اختر &#39;: 40، وإذا كان استخدام وحدة النوع&quot; نوع الحالة &quot;: 6 ثم استخدم الأرقام من مجموع إشارة مضان من&#39; الأحمر &#39;قناة لحساب متوسط ​​والخطأ المعياري للمتوسط. رسم هذه مجموعات البيانات في شريط أو مبعثر الرسوم البيانية. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. علاج المخدرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل والفرز في 3 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة)، M. marinum إصابة الأجنة في مجموعتين متساويتين باستخدام تدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات (الخطوة 5.5). علاج مجموعة واحدة مع مجمع المصالح في المذيبات الناقل وغيرها من المذيبات مع الناقل وحده (مراقبة). تطبيق علاجات مماثلة للسخرية السيطرة حقن لاختبار الآثار الجانبية للمضادات الحيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار في 4 و 5 نقطة في البوصة تحليل (الخطوة 5.5) وتجديد الماء البيض أو البيض المياه التي تحتوي على مركب. </li></ol> 7. التصوير عالية الدقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة مع 0.02٪ (ث / ت) مخزنة 3 أمينوبنزويك اثيل استر حامض (تريكين) في الماء البيض 10 دقيقة قبل التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نظام تقنية فحص الفقارية الآلي والجسيمات عينات كبيرة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الصور المرجعية المقابلة لعمر الأجنة من &#39;التصوير - كائن211؛ إعداد كشف &#39;القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مقدار واتجاه الصور التي سيقوم بها نظام تكنولوجيا الفرز الآلي الفقارية من &#39;التصوير - مخزن السيارات الصور&#39; القائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة 96 جيدا مليئة الأجنة (من الخطوة 5.6) في حامل لوحة الأيسر من الجسيمات عينات كبيرة، وانقر على &quot;لوحة تشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم الكشف عن الجنين وضعه بشكل صحيح؛ صورة الرأس والذيل منفصل مع CLSM باستخدام الهدف 10X الجافة عادي وغرزة الصور بعد ذلك باستخدام برامج معالجة الصور. </li></ol>

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li><li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages.">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li><li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection.">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li><li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+infection:+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface.">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li><li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1.">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li><li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS هو صاحب طرق علوم الحياة BV التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

منهجية إنتاجية عالية وصفها في هذه الورقة يوفر خط أنابيب فعالة من حيث التكلفة وسريعة لفحص عدد كبير من الأجنة الأسماك واليرقات مع أنواع مختلفة من الالتهابات. باستخدام سفينة تربية كبيرة بدلا من الدبابات تربية واحدة أو الأسرة التقليدية سهلت السيطرة على عملية التبويض وتوليد عدد أكبر من البيض متزامن. مع نسخة محسنة من نظام حقن الصغرى الآلي 7، فمن الممكن لحقن ما يصل إلى 2،500 بيضة تقريبا كل خلية في المرحلة نفسها في حدود 1 ساعة. مع هذه التحديثات وتحسين البرمجيات فمن الممكن لحقن المزيد من البيض مما كان ممكنا في السابق والتي يمكن استخدامها لأداء شاشات كبيرة مع انتشار المخدرات البكتيرية باعتبارها تلا. ولكن هذه الطريقة لا تزال تقتصر على صفار الحقن، حقن الطرق الأخرى على سبيل المثال التي وصفها بينارد وآخرون. (2012) 6، ونأمل أن تدمج في نظام حقن الصغرى الآلي في المستقبل القريب. &lt;ع الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; على الرغم من أن تقاس هذه الطرق لفحص الزرد، فإنه سيكون من المفيد للتطبيقات مع أنواع الأسماك الأخرى كذلك. على سبيل المثال، قد أشار الكارب الشائع لديها مزايا للشاشات المخدرات. مثل الزرد والبيض والأجنة في مرحلة مبكرة من الكارب الشائع وشفافية، ولكن مع الميزة الرئيسية لحجمها تفرخ كبيرة من مئات الآلاف من البيض وتوافر خطوط الفطرية التي تقدم خلفية وراثية أكثر ثباتا 16. ويتم تحليل كميات كبيرة من الأجنة المصابة مع إنتاجية عالية كبيرة تدفق الجسيمات عداد الكريات. هذا الجهاز يمكن تحليلها نوع الأجنة في لوحات متعددة جيدا أو طبق بتري مما يجعلها مناسبة خاصة لاختبار أعداد كبيرة من المركبات. إذا كان هناك حاجة لقرار التصوير العالي، ويتم تكييف من الإعداد بطريقة تدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات التكنولوجيا يمكن استخدامها للفحص المسبق، وبعد ذلك تحليل العينات في المتوسط ​​خلالوضعت بدقة أعلى. ويمكن أن يتم ذلك باستخدام تقنية فحص الفقارية الآلي 17، 18. هذا الجهاز يمكن أن تجمع تلقائيا الأجنة الحية أو الثابتة بين الإخصاب 2 و 7 أيام آخر من لوحة متعددة جيدا أو حاوية السوائب، الصورة 360 درجة من خلال الشعيرات الدموية باستخدام CLSM أو المجهر ستيريو والتصرف مرة أخرى في 2 حاويات السوائب السماح الفرز اليدوي للأجنة يستند على الصور المجهرية. وإدخال تحسينات في المستقبل تسمح للفرز الجنين بعد التصوير في لوحة جيدا متعددة، مما يجعل من الممكن لفحص عدد كبير من الأجنة الفردية تلقائيا بمرور الوقت مع CLSM. على افتراض أن يمكن أيضا أن تكون متصلا نظام تكنولوجيا فحص الفقارية الآلي في التطبيقات المستقبلية لتدفق الجسيمات الكبيرة عداد الكريات التكنولوجيا دون الحاجة اليرقات قبل صرفها في لوحات متعددة جيدا، وسوف يؤدي إلى فرز أكثر تقدما. وتصف هذه الورقة مؤسسةد الأمثل من الإعداد إنتاجية عالية لدراسة S. البشروية وM. عدوى marinum كنموذج لاكتشاف المخدرات. فإنه يدل على أن نتائج هذه البكتيريا تحقن في صفار يعتمد على مرحلة تنموية من البيض في وقت الحقن. عن طريق الحقن M. marinum E11 في المرحلة 16-128 خلية أو سلالة M 16-64 في مرحلة الخلية يؤدي إلى نمط العدوى نفس المنوال الذيلية حقن 2، 6. ولكن هذا الإعداد لا يقتصر على انتشار مسببات الأمراض البكتيرية فقط. وقد تبين ذلك من قبل أنه من الممكن لحقن آليا المحاليل المحتوية على الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي أو morpholinos لنقل الجينات، والإفراط في التعبير الجيني وتدق إلى أسفل الدراسات، على التوالي 13. علاوة على ذلك، فقد تبين أن هذا الإعداد مفيد أيضا لدراسة انتشار الخلايا السرطانية والهجرة. لذا يقدم هذا الخط وسيلة تنوعا للشاشات إنتاجية عالية من مجموعة متنوعة من آليات إشارة في سياقالحصانة الفطرية، وتطبيقها على الأمراض المعدية وتطور السرطان. هذه الشاشات يمكن الجمع مع الآخرين لاكتشاف الدواء ولكن أيضا مع تحليل الآثار السامة المحتملة من الأدوية المطبقة التي تم تحديدها.

حتى الآن الزرد (دانيو rerio) وقد أنشئت بنجاح كنموذج فعال لدراسة مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية 1. الجنين الزرد يوفر إمكانيات فريدة من نوعها في الجسم الحي التصوير بسبب شفافيتها وعدد كبير من خطوط مراسل المعدلة وراثيا الموجودة معربا عن البروتينات الفلورية. هذه تركيبة قوية يجعل من الممكن لتتبع مختلف أنواع الخلايا المناعية في الوقت المناسب أثناء التفاعل مع مسببات الأمراض مثل المتفطرة البحرية، وأقرب قريب من M. 2 السل، أو المكورات العنقودية البشروية، والمسبب الرئيسي لمادة بيولوجية العدوى المرتبطة 3-5. طرق مختلفة من العدوى يمكن أن تستخدم في الأجنة الزرد تبعا لأغراض الدراسة 6. واحد من هذه المسارات العدوى حقن صفار من البكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة بالمقارنة مع الآخرين هو أن infecti صفارلا يمكن أن يؤديها على تلقائيا عن طريق الحقن الروبوتية، والحد بشكل كبير من الوقت والسماح حقن استنساخ عالية من العدوى 7، 8. العمل السابق، وذلك باستخدام الزرد باعتباره إنتاجية عالية في النظام النموذجي الجسم الحي لدراسة S. البشروية وM. أظهرت العدوى marinum أن تكون ناجحة 7، 8. هذا النظام قادر على كشف عن تطور المرض عن طريق الحقن الروبوتية صفار الأجنة المبكر وباستخدام مضان قراءات كإجراء لالحمولة الجرثومية. في اتفاق مع هذه الفكرة، وقد تم تحسين هذا الإعداد وإنشاء خط أنابيب إنتاجية عالية ذات كفاءة عالية مع القدرة على توليد عدد كبير من الأجنة المصابة متجانس وتتبع تطور العدوى خلال فترة بعد العلاج مع عدد من المركبات. مع الإعداد أنشئت فمن الممكن أن تولد ما يصل إلى 8،000 الأجنة متزامن إلى الشاشةلتطور المرض، وتجهيز بهذه الطريقة تصل إلى 2،500 الأجنة في الساعة. يتم فرز الأجنة على أساس حمولتها البكتيرية باستخدام نظام آلي، وضمان مجموعات متجانسة من اليرقات المصابة. علاوة على ذلك، للتحقق من صحة الإعداد، قد تم اختبارها آثار إشارة معروفة لمنع تطور مرض السل في الثدييات على أجنة مصابة M. marinum E11 سلالة أو أكثر ضراوة السلالة M 9. توضح هذه الدراسة بالتفصيل خط أنابيب إنتاجية عالية التي أنشئت لتكون قادرة على توليد أعداد كبيرة من الأجنة المصابة وتحليلها لاحقا من تطور البكتيريا خلال التنمية وبعد العلاج المركب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

الزرد أصبحت أداة قيمة في المرحلة قبل السريرية من العروض اكتشاف المخدرات كنموذج الحيوان كله مع إنتاجية عالية الاحتمالات الفرز. أنها يمكن أن تستخدم لردم الهوة بين المقايسات الخلية التي يوجد مقرها في المراحل السابقة والتحقق من صحة في الجسم الحي في نماذج الثدييات، والحد، وبهذه الطريقة، فإن عدد المركبات التي تمر عبر لإجراء تجارب على نماذج القوارض أكثر تكلفة بكثير. في ضوء ذلك، في مخطوطة موجودة يوصف خط أنابيب إنتاجية عالية جديدة باستخدام الزرد كما هو الحال في الجسم الحي نظام نموذجي لدراسة المكورات العنقودية البشروية والعدوى marinum المتفطرة. هذا الإعداد يسمح توليد وتحليل عدد كبير من الأجنة المصابة متزامن متجانس. وعلاوة على ذلك المرونة في خط أنابيب يسمح للمستخدم لتنفيذ بسهولة منصات أخرى لتحسين القرار من تحليل عند الحاجة. مزيج من الزرد جنبا إلى جنب مع الشركة المصرية للاتصالات مبتكرة إنتاجية عاليةchnologies يفتح مجال اختبار المخدرات واكتشاف إمكانيات جديدة ليست فقط بسبب قوة باستخدام نموذج الحيوان كله ولكن أيضا بسبب وجود عدد كبير من خطوط المعدلة وراثيا المتاحة التي يمكن استخدامها لفك طريقة عمل مركبات جديدة.

وتظهر النتائج ان خط الانابيب الحالي إنتاجية عالية لدراسة S. البشروية وM. وقد أنشئت العدوى marinum بنجاح والتي يمكن أن تمتد إلى نماذج العدوى الأخرى. أولا، استخدام سفينة كبيرة تربية (الشكل 1A)، استنادا إلى نظام نشرته Adatto وآخرون (2011) 11، وتمكن لتوليد أعداد كبيرة من البيض في وقت واحد واحد وتكفل الأحداث عنصر تحكم عالية من عملية وضع البيض. المقبل لتكون قادرة على حقن عدد كبير من الأجنة في فترة قصيرة من الزمن، تم استخدام نسخة محسنة من وضعت من قبل النظام الآلي لحقن الصغرى 7 (الشكل 1A). لتقييم الذي هو أفضل مرحلة تنموية للعدوى صفار، والحقن مع S. البشروية وM. أجريت marinum في جميع مراحل مختلفة بين 1 و 512 مرحلة الخلية، وفقا للوصف الذي أدلى به كيميل وآخرون (1995) 12 </suع&gt;. الحقن مع 100 وت م س. البشروية بين مرحلة 16 و 128 خلية تقديم أفضل نمط الإصابة (الشكل 2). البكتيريا انتشرت داخل صفار البيض لمدة 3 أيام وتنتشر في الجسم من 3 نقطة في البوصة فصاعدا. أداء الحقن قبل مرحلة 16 خلية أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات من 4 نقطة في البوصة، والحقن بعد أن أظهرت المرحلة الخلية 256 نمو البكتيريا أساسا داخل صفار البيض مع أي البكتيريا تنتشر داخل الجسم من الجنين. تم إجراء القياس الكمي للعبء البكتيرية عن طريق تحليل كثافة مضان باستخدام تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة كما وصفها فينمان وآخرون (2013) 8 (الشكل 3). أظهرت الملاحظات أن المرحلة التنموية المثلى للحقن من 30 م وت حقن marinum ما بين 16-128 مرحلة الخلية لسلالة E11 (الشكل 4A) وبين 16-64 مرحلة الخلية مع M الاجهاد أكثر ضراوةن (الشكل 4B). أظهرت الأجنة حقن في هذه المراحل نمو البكتيريا داخل صفار البيض وانتشار البكتيريا من خلال الجنين (الشكل 7). قدم العدوى مع كل من السلالات في المراحل المبكرة نمو البكتيريا المعمم غير محددة مما يؤدي إلى موت الأجنة بعد 4 نقطة في البوصة. من ناحية أخرى، في الأجنة حقن في مراحل لاحقة كان مقتصرا عبء البكتيرية للصفار. المقبل، presorting مع الجسيمات الكبيرة تدفق عداد الكريات (الشكل 1B) ولدت مجموعات متجانسة كبيرة من الأسماك المصابة باستثناء الأجنة المصابة غير الحكومية أو غاية (أرقام 5A 6A و). بعد presorting، M. وعولج الأجنة المصابة marinum مع ريفامبيسين، وهو أول دواء خط لسل. أظهرت دراسات سابقة أن العلاج مع ريفامبيسين بجرعة 200 ميكرومتر يقلل كفاءة M. عدوى marinum في الزرد 7، 13. أخذ الميزه(ه) من عدد كبير من الأجنة المصابة متجانس ولدت مع إنتاجية عالية الإعداد والعلاج أجريت مع جرعات مختلفة. أجنة مصابة M. أظهرت marinum M سلالة وعلاجها لمدة 48 ساعة مع 12، 24، و 200 ميكرومتر ريفامبيسين للحد من العدوى الفطرية بكفاءة في جرعة تبعا للطريقة (الشكل 5B). نظرا لانخفاض كفاءة للعدوى باستخدام ريفامبيسين بجرعة 200 ميكرومتر كان يستخدم هذا التركيز على التجارب في المستقبل. تمشيا مع النتيجة السابقة، ودراسة تطور عبء البكتيرية باستخدام M. سلالة marinum E11 لوحظ انخفاض كبير على مدار 24 ساعة وما بعده بعد العلاج مع 200 ميكرومتر ريفامبيسين (الشكل 6B). علاوة على ذلك، إذا كان مطلوبا التصوير التكبير عالية من هذه الأجنة، يمكن عرضها تلقائيا في لوحات 96 جيدا (الشكل 1C)، من حيث يمكن تحليل العينات باستخدامنظام تكنولوجيا الفرز الآلي الفقارية مع الجسيمات عينات كبيرة شنت على لCLSM. نظام تكنولوجيا الفرز الآلي الفقارية مع الجسيمات عينات كبيرة هو النظام الذي يمكن إما أن يتم تنظيمها في الصعود إلى CLSM أو المجهر ستيريو. هذا الجهاز يسمح التحميل من أجنة حية أو الثابتة من 96 لوحة جيدا أو حاوية السوائب تلقائيا من خلال الزجاج الشعرية، ويرشد ذلك أمام الكاميرا في زاوية المطلوب (على سبيل المثال، أو الظهرية الجانبية). ويمكن إجراء صور للجنين في جميع التوجهات مع كاميرا على متن الطائرة أو مع CLSM الخارجية (الشكل 7). وبعد ذلك يتم نقل الأجنة في حاويات خاصة لجمع النفايات أو. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> الشكل 1. outl التجريبية تعميمالمعهد الوطني للإحصاء. أ) يتم وضع الأسماك الكبار معا لزميله، يتم جمع البيض والانحياز إلى لوحة الاغاروز وحقن باء) يتم تحضين البيض حقن عند 28 درجة مئوية، وسيتم فرزها قبل للعلاج من المخدرات ممكن. C) تحليل لاحقة من قبل كبير تدفق الجسيمات عداد الكريات و / أو عينات الجسيمات الكبيرة / الفقارية الآلي تقنية فحص مع CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> الرقم 2. إنشاء خلية لأفضل مرحلة S. البشروية صفار الحقن. تم حقن الأجنة الزرد في صفار البيض في مراحل تنموية مختلفة 1-512 مرحلة الخلية مع 100 وت م س البشروية. حقن الأجنة بين 1 لأظهرت المرحلة الثانية 8 خلية نمو البكتيريا في صفار البيض وارتفاع معدل الوفيات من 4 نقطة في البوصة. أظهرت الأجنة حقن ما بين 16 و 128 خلية مرحلة نمو البكتيريا في صفار البيض وداخل الجسم ابتداء من الساعة 3 نقطة في البوصة. أظهرت الأجنة حقن بين المرحلة 256 و 512 خلية العديد من نمو البكتيريا داخل صفار البيض. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> الرقم 3. الكمي لعبء البكتيرية باستخدام تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة. 100 وت م س تم حقن البشروية في صفار البيض من الأجنة الزرد. A) حتى 5 نقطة في البوصة، كل يوم، وكانت مجموعات من 10 أجنة المتجانس ومطلي مباشرة، والتي تبين أن متوسط ​​النمو الأسي على أساس نسختين متماثلتين البيولوجية (أشرطة الخطأ= SEM). B) كبير تدفق الجسيمات عداد الكريات تحليل يبين متوسط ​​إشارة مضان من غير حقن وS. حقن الأجنة البشروية. وقد تم تحليل 30-160 الأجنة في حالة (أشرطة الخطأ = SEM)، ورسائل مختلفة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية عن طريق واحد أنوفا تليها اختبار توكي بعد مخصصة (P &lt;0.001)، نانوثانية: لا فروق ذات دلالة إحصائية C) العلاقة بين وت و متوسط ​​إشارة مضان من مجموعات من 10 S. إصابة الأجنة البشروية (أشرطة الخطأ = SEM). تم تعديل هذا الرقم من فينمان وآخرون (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> الشكل 4. establis لhment من أفضل مرحلة الخلية لM. marinum صفار الحقن. تم حقن الأجنة الزرد في جميع مراحل تنموية مختلفة 1-512 المرحلة زنزانة مع 30 وت م. marinum E11 وM السلالة. A، B) حقن الأجنة 1-8 مرحلة الخلية أظهرت مماثلة الانتشار والوفيات مع كل السلالات. حقن) الأجنة بين 16-128 مرحلة الخلية مع سلالة E11 أظهرت تشكيل حبيبية والعدوى النظامية في حين أن حقن أبقى من 256 إلى 512 مرحلة الخلية البكتيرية العبء في صفار البيض. B) الأجنة حقن بين 16-64 مرحلة الخلية مع M سلالة أظهرت تشكيل الورم الحبيبي مثل الهياكل والعدوى النظامية في حين أن حقن 128-512 مرحلة الخلية البكتيرية أبقى العبء في صفار البيض . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo: محتوى العرض = &quot;5IN&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; الرقم 5. معاملة M. العدوى الحادة marinum مع المخدرات الخط الأول المضادة للسل. حقن الأجنة بين 16-64 مرحلة الخلية مع 30 وت م. تم تشغيل marinum M سلالة من خلال تدفق عداد الكريات الجسيمات الكبيرة في 3 نقطة في البوصة ليتم فرزها في مجموعتين بعد التخلص من غير و / أو الأجنة المصابة للغاية. A) الإسفار الأجنة الفردية في كلا المجموعتين. B) الأجنة تعامل مع ريفامبيسين (RIF ) لمدة 48 ساعة على جرعات من 12، 24، وحللت 200 ميكرومتر في 4 نقطة في البوصة؛ يتم تخفيض حمولتها البكتيرية بشكل كبير. C) لمحات COPAS الممثل الأجنة تعامل مع DMSO وريفامبيسين في جرعة من 12، 24، و 200 ميكرومتر لمدة 24 ساعة. يشار الحمولة الجرثومية والتوزيع من قبل القمم الحمراء. الخط الازرق يمثل الملف الشخصى عنصر فرز (4 DPF ه الزردmbryo) من قبل COPAS. وقد تم تحليل 60-90 الأجنة في حالة. كل نقطة بيانات يمثل الجنين الفردية. يشار إلى القيم كما يعني ± SEM. نانوثانية: الفروق لم تكن كبيرة. تم إجراء تحليل دلالة إحصائية الخلافات عن طريق واحد أنوفا تليها اختبار توكي posthoc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> الرقم 6. علاج M. marinum عدوى مزمنة مع أول دواء خط لسل. حقن الأجنة بين 16-64 مرحلة الخلية مع 30 وت م. تم تشغيل سلالة marinum E11 من خلال تدفق الجسيمات الكبيرة في عداد الكريات 3 نقطة في البوصة ليتم فرزها في مجموعتين بعد التخلص من غير و / أو الأجنة المصابة للغاية.<html> A) الإسفار الأجنة الفردية في كلا المجموعتين. B) وقد تم تحليل الأجنة تعامل مع ريفامبيسين (RIF) في 200 ميكرومتر خلال 4 أيام مما يدل على انخفاض كبير في الحمولة الجرثومية بعد 1 يوم من العلاج. وقد تم تحليل 90 الأجنة في حالة. يشار إلى القيم كما يعني ± SEM. رسائل مختلفة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين نقاط الوقت من نفس العلاج. * يشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية مع المجموعة الضابطة. نانوثانية: الفروق لم تكن كبيرة. تم إجراء تحليل دلالة إحصائية الخلافات عن طريق واحد أنوفا تليها اختبار posthoc توكي. (P &lt;0.05). تم تعديل الرقم B) من Spaink وآخرون (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> hres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. نتيجة M. تصوير marinum E11 حقن صفار باستخدام الفقارية الآلي تكنولوجيا الفحص وCLSM. متحد البؤر Z المكدس (مخيط 3 صور) من 5 نقطة في البوصة fli1-EGFP 14 الجنين. أ) الجنين لايف انتشار عرض من م. البكتيريا marinum E11 (الأحمر) في جميع أنحاء الجسم. B) ثابت 5 نقطة في البوصة FLI-EGFP الجنين تظهر M. البكتيريا marinum E11 (الأحمر) في جميع أنحاء الجسم توطين شارك مع كريات الدم البيضاء (الضوء الأزرق) الكشف عنها بواسطة L-15 بلاستين المناعية.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discover

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

توضح هذه المقالة الفيديو خط أنابيب الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لتصيب وتحليل أعداد كبيرة من الأجنة الزرد توفير أداة قوية جديدة لاختبار المركب واكتشاف المخدرات باستخدام كله كائن فقاري الحيوان.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

establishment-optimization-high-throughput-setup-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K Views.  Leiden University.  توضح هذه المقالة الفيديو خط أنابيب الإنتاجية العالية التي أنشئت بنجاح لتصيب وتحليل أعداد كبيرة من الأجنة الزرد توفير أداة قوية جديدة لاختبار المركب واكتشاف المخدرات باستخدام كله كائن فقاري الحيوان. 

Video: Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

تحليل 18"فدج التصوير" PET/CT كأداة لدراسة بكتريا السل العدوى والعلاج في الإنسان عدم الرئيسات

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

نموذج الماوس لتقييم الفطرية الاستجابة المناعية للعدوى المكوّرات العنقودية الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...