The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.

בצע את פרוטוקולי הניסוי כאן לפי הסדר המתואר להלן. פרוטוקולי microfabrication ליצירת פלטפורמת microfluidic נדונים בשלב 1 שלב 2 מתאר את פרוטוקול תרבית החיידקים (איור 2), ושלב 3 נוגע להרכבה של ההתקנה הניסיונית (איור 3). לבסוף, הצעד הניסיוני בפועל מתואר בשלב 4. .1 נוהל ייצור שבבים הערה: נהלי בטיחות נאותה חייבים להיות במעקב במשך התהליכים שתוארו להלן. התייעץ עם קצין הבטיחות המוסדי לקבלת פרטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצב את המסכה עם תוכנה מתאימה (למשל, L-Edit). עיצוב הערוץ מורכב ממייקרו ערוץ עיקרי של 625 רוחב מיקרומטר. האזור של הערוץ המרכזי מכיל מערך של מיקרו הודעות 50 מיקרומטר בקוטר, במרווחי 25 מיקרומטר זה מזה (ראה משלים קבצים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדפיס את העיצוב הזה על זכוכית &quot;x 5&quot; סיד כוס סודה (5), שבה יש עובי של 0.09 &quot;, והוא מצופה בכ 70 שכבה עבה ננומטר של כרום (Cr), באמצעות מיסוך על מנת להכין מסכת תמונה. מפתח השתמש AZ400K דקות 1. אז, לחרוט שכבת Cr באמצעות etchant Cr כ 1 דקות השתמשו אצטון להתפשט להתנגד ולנקות אותו עם פתרון פיראניה קר. (H 2 SO 4 וH 2 O 2 ביחס של 3: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photolithography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה פרוסות סיליקון 4 &quot;סטנדרטית כימי עם פתרון פיראניה עבור 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הרקיק עם מים די ולייבש אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הרקיק על פלטה חשמלית (200 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל פרוסות סיליקון עם photoresist. כאן, AZ4620 photoresist החיובי ספין מצופה על פרוסות סיליקון ב2,000 סל&quot;ד 25 שניות כדי לקבל שכבה עבה 12.5 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הממס על ידי אפייה רכה של הרקיק על פלטה חשמלית על ידי צף הרקיק ל90 שניות על זרימת חנקן ב 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשמור אותו בואקום ב tהוא אותה טמפרטורה ל60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות בתיבה כהה ל24 שעות להתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הרקיק לאור UV כדי להעביר את הדפוס שנועד photoresist. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את פרוסות בפתרון מפתח photoresist (AZ400K) ל240 שניות. לאחר מכן, יש לשטוף את הרקיק עם אלכוהול איזופרופיל ולייבש אותו על ידי הצבת בזרם של גז חנקן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך - ICP-DRIE (ריאקטיבי העמוק יון תחריט פלזמה מצמידים אינדוקטיבי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תחריט DRIE. בחר את העומק לחרוט המתאים בהתאם לעומק סופי הנדרש למכשיר (50 מיקרומטר בחקירה זו). Photoresist פועל כשכבת מיסוך במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את photoresist שנותר עם אצטון ולנקות את הרקיק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS יציקה (polydimethylsiloxane) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש trichloromethylsilane (TCMS) לsilanizing עובש אב סיליקון. יוצקים 2 או 3 טיפות של trichloromethylsilane בבקבוקון ולמקם אותו בתא ייבוש לידעובש אב סיליקון. לאפשר 2-3 שעות לתהליך silanizing כדי להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכל נפרד, מערבב את בסיס סיליקון Sylgard 184 עם סוכן ריפוי על ידי יחס בין משקל 10: 1 להכין PDMS. דגה PDMS על ידי הכפפתו לואקום תנאים (כ 2 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עובש אב סיליקון בבעל. , ואז לשפוך את PDMS על עובש אב סיליקון כדי ליצור את חותמת PDMS. ודא שבועות לא יוצרות בPDMS במהלך תהליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את PDMS לשעה 2 ב 80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלפתי את חותמת PDMS מתבנית האב. לאחר מכן, חותך את PDMS להחתים לתוך שבבים נפרדים. לבסוף, להשתמש בליבת חיתוך לקדוח חורים לכניסה (ים) ושקע (ים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מליטה של ​​PDMS לזכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את תלוש לכסות וחותמת PDMS לפלזמת חמצן ל30 שניות. חותמת בונד PDMS ללהחליק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג אטימה ראויה בין חותמת PDMS ולהחליק את המכסה, לחשל את המכשיר על ידי לשים אותו בתנור ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li&gt; </ol></li></ol> .2 בקטריאלי תרבות הערה: פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים נכון חייבת להיות במעקב במשך השלבים 2-4. התייעץ עם קצין הבטיחות המוסדי לקבלת פרטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות LB אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אגר 20 גרם לוריא-Bertani (LB) אבקות (מילר) ו500 מ&quot;ל מים ultrapure בבקבוק 1 ליטר. מערבבים להמסת האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ידי מעוקר ב 15 psi, 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את הבקבוק להתקרר ל50-55 ° C על ספסל או באמבט מים במכסת מנוע הבטיחות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את טטרציקלין האנטיביוטיקה כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. מערבבים היטב על ידי מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לתוך צלחות. ממלא כל צלחת עד 1/2 - מלא 2/3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר להבת בועות בקצרה כדי פופ אותם אם הם יוצרים. בועות אוויר הקרושה קשות כדי להפיץ את תרבות חיידקים על פני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הצלחות להתקרר בטמפרטורת חדר למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הם מגניבים,לשים צלחות בחזרה לשרוול שלהם, לאטום את השקית, תווית (אנטיביוטיקה ותאריך), ולאחסן ב 4 ° C.. הערה: כסה את המלאי של צלחות עם נייר אלומיניום, כמו אור מנטרל אנטיביוטיקה רבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB מרק הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מרק אבקות גרם לוריא-Bertani (LB) (מילר) ו1 ליטר של מים ultrapure לבקבוק. מערבבים להמסת האבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ידי מעוקר ב 15 psi, 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר בקבוק להתקרר ל50-55 ° C על ספסל או באמבט מים במכסת מנוע הבטיחות הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את טטרציקלין האנטיביוטיקה כדי להשיג ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. מערבבים היטב על ידי מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קריר, למקם את הבקבוק שכותרתו ב 4 ° C.. הערה: כסה את הבקבוק עם נייר אלומיניום, כמו אור מנטרל אנטיביוטיקה רבות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקים תרבות על צלחת LB אגר (פרוטוקול זה משתמש Pseudomonas fluorescens) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את מניית החיידקים מהמקפיא (-80 °; C) ולמקם אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את -80 ° C מניית החיידקים וצלחת אגר LB בתוך ברדס בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak זן החיידקים על גבי צלחת אגר LB בדגם זגזג. מכסה את הצלחת אגר ודגירה אותו ב30 ºC לילה. לבסוף, לאחסן את הצלחת במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון בקטריאלי (S1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50 מ&quot;ל תקשורת מרק LB לבקבוק autoclaved. ביצוע פעולה זו בתוך ברדס בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מושבת חיידקים אחת מהצלחת אגר LB לבקבוק. גם פעולה זו צריכה להתבצע בתוך ברדס בטיחות ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הבקבוק בחממה שייקר ב30 מעלות צלזיוס ו150 סל&quot;ד מספיק זמן (4 שעות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדולל בקטריאלי הפתרון (S2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 5 מ&quot;ל תקשורת מרק LB לתוך צינור פלסטיק מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל S1 על ידי ערבוב עם תקשורת מרק LB. ואז, מערבולת הפתרון. לדלל את הפתרון להשיג אופטי הרצוייםצפיפות אל (OD נמדד ב 600 ננומטר = 0.1). הערה: ניסויי Biofilm בדרך כלל להעסיק ערכי OD בסביבה זו. </li></ol></li></ol> .3 הכן את הגדרת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינצטה באמצעות חיבור צינורות גמישים מפלסטיק (0.20 &quot;ID) לכניסה (ים) ושקע (ים) של השבבים. פתחי הכניסה ושקעים שנקדחו בעבר לחלק PDMS של השבב האלקטרוני (צעד 1.5.5). בחקירה זו , השבב האלקטרוני מורכב משני פתחי הכניסה ויציאה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק (ים) עם פתרון חיידקים (פתרון S2) ולהסיר את כל הבועות במזרק (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה מזרק (ים) (30 0.5 &quot;מחט קהה G) לתוך צינור יניקה (ים). ואז, לחבר את הצינור לשקע (ים) לבזבז מיכל. </li></ol> .4 הפעל את הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המזרק (ים) ועד לקצה המזרק (ים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ומזרק תיקון (ים) על משאבת המזרק. לאחר מכן למקם את השבב תחת מיקרוסקופ אופטי עם עדשות אובייקטיביות של דסירהגדלת ed (למשל, 40X). כסה השבב האלקטרוני עם מכשיר קאמרי תא חי כדי לשמור על סביבת טמפרטורה קבועה להתפתחות חיידקים (C ° 30 לפ fluorescens). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשאבה לרמת קצב זרימה הרצויה (למשל 10 μl / hr) וליזום שאיבת נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שחיידקים הם הציגו לתוך התא, היווצרות biofilm גם יזם. היווצרות biofilm והתבגרות מתרחשות בדרך כלל על פני תקופה של כמה שעות או אפילו ימים. להתבונן ולקחת תמונות של צמיחת biofilm מבעד למיקרוסקופ. </li></ol>

<ol>
	<li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms:+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections.">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Wong, G. C. L., O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+together+now:+Integrating+biofilm+research+across+disciplines.">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li><li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow.">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).</li><li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers.">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li><li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems.">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li><li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems.">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li><li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows.">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li><li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems.">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media.">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li><li>Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).</li><li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil.">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li><li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets.">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li><li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms.">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li><li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media:+energy+applications.">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנחנו הפגנו מכשיר microfluidic פשוט המחקה תווך נקבובי ללימוד פיתוח biofilm בבתי גידול מורכב. יש כמה שלבים קריטיים המכתיבים את תוצאות הניסויים. הם כוללים גיאומטריה מכשיר. בעוד בהודעה הגיאומטריה יכולה להשתנות, נקבובי המרחב מספיק לסרטים כדי ליצור יש צורך. יתר על כן, Valiei et al. <...

לאחרונה, הפגנו דינמיקת היווצרות biofilm חיידקים במכשיר microfluidic המחקה תווך נקבובי 1. biofilms חיידקים הם למעשה מושבות של חיידקי משטח מצטבר שנארזות על ידי חומרים תאיים פולימרים (EPS) 2-4. סרטים דקים אלה של חיידקים יכולים להיווצר כמעט בכל נישה אפשרית, החל ממשטחים חלקים לגידול הרבה יותר מורכב של תווך נקבובי. Valiei et al. 1 משמש מכשיר microfluidic עם מערך של מיקרו עמודים כדי לדמות מבנה תווך נקבובי ולמד היווצרות biofilm במכשיר זה כפונקציה של קצב זרימת נוזל. הם מצאו כי בזרימה משטר מסוים, biofilms הסיבי הידוע בסרטים החל לצוץ בין עמודים שונים. יכולים להיות קשורים סרטים באחד או בשני קצוות למשטחים מוצקים, אבל שאר המבנה מושעה בנוזל. היווצרות Streamer בדרך כלל מתחילה לאחר שכבה ראשונית של biofilm יצרה והפורמט שלהיון יכול להכתיב את ההתפתחות ארוכת הטווח של biofilm בבתי גידול מורכב כאלה. לאחרונה, מספר חוקרים חקרו את הדינמיקה של היווצרות נחלים. יזדי et al. 5 הראה כי הסרטים יכולים להיווצר בתזרים טרנדו שמקורם בבועת נדנוד. בניסוי אחר, רוסקוני et al. 6 חקר את ההשפעה של עקמומיות ערוץ וגיאומטריה ערוץ על ההיווצרות של סרטים. הם מצאו כי הסרטים יכולים ליצור בסעיפים מעוגלים של microchannels, ומורפולוגיה נחלים קשורה לתנועתיות. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי סרטים יכולים להיות לו השלכות רחבות בתרחישים טבעיים ומלאכותיים שונים כפי שהם יכולים לפעול כמבשרים להיווצרות של מבנים בוגרים בממשקים נקבוביים, יובילו להתפשטות biofilm מהירה והרה אסון במערכות ביו, וגם לגרום לflow- המשמעותי אינטראקציות מבנה, וכו &#39;1,7-9. לעתים קרובות סרטי biofilm טופס Iבתי גידול n מורכבים כגון תווך נקבובי. צמיחת biofilm הבנה בסביבה תקשורתית נקבובית היא רלוונטית למספר תהליכים סביבתיים ותעשייתיים כגון טיפול ביולוגי בשפכים 10, שמירה גם נשא שלמות במצבים כגון CO 2 ללכוד 11 וחיבור של הנקבוביות באדמה 12. התבוננות היווצרות biofilm בבתי גידול מורכב כזה יכול לעתים קרובות להיות מאתגרת בשל האטימות של תווך נקבובי. במצבים כאלה, פלטפורמות תווך נקבוביות מיקרופלואידיקה מבוססת יכולות להוכיח יתרון מאוד מאחר שהם מאפשרים בזמן אמת ובניטור באתר. יתרון נוסף של מיקרופלואידיקה הוא היכולת לבנות bioreactors מרובה בפלטפורמה יו-microfluidic אחת ובו זמנית לאפשר לניטור ו / או שילוב של חיישנים מקוונים. הגמישות ליישם ניסויי מעבדה מרובים במכשיר אחד ואת היכולת לאסוף נתונים רלוונטיים משמעותיים לניתוח סטטיסטי מדויק היא עו&quot;ד חשובantage של מערכות microfluidic 13,14. בהקשר של הדיון לעיל, דינמיקת היווצרות נחלים הבנה בסביבה תקשורתית נקבובית תהיה מועילה למספר יישומים. במחקר זה, אנו מפתחים פרוטוקול לחקירת היווצרות נחלים במכשיר שתווך נקבובי מחקה. ייצור של פלטפורמת microfluidic, צעדים דרושים לתרבית תאים וניסויים מתוארים. בניסויים שלנו, זן חיידקים מהסוג בר של fluorescens Pseudomonas הועסק. פ fluorescens, נמצא באופן טבעי באדמה, ממלא תפקיד מרכזי בשמירה על האקולוגיה קרקע 15. זן החיידקים המועסקים היה מהונדס גנטי כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) constitutively.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1038">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:339px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Flourescent Microscope</td>
			<td style="width:255px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">LB agar</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1425-500</td>
			<td>suspend 40 g in 1 L of purified water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">LB broth</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-500</td>
			<td>suspend 20 g in 1 L of purified water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Biosafety hood</td>
			<td style="width:255px;">Microzone corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Petri-dish</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">875712</td>
			<td>sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:325px;">Incubator shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:339px;">Excella E24incubator shaker series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL sterilized centrifuge tube</td>
			<td style="width:255px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td>Polypropylene Rnase-/Dnase-free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Tetracycline free base</td>
			<td style="width:255px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">103012</td>
			<td>50 ug/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">SYLGARD 184 silicone</td>
			<td style="width:255px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:119px;">68037-59-2</td>
			<td>Elastomer Base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Positive photoresist (AZ4620)</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:325px;">Plastic tube</td>
			<td style="width:255px;">Cole- Parmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars

כמה מינים של חיידקים בעלי היכולת לצרף למשטחים וליישב אותם בצורה של סרטים דקים שמכסים. Biofilms שגדלים בתווך נקבובי רלוונטי לכמה תהליכים תעשייתיים וסביבתיים כגון טיפול בשפכים וCO 2 קיבוע. אנחנו השתמשנו Pseudomonas fluorescens, חיידק אירובי גראם שלילית, לחקור היווצרות biofilm במכשיר microfluidic שמחק תווך נקבובי. מכשיר microfluidic מורכב ממערך של מיקרו הודעות, שהיו מפוברקים באמצעות רכה ליתוגרפיה. בהמשך לכך, היווצרות biofilm במכשירים אלה עם זרימה נחקרה ואנחנו מדגימים את היווצרות biofilms הסיבי הידוע בסרטים במכשיר שלנו. הפרוטוקולים מפורטים לייצור והרכבה של מכשיר microfluidic מסופקים כאן יחד עם פרוטוקולי תרבות החיידקים. נהלים מפורטים לניסויים עם מכשיר microfluidic גם מוצגים יחד עם נציגתוצאות.

באמצעות פרוטוקול microfabrication שהוזכר לעיל, מכשיר microfluidic מבוסס PDMS נבנה. איור 1 מציג את מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק (SEM) תמונות של PDMS מכשיר. איור 1 א מציג את סעיף הכניסה של המכשיר. כניסה כמו מזלג נוצרה כדי להשוות ראש בלחץ על פני המכשיר. הדמיה SEM נוספת הראתה גם ?...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars at JoVE.com

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.1K Views.  University of Alberta. Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated. 

Video: Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

ניתוח inhomogeneity ערבוב במכשיר microfluidic על ידי טכניקת microscale Schlieren

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

עמית תרבות Microbiome חי עם Microengineered אדם המעיים villi בתוך גוט-על-שבב מכשיר microfluidic

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

פלטפורמת מיקרופלואידיג לעירור כונדרוציטים עם דחיסה דינמית

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

התקנת התקן מיקרופלואידי לייצור תקע קומבינטורי

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

מחבר זרקור: שילוב גישות חישוביות וניסוייות באונקולוגיה מדויקת

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי לייצור תקע קומבינטורי

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...