עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מסנט, קרנו של יוסף (AJF, LJI) ואיגוד ריאות האמריקאי, RG-224,607-N (LJI).

1. תחזוקת קו סלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אדם הנציח BE שומות בדרגה גבוהה (CP-B, CP-C, CP-D) וmetaplastic (CP-) שורות תאים על ידי transfection היציב של טלומראז האנושי להפוך חלבון טרנסקריפטאז (טרט) 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור BE שורות תאים בתקשורת keratinocyte בתוספת תמצית שור יותרת המוח (BPE), גורם אפידרמיס צמיחה (EGF), 5% בסרום שור העובר (FBS), חומצות אמינו חיוניות (NEAA), פניצילין, סטרפטומיצין, ניאומיצין (PSN), וסטנדרטי תנאי תרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 98%). </li></ol> 2. להיות נייד ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת הצלחת / coverslips 12 היטב. הנח 18 coverslips מ&quot;מ לתוך צלחת פטרי זכוכית וחיטוי. העברת autoclaved 18 coverslips זכוכית מ&quot;מ לתוך צלחת תרבית רקמת 12 גם באמצעות פיפטה זכוכית סטרילית מחוברת לצינור ואקום. שטוף את coverslip עם PBS ותקשורת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ולספור תאים להיות מונצחים. ספירת תאי USIng דלפק תא אוטומטי או hemocytometer. לדלל תאים בתקשורת והתרבות לריכוז של 20,000-40,000 תאים / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 1 מיליליטר של תאים לתוך כל המכיל coverslip לספירת תאים כולל של 20,000-40,000 תאים / היטב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה סטרילית לדחוף בעדינות את coverslip לתחתית הבאר, כדי להבטיח שתאים לצרף coverslip. </li></ol> 3. הטיפול התרופתי של תאים להיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרופה שנבחרה בתקשורת חמה (37 מעלות צלזיוס) לריכוז רצוי ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך שוב ושוב או בעזרת מערבל מערבולת. ריכוזי תרופה נקבעו באופן אמפירי. להתחיל טיפול 24 שעות הבאות הזריעה הראשונית של התאים יהיה לאפשר התקשרות תאים לcoverslip </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם השוואה ובקרה, טיפול בcoverslip נוסף של תאים להיות עם רכב 0.1% (sulfoxide דימתיל [DMSO] או סוכן המשמש לsolubilize מתחם) בדילול מלא בתקשורת והתרבות. צלחת תווית עם עט מעבדה לזיהוי סמים וvehicle טופל דגימות. מקום תאים לתרבית תאי חממה מוגדרת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לחות 98% ודגירה של נקודות זמן רצויים. </li></ol> 4. Immunofluorescent מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זמן דגירה רצויה של טיפול תרופתי, לשאוב התקשורת לשטוף coverslips במהירות עם פוספט שנאגרו מלוח 1x (PBS) בטמפרטורת חדר (RT, 25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS המכיל 4% PFA [4% PFA / PBS] היטב כל אחד ולדגור על RT במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PFA 4% / PBS ולשטוף 3x coverslips, 5 דקות כל אחד עם PBS ב RT. coverslips חנות במשך שבוע אחד ב% PBS/0.1 PFA על 4 מעלות צלזיוס אם תרצה בכך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization / חסימה Permeabilize תאי PFA קבוע כדי לאפשר את הנוגדן כדי לגשת למטרות תאיים. לתאי ועלו חלבונים, לבצע את כל השלבים שלאחר מכן ללא saponin מתווסף פתרון BSA% PBS/0.5 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את הרקע על ידי דוגרים עם 50 Cl NH 4 מ&quot;מ מדולל PBS 10 דקות ב RT ולשטוף עם RT-PBS פעם אחת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים להיות עבור 30 דקות ב100-300 μl של PBS המכיל saponin 0.1% ו0.5% אלבומין בסרום שור (BSA). לדלל saponin ממניות 10% פילטר מעוקר, שהוכן במים ומאוחסנים ב 4 ° C. </li></ol> הערה: זה מונע ספציפי מחייב של נוגדנים לחלבונים תאיים על ידי חסימת coverslips בשל התוספת של BSA 0.5%. לחלופין, להחליף BSA עם הסרום עז המדולל ל -5% כדי לסייע להפחית ספציפי מחייב של נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של לשכת האנוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת מבדק כיכר על ידי שכבות התחתונה של החדר עם מגבות נייר רטובות ומניח שכבה של Parafilm על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להעביר את coverslips, התאים פונים כלפי מעלה, על Parafilm באמצעות מלקחיים ומחט מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את Parafilm עם עט מעבדה כדי לזהות coverslips. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ראשי נוגדן דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדן העיקרי PBS המכיל שני BSA 0.5% וsaponin .0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למחוק את פתרון החסימה באמצעות רקמות במעבדה ומוסיף של פתרון הנוגדן הראשוני 100 μl. דגירה הנוגדן הראשוני בתאי BE לילה בשעה 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה נוגדנים משני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות 3x עם% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 במשך 5 דקות כל אחד ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל משני נוגדנים מצומדות עם תג ניאון ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1 ששני הנוגדנים מזהה מינים שבו הנוגדן הראשוני הועלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של נוגדן בדילול 100 μl לכל coverslip. דגירה הנוגדנים משני עבור שעה 2 ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה והרכבה של Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips 3x, 5 דקות כל אחד ב% PBS/0.5 saponin% BSA/0.1. הסר את החיץ לשטוף ולהוסיף 100-300 μl של PBS על coverslips. הערה: לקבלת אנטי כפוליםצביעת גוף, חזור על שלבים 4.4-4.5 עם הנוגדן ראשוני ומשניים נוסף הרצוי על פי מידע שהותווה בדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים את coverslip ולמחוק את PBS באמצעות רקמות במעבדה או מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של תקשורת מתאימה אנטי לדעוך הרכבה המכילה 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לcoverslip ולהפוך את coverslip, תאים למטה, לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות לתוך תיקיית שקופיות ודגירה הרחק מאור ישיר הלילה ב RT כדי לאפשר את המדיום אנטי לדעוך קשה להגדיר כדי לרפא, על פי הוראות יצרן. ברגע שהמדיום אנטי לדעוך קבע, יכולה להיות מאוחסנות בשקופיות או 4 ° C או -20 ° C עד להדמיה מיקרוסקופית. </li></ol></li></ol> 5. להדמיה מיקרוסקופית של Coverslips ניתן הדמיה תאים מוכתמים באמצעות מיקרוסקופ או או confocal אם microscop הזקוף מסוגלדואר. למרות מיקרוסקופיה confocal מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה בעומקים בדידים, מיקרוסקופי זקוף הוא מסוגל לייצר תמונות שימושיות יותר מהר. למען קיצור, שיטה של ​​הדמיה מוכתמת להיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית הוא מוצגת. באופן כללי, לisothiocyanate תמונה והעמסת (FITC) או fluorophores הדומה (כלומר חלבון פלואורסצנטי ירוק), טקסס האדומה וDAPI, דורש מיקרוסקופ עם מסננים מסוגלים להפלות fluorophores אלה. בדוק את המיקרוסקופ לפני תחילת פרוטוקול כדי לקבוע fluorophores התואם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה על תקן אם מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר שקופיות / coverslips מאוחסן מ-20 מעלות צלזיוס או 4 ° C ולאפשר להם לחמם לטמפרטורת חדר. כוח במיקרוסקופ ומנורת קשת כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שקופיות מיקרוסקופ עם coverslip פונה כלפי אובייקטיבי על הבמה מיקרוסקופ. לשימוש במטרת טבילת שמן, להוסיף טיפה של שמן טבילה על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מסנן DAPI ולפתוח את התריס. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד במטרה תוך מבט דרך העיני עד שהתמונה מופיעה. מכיוון שכל התאים יהיו כתם עם DAPI, הגרעינים צריכים להיות נצפים בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrett's+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma:+time+for+a+new+synthesis.">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li><li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Barrett's+esophagus+in+the+US:+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data.">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li><li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex,+stage,+and+age.">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li><li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Barret's+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin:+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins.">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett's+adenocarcinoma+in+vitro.">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase,+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett's+esophagus+cell+lines:+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia.">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li><li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic,+Barrett's+cell+line+(BAR-T).">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li><li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition.">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461 (2011).</li><li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+benign+Barrett's+epithelial+cells,+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks.">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li><li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lifespan+of+Barrett's+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit:+a+useful+in+vitro+model.">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li><li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett's+esophagus.">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling.">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li><li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60(c-Src)-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+&#946;-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling.">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of &#946;-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li><li>Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin/Catenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis.">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li><li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2.">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor.">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li><li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells.">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו התוויתי שיטה ליישום של IF של תאים להיות כלפי הבהרת ההשפעות הפיזיולוגיות של טיפולים ממוקדים על תאים אלה. אמנם יש לנו תיארתי את השימוש בנהלים אלה לתאים להיות, שמצאנו כי שיטות אלה תקפים גם למגוון רחב של סוגי תאים שונים 13,17,18 של. יתר על כן, ניתן לשנות נהלים אלה במספר דרכים כדי לייעל את הצביעה למטרות ספציפיות. אנו מוצאים פרמטר אחד שיש לו השפעה ישירה על אם ראוי הוא הבחירה של קיבעון. יש לנו תיארתי את השימוש של 4% PFA / PBS לקיבעון בתהליך המתואר לעיל, אך fixatives החלופי הם גם ישים. קיבוע עם מתנול קר (C ° -20) 20 דקות לאחר שטיפה עם PBS מתאים לחלבונים / נוגדנים מסוימים 13. שימוש במתנול הקר לקיבוע שולל את הצורך permeabilize תאים. עם זאת, הבחירה של מקבע (PFA 4% / PBS או מתנול הקר) צריך להיקבע באופן אמפירי. </p&gt; ההליכים שתוארו לעיל מתארים את ההדמיה של חלבון יחיד; עם זאת שיטה זו היא להתאמה בקלות לזיהוי של יעד נוסף 13. לאופטימלי אם של שני חלבונים, נוגדנים עיקריים שהועלו בשני מינים שונים (לדוגמא, אחד גדל ארנב ואחד בעכבר), ונוגדנים משני במיוחד הכרה בכל מין, בשילוב לfluorophores שונה, נחוצים. נוגדנים משני מצמידים את fluorophores הירוק ואדום, בשילוב עם DAPI מספקים ניגודיות מעולה בין מטרות, בנוסף בדרך כלל להימנעות מהתערבות fluorophores המרובים. כי אם משתי מטרות בתאים להיות, לבצע דגירה רציפה של שני נוגדנים משני ראשוניים ושלהם בעקבות קיבעון. צעדים לשטיפה והרכבה של שקופיות נשארים אותו הדבר. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול פשוט ושימושי עבור IF של תאים להיות. יישום של נהלים אלה יכול להניב informatיון לגבי ההשפעות של טיפול תרופתי, הקדמה של גנים מחוץ לרחם של עניין, או downregulation RNAi של גנים של עניין בתאים להיות.

<html> ושט בארט (BE) הוא שינוי metaplastic באפיתל הנורמלי הקשקש של הוושט ותוצאה של חשיפה כרונית לתוכן הקיבה הנובע ממחלת החזר הוושטי (GERD) 1. הוא חשב להיות להיות מנגנון הגנה בתגובה לGERD, עם זאת הנוכחות של BE מקנה סיכון מוגבר של אדנוקרצינומה של הוושט (EAC), מחלה אשר נושאת הישרדות נמוכה באופן משמעותי 1. הערכות הנוכחיות מצביעות על כך שעד 5.6% מכלל האוכלוסייה האמריקנית צריכים להיות, כמו להיות לעתים קרובות תסמינים, הוא חשב, עם זאת, הרוב המכריע של BE נשאר לא מאובחן 2. כשיעורי ההיארעות של שני GERD וEAC ראו צמיחה נמשכת 3, זה הפך להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים המולקולריים מעורבים בהתקדמות של להיות EAC, במיוחד כאשר מידע זה עלול לספק גישות טיפוליות למניעת התקדמות של להיות EAC. מחקרים&gt; חולה מופנים הביאו לפרדיגמה הנוכחית של הפתוגנזה BE-EAC 1. דלקת כרונית, פציעה, ונזק genotoxic כתוצאה מחשיפה ממושכת לתוכן קיבה להפעיל לחץ סלקטיבי על הנגע לקדם התקדמות neoplastic לEAC. מספר השינויים הגנטיים שזוהו במהלך להיות התקדמות EAC. אולם, למרות זאת קיים מחסור מובהק של הבנה לגבי השינויים המדויקים בתא איתות והשפעות שלאחר מכן על מבנה תא ותפקודו. הונצחו בשורות תאים במבחנה הם כלים שימושיים לחקר ההשפעות של תא איתות, בעיקר בחוקר את ההשפעות של תרכובות טיפוליות ממוקדות. הזמינות המסחרית האחרונה של שורות תאים להיות מונצחות מאפשרת ללימודים כאלה. למרות מבחני תפוקה גבוהה, כגון מבחני כדאיות בשימוש נרחב, יכולים להיות בעל ערך בהערכת ההשפעות של טיפולים ממוקדים על התפשטות תאים וsurvival 4-6, מבחני אלה אינם שימושיים לחקירת ההשפעות של תא איתות על מורפולוגיה של תאים. מכתים Immunofluorescent (IF) הוא טכניקה שימושית חוקר את ההשפעות של טיפולים ממוקדים על המאפיינים מורפולוגיים, צמיחה וההישרדות של תאים והחלבונים שהם מעורבים. המעבדה שלנו יש להתאים שיטות אלה לכיוון קווי BE תא הנציחו, באמצעות IF כדי להעריך את ההשפעות של תרופה זמינה מבחינה קלינית על שורות תאים להיות בתקוות של התוויית טיפול אפשרי chemopreventative וסמנים ביולוגיים לטיפול תרופתי 7. כמו כן, יישום של טכניקות אלה בEAC, BE ושורות תאי הוושט הונצחו יש מתווית ממצאים קריטיים לגבי להיות התקדמות EAC 8-10. אנו מוצאים אם ניתוח של תאים להיות מטופלים עם טיפולים ממוקדים יש ערך, המאפשר אפיון של שינויים במבנה תא ולוקליזציה חלבון. כאן, אנו מציגים את השיטות שלנו כי אם של תאים להיות מונצחים לגharacterize טיפול תרופתי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-A (Metaplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keratinocyte-SFM (1X), Liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PSN ANTIBIOTIC MIXTURE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular Glass Coverslip 18mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-183-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-catenin Primary Antibody (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9562S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm TC treated PS dish, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-3394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-well TC treated PS plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5666-5180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SKI-606 (Bosutinib)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Square Bioassay Dish&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>240835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Parafilm&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nexcelom Mini Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellometer Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss Apotome microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunofluorescent method for characterization of barrett&#8217;s esophagus cells

אדנוקרצינומה של הוושט (EAC) יש שיעור כולל הישרדות של פחות מ 17% ושכיחות של EAC עלתה באופן דרמטי בשני העשורים האחרונים. אחד מגורמי הסיכון העיקריים של EAC הוא שט בארט (BE), שינוי metaplastic של הוושט הקשקש הנורמלי בתגובה לצרבת כרונית. למרות הקשר המבוסס היטב בין EAC ולהיות, חקירה של האירועים המולקולריים, במיוחד מסלולי איתות שינו מעורבים התקדמות של להיות EAC, הם הבינו היטב. חלק גדול מזה נובע חוסר המתאים במודלים חוץ גופית זמינים ללמוד מחלות אלה. לאחרונה, קווי BE תא הונצחו הפכו זמינים באופן מסחרי המאפשרים לבדיקות במבחנה של BE. כאן, אנו מציגים שיטה לצביעת immunofluorescent של קווי BE תא הונצחו, ומאפשרים באפיון מבחנה של תא איתות ומבנה לאחר חשיפה לתרכובות טיפוליות. יישום של טכניקות אלה הלp לפתח תובנה המנגנונים המעורבים בתהיה התקדמות EAC ולספק אפיקי פוטנציאל לטיפול ומניעה של EAC.

דוגמא לתוצאות המתקבלות מיישום של הנהלים שתוארו באה לידי ביטוי בדמויות 1A-D. Coverslips עם CP-D ותאי BE CP-C טופלו ל24 שעות עם 1 מיקרומטר של מעכב Src המשפחה, SKI-606, או רכב (DMSO) ומוכתם באמצעות הנהלים מעל לצומת Adherens וWnt איתות חלבון, β -Catenin. ויזואליזציה של β-catenin הושגה על ידי תיוג עם IgG נגד ארנב מצמידים fluorophore ירוק, תוך תיוג של גרעין התא בוצע על ידי תיוג עם DAPI (כחול). Coverslips היו רכוב על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות קשה להגדיר התקנה ותאים הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר באמצעות מטרת התכנית-Apochromat 63X/1.4N. Fluorophore הירוק שנבחר היה נרגש ב488 ננומטר ומדמיין באמצעות מסנן פליטה ב 505-525 ננומטר. באופן דומה, DAPI היה נרגש ב405 ננומטר ופליטה שנאסף באמצעות מסנן ב410-460 ננומטר. פעילות של טירוזין קינאז, Src iים עלה בלהיות, במיוחד בדיספלזיה בדרגה גבוהה 12. הקונקורדנציה עם תצפיות בתאי סרטן מעי גס וערמונית 13-15, עיכוב של Src התוצאה relocalization של β-catenin מן הציטופלסמה / הגרעין (חיצים, איורים 1 א &#39;, 1 ג, ו1E) לקרום התא (ראשי חץ, איורים 1B, 1D, ו1F). שימוש בשיטות אלה, אנחנו ואחרים הראינו בעבר כי עיכוב של Src גם משנה את הביטוי ולוקליזציה של מדכאי הסרטן, 7,16 kip1 p27 ושיטות אלה משמשות כיום במעבדה שלנו. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51741/51741fig1highres.jpg" width="500" /> μ איור 1. IF של תאים להיות מונצחים בעקבות טיפול עם מעכב של קינאז Src. CP-C (AD) ו CP-D (E, F) טופלו רכב (DMSO, לוחות משמאל) או 1 מיקרומטר של מעכב Src, SKI-606, ל24 שעות (לוחות מימין). תאי BE קובעו ונצבעו על פי הפרוטוקול המתואר. β-catenin (ירוק) היה דמיינו באמצעות נוגדן ספציפי ונוגדנים משני מצמידים Alexa Fluro 488, בעוד הגרעין היה מוכתם עם DAPI (כחול). שים לב לשינוי בלוקליזציה עבור β-catenin מהגרעין (חיצים) על קרום התא (ראשי החץ) בעקבות טיפול עם SKI-606. C, D) תמונות מוגדלות של קופסות הלבנות בA ו-B, להדגיש עוד יותר את השינויים בβ- לוקליזציה קטנין. תמונות אלה מייצגים מכתים אידיאליים עם מינימאלי רקע וצביעה ייחודית ליעד הנבחר. ברים, 7 מיקרומטר (A, B, D, F), 0.5 מיקרומטר (C, D).

Watch this Scientific Journal Video about An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrettâ€™s Esophagus Cells at JoVE.com

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

יש צורך ניכר למידע משופר על נהגים מולקולריים של ושט בארט. מכתים Immunofluorescent הוא טכניקה שימושית להבנת ההשפעות של תא איתות במורפולוגיה של תאים. אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל לשימוש בצביעת immunofluorescent להעריך טיפול רפואי בתאי הוושט של בארט.

שיטת Immunofluorescent לאפיון של תאי הוושט של בארט

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

14.0K Views.  St. Joseph's Hospital and Medical Center.  יש צורך ניכר למידע משופר על נהגים מולקולריים של ושט בארט. מכתים Immunofluorescent הוא טכניקה שימושית להבנת ההשפעות של תא איתות במורפולוגיה של תאים. אנו מציגים פרוטוקול פשוט, יעיל לשימוש בצביעת immunofluorescent להעריך טיפול רפואי בתאי הוושט של בארט. 

Video: An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.