Name: protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars at JoVE.com

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.

Führen Sie die Versuchsprotokolle hier in der unten beschriebenen Reihenfolge. Mikro Protokolle zum Erzeugen der Mikrofluid-Plattform in Schritt 1. Schritt 2 beschrieben wird die Bakterienkultur Protokoll (2) und Schritt 3 betrifft die Anordnung der Versuchsaufbau (Figur 3). Schließlich wird die tatsächliche Versuchsschritt in Schritt 4 beschrieben. 1. Chipfertigungsverfahren HINWEIS: Die richtige Sicherheitsverfahren muss für die unten beschriebenen Verfahren befolgt werden. Wenden Sie sich an den institutionellen Sicherheitsbeauftragten für Details. <ol><li> Entwerfen Sie die Maske mit einer geeigneten Software (zB L-Edit). Der Kanal-Design besteht aus einem Hauptmikrokanal mit einer Breite von 625 um. Der zentrale Bereich des Kanals enthält ein Array von Mikrostellen 50 um Durchmesser, 25 um voneinander beabstandet sind (siehe Zusatzdateien). </li><li> Drucken Sie diesen Entwurf auf Glas (5 &quot;x 5&quot; Soda-Kalk-Glas), Die eine Dicke von 0,09 &quot;hat und von etwa 70 nm dicke Schicht aus Chrom (Cr) beschichtet, mit Maskierung, um eine Fotomaske vorzubereiten. Verwenden AZ400K Entwickler für 1 min. Dann Ätzen der Cr-Schicht mit Cr-Ätzmittel für ca. 1 min mit Azeton Streifen der Resist und reinigen Sie es mit kaltem Piranha-Lösung. (H 2 SO 4 und H 2 O 2 in einem Verhältnis von 3: 1). </li><li> Photolithographie <ol><li> Reinigen Sie ein Standard-4 &quot;Silizium-Wafer chemisch mit Piranha-Lösung für 20 min. </li><li> Spülen Sie die Wafer mit DI-Wasser und trocknen. </li><li> Heizen den Wafer auf einer heißen Platte (200 ° C für 15 min). </li><li> Beschichtung der Silizium-Wafer mit Fotolack. Hier ist der positive Photoresist AZ4620 wurde auf einem Siliziumwafer für 25 Sekunden Spin-beschichtet bei 2000 UpM auf eine 12,5 um dicke Schicht zu erhalten. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels durch alle weichen Backen der Wafer auf einer heißen Platte durch Floaten der Wafer 90 s lang bei einem Stickstoffstrom bei 100 ° C aufweist. Dann halten Sie es im Vakuum bei ter dieselbe Temperatur für 60 Sekunden. </li><li> Legen Sie die Wafer in einem dunklen Kasten für 24 Stunden zur Entwässerung. </li><li> Setzen Sie das Wafer mit UV-Licht, um die entworfenen Muster auf den Fotolack übertragen. </li><li> Tauchen Sie die Wafer in Photoresist-Entwicklerlösung (AZ400K) für 240 Sekunden. Dann spülen Sie die Wafer mit Isopropyl-Alkohol und trocknen Sie es, indem Sie in einem Strom von Stickstoffgas. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (Induktiv gekoppeltes Plasma - Deep Reactive Ion Etching) Prozess <ol><li> Gelten DRIE Ätzen. Wählen Sie die entsprechende Ätztiefe nach Endtiefe für Gerät erforderlich (50 um in dieser Untersuchung). Photoresist wirkt als Maskierungsschicht während dieses Prozesses. </li><li> Das restliche Photolack mit Aceton und reinigen Sie den Wafer. </li></ol></li><li> PDMS (Polydimethylsiloxan) Casting <ol><li> Verwenden Trichlormethylsilan (TCMS) für Silanisierung des Silizium Master-Form. Gießen Sie 2 oder 3 Tropfen Trichlormethylsilan in einem Fläschchen und legen Sie sie in einem Exsikkator neben demSilizium Master-Form. Lassen Sie 2-3 Stunden für die Silanisierung Vorgang abgeschlossen ist. </li><li> In einem separaten Behälter, mischen die Sylgard 184 Silikonbasis mit Härter Gewichtsverhältnis von 10: 1 bis PDMS vorzubereiten. Entgasen PDMS, indem man es Bedingungen (etwa 2 h) Vakuum. </li><li> Setzen Sie den Silizium Master-Form in einer Halterung. Dann gießen Sie die PDMS auf dem Silizium-Master-Form, um die PDMS-Stempel zu bilden. Sicherzustellen, dass keine Blasen in dem PDMS bilden bei diesem Vorgang. </li><li> Heilen die PDMS für 2 Stunden bei 80 ° C. </li><li> Ziehen Sie die PDMS-Stempel von der Master-Form. Dann schneiden die PDMS-Stempel in separate Mikrochips. Schließlich verwenden einen Schneidkern, um Löcher für den Einlass (en) und Steckdose (n) zu bohren. </li></ol></li><li> Verklebung von PDMS zu Glass <ol><li> Setzen Sie das Deckglas und PDMS-Stempel Sauerstoffplasma für 30 Sekunden. Bond PDMS-Stempel auf das Deckglas. </li><li> Um eine einwandfreie Abdichtung zwischen der PDMS-Stempel und dem Deckglas zu erreichen, zu tempern das Gerät, indem es in einem Ofen bei 70 ° C für 10 min. </li&gt; </ol></li></ol> 2. Bakterienkultur HINWEIS: Das richtige Biosicherheit Protokolle müssen für die Schritte 2-4 befolgt werden. Wenden Sie sich an den institutionellen Sicherheitsbeauftragten für Details. <ol><li> Bereiten LB-Agar-Platten <ol><li> 20 g Luria-Bertani (LB)-Agar (Miller)-Pulver und 500 ml ultrareinem Wasser in einen 1-l-Kolben. Rühren, um das Pulver aufzulösen. </li><li> Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 psi, 121 ° C für 15 min. </li><li> Lässt man den Kolben auf 50-55 ° C auf einer Bank oder in einem Wasserbad in der Biosicherheit Haube abkühlen. </li><li> Hinzufügen des Antibiotikums Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erreichen. Gut mischen durch Verwirbelung. </li><li> Gießen Sie die Mischung in Platten. Füllen Sie jede Platte bis 02.01 - 03.02 voll. </li><li> Flamme Luftblasen kurz zu Pop, wenn sie zu bilden. Erstarrten Luftblasen sind schwer zu Bakterienkultur über zu verbreiten. </li><li> Die Platten werden bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen. </li><li> Wenn sie cool sind,legte Platten wieder in ihre Hülle, den Beutel, Etikett (Antibiotikum und Datum), und bei 4 ° C. HINWEIS: Decken Sie das Lager von Platten mit Alufolie als Licht deaktiviert viele Antibiotika. </li></ol></li><li> LB Broth Herstellung <ol><li> 20 g Luria Bertani (LB)-Medium (Miller) Pulver und 1 l Reinstwasser in einen Kolben. Rühren, um das Pulver aufzulösen. </li><li> Sterilisieren durch Autoklavieren bei 15 psi, 121 ° C für 15 min. </li><li> Ermöglichen Kolben auf 50-55 ° C auf einer Bank oder in einem Wasserbad in der Biosicherheit Haube abkühlen. </li><li> Hinzufügen des Antibiotikums Tetracyclin bis zu einer Endkonzentration von 50 ug / ml zu erreichen. Gut mischen durch Verwirbelung. </li><li> Wenn kühl, legen Sie die etikettierte Flasche bei 4 ° C. HINWEIS: Decken Sie die Flasche mit Alufolie als Licht deaktiviert viele Antibiotika. </li></ol></li><li> Kulturbakterien auf einer LB-Agarplatte (Dieses Protokoll verwendet Pseudomonas fluorescens) <ol><li> Nehmen Sie die bakterielle Lager aus dem Gefrierschrank (-80 °, C) und legen Sie es auf Eis. </li><li> Legen Sie die -80 ° C bakterielle Lager und eine LB-Agar-Platte in einem biologischen Sicherheits Kapuze. </li><li> Streifen der Bakterienstamm auf eine LB-Agar-Platte in einem Zickzackmuster. Decken Sie die Agar-Platte und Inkubation bei 30 ° C es über Nacht. Schließlich speichern Sie die Platte im Kühlschrank bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Bakterienlösung (S1) <ol><li> Gießen Sie 50 ml LB-Medium Medien zu einer autoklavierten Kolben. Führen Sie diesen Vorgang in einer biologischen Sicherheits Kapuze. </li><li> Übertragen einer einzelnen Kolonie von der LB-Agar-Platte in den Kolben. Dieser Vorgang sollte auch in einem biologischen Sicherheitshaube durchgeführt werden. </li><li> Setzen Sie den Kolben in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und 150 rpm für eine ausreichende Zeit (4 h). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die verdünnte Bakterienlösung (S2) <ol><li> Pour 5 ml LB-Brühe Medien in eine sterilisierte Kunststoffrohr. </li><li> Verdünnen S1 durch Mischen mit LB-Brühe Medien. Dann, Vortex die Lösung. Verdünnen Sie die Lösung zu dem gewünschten Optikal Dichte (OD bei 600 nm = 0,1 gemessen). HINWEIS: Biofilm Experimenten typischerweise OD-Werte in diesem Bereich. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie den Versuchsaufbau <ol><li> Mit einer Pinzette verbinden flexiblen Kunststoffrohren (0,20 &quot;ID) in den Einlaß (en) und Austrittsöffnung (en) des Mikrochips. Die Einlässe und Auslässe wurden zuvor in die PDMS Abschnitt der Mikrochip (Schritt 1.5.5) gebohrt. In dieser Untersuchung Der Mikrochip besteht aus zwei Eingängen und einem Ausgang. </li><li> Füllen Spritze (n) mit Bakterienlösung (S2-Lösung) und entfernen Sie alle Luftblasen in der Spritze (n). </li><li> Verbinden Spritze Spitze (n) (30 G 0,5 &quot;stumpfe Nadel) in Einlassrohr (en). Dann schließen Austrittsrohr (en) in den Behälter zu verschwenden. </li></ol> 4. Führen Sie das Experiment <ol><li> Die Spritze (s) an der Spitze der Spritze (s). </li><li> Ort und fix Spritze (s) auf die Spritzenpumpe. Dann legen Sie den Mikrochip unter einem optischen Mikroskop mit Objektiven von Desired Vergrößerung (zB 40x). Decken den Mikrochip mit einer lebenden Zelle Kammereinrichtung, um eine konstante Temperaturumgebung für das bakterielle Wachstum (30 ° C für P. fluorescens) aufrechtzuerhalten. </li><li> Stellen Sie die Pumpe auf den gewünschten Strömungsgeschwindigkeit der Pegel (zB 10 ul / h), und initiieren Flüssigkeitspump. </li><li> Wenn Bakterien in die Kammer eingeführt wird, wird auch die Biofilmbildung initiiert. Biofilmbildung und Reifung treten typischerweise über einen Zeitraum von mehreren Stunden oder sogar Tage. Beobachten und Bilder von Biofilmwachstum durch das Mikroskop. </li></ol>

<ol>
	<li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+web+of+streamers:+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device.">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li><li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Biofilms:+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections.">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li><li>Wong, G. C. L., O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+together+now:+Integrating+biofilm+research+across+disciplines.">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li><li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow.">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).</li><li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers.">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li><li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems.">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li><li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems.">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li><li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows.">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li><li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems.">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li><li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2.">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li><li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media.">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation.">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li><li>Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).</li><li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil.">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li><li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets.">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li><li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms.">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li><li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media:+energy+applications.">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir haben gezeigt, einen einfachen Mikrofluidik-Gerät, das poröse Medien für das Studium Biofilmentwicklung in komplexen Lebensräumen nachahmt. Es gibt mehrere wichtige Schritte, die das Ergebnis der Experimente bestimmen. Sie enthalten Gerätegeometrie. Während die Post Geometrie variieren kann, ist ausreichend Platz für porenLuftSchlangen zu bilden notwendig. Darüber hinaus Valiei et al. 1 haben gezeigt, dass Streamer Bildung nur in einer bestimmten Durchflussbereich auftritt. Bei Flussraten niedriger als ein Schwellenwert, kann es zu Verformungen von Biofilmen in Luftschlangen nicht beobachtet werden. Doch ab einer bestimmten Schwelle eine andere Durchflusswert kann Biofilm Bruch dominieren und die Bildung von Luftschlangen nicht erlauben. Ein weiteres Problem, das diese Experimente plagen kann, ist Gasblasen gefangen in der Mikro-Säulen-Array werden können. Normalerweise werden diese Blasen durch Erhöhen der Strömungsgeschwindigkeit zu Beginn und dann allmählich abnimmt sie auf den gewünschten Wert entfernt werden. Mikrofluidische Plattformenwie diese bieten mehrere Vorteile und nur wenige Einschränkungen. Die Plattform ermöglicht es uns, mit kleinen Kulturvolumina arbeiten, und hat die Flexibilität der Einbeziehung benutzerdefinierte Funktionen. Zum Beispiel können verschiedene poröse Strukturen durch Veränderung der geometrischen Parameter der Mikrosäulenanordnung simuliert werden. Auch Strukturen, die die statistische Struktur der realen porösen Medien nachahmen kann auf mikrofluidische Plattformen 18 hergestellt werden. Darüber hinaus können mehrere derartige Kanäle auf einer einzigen Vorrichtung, die für die Sammlung von signifikanten relevanten Daten für eine präzise statistische Analyse durchgeführt werden. Jedoch mikrofluidische Systeme imitieren typischerweise zweidimensionale Struktur von porösen Medien. Geräte, die die dreidimensionale Natur der porösen Medien zu imitieren können, sind in der Regel ziemlich schwierig herzustellen. Entstehung und Entwicklung von Luftschlangen sind noch nicht gut verstanden, und weitere Forschungen in dieser Richtung erforderlich. Verständnis davon, wie Luftschlangen bilden und führen zu dem FormatIonen von reifen Biofilm Strukturen relevant für eine Vielzahl von Szenarien, einschließlich Verstopfen der biomedizinischen Vorrichtungen wie Herzstents Biofilmen im Boden und Filtersysteme sein. Unsere mikrofluidischen Plattform ist ein Schritt in diese Richtung.

Kürzlich haben wir gezeigt, bakterielle Biofilmbildung Dynamik in einem Mikrofluidik-Vorrichtung, die porösen Medien 1 nachahmt. Bakterielle Biofilme sind im Wesentlichen Kolonien von Bakterien, die Oberfläche aggregiert von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) 2-4 eingeschlossen sind. Diese dünnen Schichten von Bakterien bilden können, in fast jede denkbare Nische, die von glatten Oberflächen auf die viel komplexer Lebensraum von porösen Medien. Valiei et al. 1 verwendet eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einem Array von Mikrosäulen, um eine poröse Struktur zu simulieren und Medien untersucht Biofilmbildung bei dieser Vorrichtung als eine Funktion der Fluidströmungsrate. Sie fanden, dass in einer bestimmten Strömungsregime begann Faden Biofilme als Luftschlangen bekannt, zwischen verschiedenen Säulen entstehen. Schlangen können sich in einem angebunden werden, oder an beiden Enden an festen Oberflächen, aber der Rest der Struktur ist in Flüssigkeit suspendiert. Streamer Bildung beginnt in der Regel nach einer ersten Schicht von Biofilm gebildet hat sein Format undIonen können die langfristige Entwicklung der Biofilm in solchen komplexen Lebensräume diktieren. Vor kurzem haben mehrere Forscher die Dynamik der Streamer Bildung untersucht. Yazdi et al. 5 zeigte, dass die Luftschlangen können in Wirbelströme aus einer oszillierenden Blase Ursprung zu bilden. In einem anderen Experiment Rusconi et al. 6 untersucht die Wirkung der Kanalkrümmung und Kanalgeometrie auf die Bildung von Streamern. Sie fanden heraus, dass die Luftschlangen in gekrümmten Abschnitten von Mikrokanälen zu bilden, und Streamer Morphologie an Beweglichkeit zusammen. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Luftschlangen können weitreichende Auswirkungen in verschiedenen natürlichen und künstlichen Szenarien haben, wie sie als Vorläufer zur Bildung von reifen Strukturen in porösen Schnittstellen fungieren können, führen zu schnellen und katastrophalen Biofilm Proliferation in einer biomedizinischen Systemen und auch zu erheblichen Fluss Struktur-Wechselwirkungen, etc 1,7-9. Luftschlangen bilden Biofilm ich oftn komplexen Lebensräumen wie poröse Medien. Verständnis Biofilmwachstum in porösen Medien-Umgebung relevant zu mehreren ökologischen und industriellen Prozessen wie der biologischen Abwasserbehandlung 10, die Aufrechterhaltung Bohrloch Integrität in Situationen, wie beispielsweise CO 2 Erfassung 11 und ein Verstopfen der Poren im Boden 12. Beobachten Biofilmbildung in solchen komplexen Lebensräumen oft schwierig sein, aufgrund der Opazität des porösen Mediums. In solchen Situationen können Mikrofluidik basierend porösen Medien Plattformen sehr vorteilhaft erweisen, da sie in Echtzeit und in situ-Überwachung zu ermöglichen. Ein weiterer Vorteil der Mikrofluidik ist die Möglichkeit, mehrere Bioreaktoren auf einem Bio-Mikrofluidik-Plattform zu bauen und gleichzeitig ermöglichen die Online-Überwachung und / oder Einbau von Sensoren. Die Flexibilität, mehrere Laborversuche in einem Gerät und die Fähigkeit, signifikante relevanten Daten für eine präzise statistische Analyse zu sammeln implementieren ist ein wichtiger advantage von mikrofluidischen Systemen 13,14. In Zusammenhang mit der obigen Diskussion würde das Verständnis Streamer Bildung Dynamik in einem porösen Medium Umgebung vorteilhaft, mehrere Anwendungen. In dieser Studie, entwickeln wir das Protokoll für die Untersuchung von Streamer-Bildung in einem Gerät, das imitiert porösen Medien. Herstellung von mikrofluidischen Plattform, sind notwendige Schritte für die Zellkultur und Experimente beschrieben. In unseren Experimenten wurde die Wildtyp-Bakterienstamm Pseudomonas fluorescens beschäftigt. P. fluorescens, natürlich im Boden gefunden, spielt eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung der Bodenökologie 15. Der Bakterienstamm eingesetzt worden gentechnisch verändert, um das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimieren konstitutiv.

<table><tbody><tr><td>Flourescent Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>suspend 40 g in 1 L of purified water</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>suspend 20 g in 1 L of purified water</td></tr><tr><td>Biosafety hood</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish</td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 incubator shaker series</td></tr><tr><td>50 ml sterilized centrifuge tube</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polypropylene RNase-/DNase-free</td></tr><tr><td>Tetracycline free base</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &amp;#956;g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silicone</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomer Base and curing agent</td></tr><tr><td>Positive photoresist (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic tube</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol for biofilm streamer formation in a microfluidic device with micro-pillars

Verschiedene Bakterienarten besitzen die Fähigkeit, an Oberflächen anzubringen und zu kolonisieren sie in Form von dünnen Filmen als Biofilme bezeichnet. Biofilme, die in porösen Medien wachsen relevant sind mehrere Industrie-und Umweltprozesse, wie die Abwasserbehandlung und die CO 2-Sequestrierung. Wir verwendeten Pseudomonas fluorescens, ein gram-negatives Bakterium Aerobic, um die Biofilmbildung in einem mikrofluidischen Gerät, ahmt porösen Medien zu untersuchen. Mikrofluidik-Vorrichtung besteht aus einem Array von Mikrostellen, die unter Verwendung von Soft-Lithographie hergestellt wurden. Anschließend Biofilmbildung in diesen Geräten mit Fluss wurde untersucht, und wir zeigen die Bildung von Biofilmen als Fadenluftschlangen in unserem Gerät bekannt. Die detaillierten Protokolle für die Herstellung und Montage der Mikrofluidvorrichtung sind hier zusammen mit den Bakterienkulturprotokolle bereitgestellt. Detaillierte Verfahren für Experimente mit der mikrofluidischen Vorrichtung sind auch zusammen mit Vertreter vorgestelltErgebnisse.

Unter Verwendung des oben erwähnten Mikro Protokoll wurde eine PDMS basierend mikrofluidischen Vorrichtung konstruiert. 1 zeigt die rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen der PDMS-Gerät. 1A zeigt die Eingangsabschnitt der Vorrichtung. Ein gabelförmigen Eingang wird erstellt, um Druckkopf über das Gerät auszugleichen. Weitere REM-Aufnahmen zeigten auch, dass die Säulenwände fast senkrecht (Abbildung 1b). Die kultivierten Bakterienlösung (2) wurde verdünnt und seine optische Dichte auf einen Wert von 0,1 eingestellt. Wir untersuchten die Biofilmbildung in der mikrofluidischen Vorrichtung als eine Funktion der Eingangsvolumenstrom. Wenn P. fluorescens wurde bei einer niedrigen Flussrate von 0,8 ul / h, bakterielle Anlage in das Gerät injiziert und Biofilmbildung trat bei den Wänden des Geräts. Auch nach einem längeren Zeitraum (&gt; 20 h), keine anderen als Oberflächennahen Biofilmen bakterielle Strukturen, die wirwieder beobachtet. Als Nächstes wurde das gleiche Experiment mit einer Flussrate von 8 ul / h wiederholt. In diesem Fall begann die Biofilmbildung nach einigen Minuten der Infusion des verdünnten Bakterienkultur. Nach ein paar Stunden, Auftreten von filamentösen Strukturen, die sich zwischen Mikro-Säulen wurde in der Nähe des mittleren Abschnitts der Vorrichtung (4) beobachtet. Diese faserigen Strukturen können durch die Anwesenheit von unbeweglichen Bakterien visualisiert werden. Diese Strukturen werden als Schlangen bekannt und sie sind filamentöse Biofilmen, die nur an einem angebunden sind oder an beiden Enden an die Oberfläche. Der Rest der Struktur ist oft in dem flüssigen Medium (in diesem Fall) suspendiert. 4 zeigt die zeitliche Entwicklung der Biofilmstruktur Streamer. Schlangen bilden in der Regel durch die Wirkung von Fluid-Scher auf der viskoelastischen Biofilm. 5 zeigt die Stromlinien und Konturen für Geschwindigkeitsströmung über eine Reihe von Säulen. Die Simulation zeigt, dass die Luftschlangen, dassForm in unserem mikrofluidischen System werden im Wesentlichen entlang der Flüssigkeitsstrom Stromlinien ausgerichtet. Die Korrelation zwischen den Strömungsstrukturen und die Bildung von Biofilm Streamer wird noch nicht gut verstanden. Jedoch Das Kumar und 16 haben kürzlich vorgeschlagen, diese Schlangen bilden, wie hochviskosen flüssigen Zustand der eigen viskoelastischen Biofilmen. Sie stützten ihre Vermutung über die Beobachtung, dass die Zeitskala der Biofilmbildung Streamer die viskoelastischen Entspannung Zeitskalen von Biofilmen in der Regel weit übersteigt. Biofilme sind bekannt als viskoelastische Flüssigkeiten verhalten und somit auf Zeitskalen viel größer als das viskoelastische Relaxationszeit Maßstab sie im Wesentlichen so verhalten, als hochviskose Flüssigkeiten 17. Gemäß dieser Formulierung kann Schlangen erwartet werden, an Orten mit hoher Schubspannungen entstehen. Figur 5 zeigt die Positionen der hohen Geschwindigkeit in den Kanal, und diese Stellen übereinstimmen Stellen hoher Schubspannungen. In der Anfangs pha<html> se des Wachstums, sind Luftschlangen beobachtet, in der Nähe dieser Orte (Abbildung 4) stammen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51732/51732fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskop (SEM)-Bilder des Mikrofluidkanals (Draufsicht). a) Eingangssektion, b) Region enthält Mikro-Säulen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51732/51732fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51732/51732fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. aufeinanderfolgenden Schritten in Bakterienkultur beteiligt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51732/51732fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51732/51732fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. für mikrofluidische Experimente ein. 1-Lichtmikroskop (invertiert), 2-Spritzenpumpe, 3-Image-und Datenerfassung, 4-Spritze mit Farbstoff (optional), 5-Spritze, die Bakterien, 6-Abfallbehälter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51732/51732fig3large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51732/51732fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Evolution von Luftschlangen. Bild Ebene entspricht z = 25 um, dh Mitte des Geräts. Eine gestrichelte Ellipsen zeigen Biofilm Luftschlangen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51732/51732fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken</a>Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/51732/51732fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. Numerische Strömungssimulationen, die mechanischen Stromlinien und Geschwindigkeits Konturen der Umströmung Mikro-Säulen. Fluidstrom von oben nach unten und Geschwindigkeitsskala ist in m / Sek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51732/51732fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars at JoVE.com

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.1K Aufrufe.  University of Alberta. Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated. 

Serie: Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Fabrication and Visualization of Capillary Bridges in Slit Pore Geometry

A procedure for creating and imaging capillary bridges in slit-pore geometry is presented. High aspect ratio hydrophobic pillars are fabricated and functionalized to render their top surfaces hydrophilic. The combination of a physical feature (the pillar) with a chemical boundary (the hydrophilic film on the top of the pillar) provides both a physical and chemical heterogeneity that pins the triple contact line, a necessary feature to create stable long but narrow capillary bridges. The substrates with the pillars are attached to glass slides and secured into custom holders. The holders are then mounted onto four axis microstages and positioned such that the pillars are parallel and facing each other. The capillary bridges are formed by introducing a fluid in the gap between the two substrates once the separation between the facing pillars has been reduced to a few hundred micrometers. The custom microstage is then employed to vary the height of the capillary bridge. A CCD camera is positioned to image either the length or the width of the capillary bridge to characterize the morphology of the fluid interface. Pillars with widths down to 250 &#181;m and lengths up to 70 mm were fabricated with this method, leading to capillary bridges with aspect ratios (length/width) of over 1001.

A procedure for creating and imaging capillary bridges in slit-pore geometry is presented. The creation of capillary bridges relies on the formation of pillars to provide a directional physical and chemical heterogeneity to pin the fluid. Capillary bridges are formed and manipulated using microstages and visualized using a CCD camera.

Herstellung und Visualisierung von Kapillarbrücken in Schlitzporengeometrie

A procedure for creating and imaging capillary bridges in slit-pore geometry is presented. High aspect ratio hydrophobic pillars are fabricated and ...

Ingenieurwesen

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Biotechnik

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Umwelt

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

A Microfluidic Platform to Study Bioclogging in Porous Media

Bacterial biofilms are found in several environmental and industrial porous media, including soils and filtration membranes. Biofilms grow under certain flow conditions and can clog pores, thereby redirecting the local fluid flow. The ability of biofilms to clog pores, the so-called bioclogging, can have a tremendous effect on the local permeability of the porous medium, creating a pressure buildup in the system, and impacting the mass flow through it. To understand the interplay between biofilm growth and fluid flow under different physical conditions (e.g., at different flow velocities and pore sizes), in the present study, a microfluidic platform is developed to visualize biofilm development using a microscope under externally-imposed, controlled physical conditions. The biofilm-induced pressure buildup in the porous medium can be measured simultaneously using pressure sensors and, later, correlated with the surface coverage of the biofilm. The presented platform provides a baseline for a systematic approach to investigate bioclogging caused by biofilms in porous media under flow conditions and can be adapted to studying environmental isolates or multispecies biofilms.

The present protocol describes a microfluidic platform to study biofilm development in quasi-2D porous media by combining high-resolution microscopy imaging with simultaneous pressure difference measurements. The platform quantifies the influence of pore size and fluid flow rates in porous media on bioclogging.

Eine mikrofluidische Plattform zur Untersuchung von Bioverstopfung in porösen Medien

Bacterial biofilms are found in several environmental and industrial porous media, including soils and filtration membranes. Biofilms grow under certain ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Mikrofluidik-Co-Kultur von Epithelzellen und Bakterien für die Untersuchung Löslich Signal-vermittelte Wechselwirkungen

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Biologie

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, including studies of microbial physiology and interactions. At the simplest level, accurate spatial patterning of microorganisms would enable reliable, long-term imaging of large numbers of individual cells and transform the ability to quantitatively study distance-dependent microbe-microbe interactions. More uniquely, coupling accurate spatial patterning and full control over environmental conditions, as offered by microfluidic technology, would provide a powerful and versatile platform for single-cell studies in microbial ecology. 
This paper presents a microfluidic platform to produce versatile and user-defined patterns of microorganisms within a microfluidic channel, allowing complete optical access for long-term, high-throughput monitoring. This new microfluidic technology is based on capillarity-assisted particle assembly and exploits the capillary forces arising from the controlled motion of an evaporating suspension inside a microfluidic channel to deposit individual microsized objects in an array of traps microfabricated onto a polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. Sequential depositions generate the desired spatial layout of single or multiple types of micro-sized objects, dictated solely by the geometry of the traps and the filling sequence. 
The platform has been calibrated using colloidal particles of different dimensions and materials: it has proven to be a powerful tool to generate diverse colloidal patterns and perform surface functionalization of trapped particles. Furthermore, the platform was tested on microbial cells, using Escherichia coli cells as a model bacterium. Thousands of individual cells were patterned on the surface, and their growth was monitored over time. In this platform, the coupling of single-cell deposition and microfluidic technology allows both geometric patterning of microorganisms and precise control of environmental conditions. It thus opens a window into the physiology of single microbes and the ecology of microbe-microbe interactions, as shown by preliminary experiments.

We present a technology that uses capillarity-assisted assembly in a microfluidic platform to pattern micro-sized objects suspended in a liquid, such as bacteria and colloids, into prescribed arrays on a polydimethylsiloxane substrate.

Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...