Bu çalışma St Joseph&#39;in Vakfı (AJF, Lji) ve Amerikan Akciğer Derneği, RG-224607-N (Lji) hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Hücre Hattı Bakım <ol><li> Ölümsüzleştirilmiş insan transkriptaz (TERT) proteini 11 ters İnsan telomeraz kararlı transfeksiyonu ile yüksek dereceli displazi (CP-B, CP-C, CP-D) ve metaplastik (CP-A) hücre çizgileri BE. </li><li> Bakım hücre sığır hipofiz özütü (BPE), epidermal büyüme faktörü (EGF),% 5 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), penisilin-streptomisin-neomycin (PSN) ile takviye edilmiş ortam içinde keratinosit hatları, standart BE Doku kültürü koşulları (37 ° C,% 5 CO2,% 98 nem). </li></ol> 2.. Hücre Kaplama BE <ol><li> 12 çukurlu levha / lamelleri hazırlanması. Cam bir Petri tabağına ve otoklav içine 18 mm lamelleri yerleştirin. Transfer vakum tüpüne bağlanmış bir steril cam pipet kullanılarak 12 çukurlu doku kültürü kabına 18 mm cam lamelleri otoklavda muamele edildi. Steril PBS ve medya ile lamel yıkayın. </li><li> Trypsinize ve ölümsüzleştirdi BE hücreleri saymak. Hücreleri USI saymak, otomatik bir hücre sayacı ya da bir hemasitometre ng. 20,000-40,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar kültür ortamı hücreleri seyreltin. </li><li> Her bir 20,000-40,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam hücre sayımı için bir lamel içeren içine hücre 1 ml yerleştirin. </li><li> Yavaşça hücreler lamel takmak sağlamak için kuyunun dibine lamel itmek için steril bir pipet kullanın. </li></ol> BE Hücreler 3. İlaç Tedavisi <ol><li> Istenen konsantrasyona ılık (37 ° C) ortam maddesi içinde seçilmiş ilaç seyreltin ve tekrar tekrar tüp tersine çevrilmesi ya da bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak iyice karıştırın. Ampirik olarak belirlenir ilaç konsantrasyonları. Lamel üzerine hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere, BE hücrelerin ilk tohumlama aşağıdaki tedavi 24 saat başlayın </li><li> Karşılaştırma ve kontrolü için, kültür ortamı içinde seyreltilmiş,% 0.1 araç (dimetil sülfoksit [DMSO] veya bileşik madde çözündürülmesi için kullanılır) ile BE hücrelerinin ek bir lamel tedavi. Ilacı tanımlamak ve A.Ş. için bir laboratuar kalem ile etiket plakasıbulunulması örnekleri tedavi. 37 ° C,% 5 CO2,% 98 neme ayarlanmış bir hücre kültür inkübatörü içine koyun hücreleri ve istenen zaman noktaları için inkübe edilir. </li></ol> 4. Immunofluorescent Boyama <ol><li> Tespit <ol><li> İlaç tedavisinin İstenilen kuluçka süresinden sonra, ortam aspire ve oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) &#39;de 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hızlı bir şekilde lamelleri yıkayın. </li><li> PBS aspire ve her kuyuya% 4 PFA [% 4 PFA / PBS] ihtiva eden 1 ml PBS ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> % 4 PFA / PBS aspire ve oda sıcaklığında PBS ile lamelleri 3 kez, her biri 5 dakika yıkayın. Arzu edildiği takdirde, 4 ° C &#39;de PBS/0.1% PFA bir hafta deposu lamelleri. </li></ol></li><li> Permeabilization / Engelleme Antikor, hücre içi hedefleri erişmesine izin vermek için sabit PFA permeabilize hücrelerin. Dışı proteinleri yüzüne için, 1x PBS/0.5% BSA çözeltisi ilave saponin olmadan sonraki tüm adımları uygulayın. <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde seyreltilmiş 50 mM NH4CI ile inkübe edilerek arka plan azaltmak ve 5 dakika için bir kere RT PBS ile yıkayın. </li><li> % 0.1 saponin ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden PBS içinde, 100-300 ul içinde 30 dakika boyunca BE hücreleri inkübe edin. , Filtre ile sterilize edilmiş% 10 stok saponin seyreltik su içinde hazırlanır ve 4 ° C&#39;de saklandı </li></ol> Not: Bu,% 0.5 BSA ilave nedeniyle lamelleri engelleyerek hücre proteinlere antikorların spesifik olmayan bağlanma önler. Seçenek olarak ise, antikor spesifik olmayan bağlanmaların azaltmak için% 5 oranında seyreltilmiş keçi serumu ile BSA yerine. </li><li> İnsan Odası hazırlanması <ol><li> Islak kağıt havlu ile odasının alt katman tarafından bir kare biyodeney tabak hazırlayın ve üstüne Parafilm bir katman yer. </li><li> Yavaşça forseps ve bir şırınga iğnesi kullanarak Parafilm üzerine yukarı bakacak lamelleri, hücreleri aktarmak. </li><li> Lamelleri belirlemek için bir laboratuvar kalem ile Parafilm işaretleyin. </li></ol></li><li>Primer antikor inkübasyon <ol><li> % 0.5 BSA ve% 0.1 saponin her ikisini ihtiva eden PBS birincil antikor seyreltin. </li><li> Hafifçe laboratuvar doku ile bloke solüsyonu kapalı leke ve primer antikor çözeltisi 100 ul ilave edin. 4 ° C de bir gece BE hücreleri üzerinde birincil antikor inkübe </li></ol></li><li> İkincil antikor Kuluçka <ol><li> Slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika her biri için PBS/0.5% BSA/0.1% saponin ile 3x yıkayın. </li><li> İkincil antikor, birinci antikor, yükseltilmiş edildiği türlerin tanıdığı PBS/0.5% BSA/0.1% saponin bir floresan etiket ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile seyreltilir. </li><li> Her bir lamel seyreltilmiş antikor, 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil antikor inkübe edin. </li></ol></li><li> Yıkama ve Lameller arasında montajı <ol><li> PBS/0.5% BSA/0.1% saponin içinde lamelleri 3 kez, her biri 5 dakika yıkanır. Yıkama tamponu çıkarın ve lamelleri PBS 100-300 ul ekleyin. NOT: Çift karşıtı İçinVücut boyama, tekrar tartışmada belirtilen bilgilere göre istenen ek primer ve sekonder antikor ile 4,4-4,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe lamel yukarı kaldırın ve bir laboratuvar doku veya kağıt havlu kullanarak PBS kapalı kurulayın. </li><li> Bir cam mikroskop lamı üzerine, hücreler aşağı lamel 4 içeren uygun bir anti-solmaya montaj medya &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 15 ul ekleyin ve lamel ters. </li><li> Bir slayt klasörünün içine slaytlar yerleştirin ve sert ayarlanmış anti-solmaya orta tedavisi için izin oda sıcaklığında gece boyunca direkt ışıktan kuluçkaya, üreticinin talimatlarına göre. , Anti-solma ve orta set edildikten sonra, mikroskopik slaytlar kadar 4 ° C ya da -20 ° C ya da saklanabilir. </li></ol></li></ol> Lameller 5. Mikroskobik Görselleştirme Lekeli hücreler konfokal mikroskopi veya ikisinden biri aracılığıyla görüntülü olabilir EĞER yetenekli dik mikroskope. Konfokal mikroskopi ayrık derinliklerde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar rağmen, dik bir mikroskobik hızlı kullanışlı görüntü üretme yeteneğine sahiptir. Kısaca ifade etmek için, bir görüntüleme yöntemi standart sundu mikroskobu kullanılarak hücreler boyandı. Genel olarak, görüntü flöresin izotiyosiyanat (FITC) veya benzeri bir florofor (yani, yeşil floresan protein) için, Texas Red ve DAPI, bu florofor ayırt edebilen filtresi olan bir mikroskop gerektirir. Uyumlu florosforlar belirlemek için protokol başlamadan önce mikroskop edin. <ol><li> Standart IF Mikroskop üzerinde görüntüleme <ol><li> -20 ° C ya da 4 ° C&#39;de saklanan slaytlar / lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Mikroskop ve cıva ark lambası güç. </li><li> Lamel mikroskop sahneye amaca dönük ile mikroskop lamı yerleştirin. Bir yağ batırma objektifi kullanımıyla ilgili olarak, bir örtücü camın üzerine immersiyon bir damla ekleyin. </li><li> DAPI filtreyi seçin ve kapağını açın. </li&gt; <li> Görüntü görünene kadar okülerler bakarken hedefi odaklanın. Bütün hücreler DAPI ile leke olacaktır yana, çekirdekleri kolayca gözlemlenebilir olmalıdır. </li><li> Ilgili görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri toplayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrett's+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma:+time+for+a+new+synthesis.">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li><li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Barrett's+esophagus+in+the+US:+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data.">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li><li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex,+stage,+and+age.">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li><li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Barret's+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin:+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins.">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett's+adenocarcinoma+in+vitro.">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase,+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett's+esophagus+cell+lines:+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia.">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li><li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic,+Barrett's+cell+line+(BAR-T).">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li><li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition.">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461 (2011).</li><li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+benign+Barrett's+epithelial+cells,+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks.">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li><li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lifespan+of+Barrett's+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit:+a+useful+in+vitro+model.">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li><li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett's+esophagus.">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling.">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li><li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60(c-Src)-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+&#946;-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling.">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of &#946;-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li><li>Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin/Catenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis.">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li><li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2.">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor.">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li><li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells.">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Biz, bu hücreler üzerine hedefleyen terapilerin fizyolojik etkilerini açıklık karşı BE IF hücrelerin uygulanması için bir yöntemi ana hatlarıyla. Biz BE hücrelere karşı bu işlemlerin kullanılmasını tarif etmiş bulunmakla birlikte, bu metodlar da farklı hücre tipleri 13,17,18 çeşitli için geçerli olduğunu bulduk. Bundan başka, bu işlemler, belirli hedefler için lekeleme optimize etmek için çeşitli yollarla değiştirilebilir. Biz uygun IF üzerine d...

Barrett yemek borusu (BE) özofagus yassı epitel, normal ve gastroözofageal reflü hastalığı (GERD) 1 kaynaklanan mide içeriklerine kronik maruz kalmanın bir sonucu olarak bir metaplastik değişimdir. BE GÖRH karşılık olarak bir koruyucu mekanizma olduğu düşünülmektedir, bununla birlikte BE varlığı özofagus adenokarsinomu (EAC), belirgin bir şekilde düşük hayatta kalma 1 taşıyan bir hastalığın artan riski verir. Şu anki tahminler Amerikan nüfusunun kadar 5.6% BE olduğunu göstermektedir BE genellikle asemptomatik olduğu gibi, ancak BE çoğunluğu 2 tanı konulmamış düşünülmektedir. GÖRH ve EAC hem de görülme oranları sürekli büyüme 3 Görüldüğü gibi, bu bilgilerin potansiyel EAC BE ilerlemesini önlemeye yönelik tedavi yaklaşımları sağlayabilir özellikle, EAC BE ilerlemesinde rol oynayan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir hale gelmiştir. 1 mevcut paradigması ile sonuçlanmıştır. Kronik inflamasyon, yaralanma ve mide içeriğinin uzun süre maruz kalma sonucu genotoksik hasar EAC neoplastik ilerlemesini teşvik BE lezyon seçici baskı. Genetik değişikliklerin bir dizi sırasında EAC ilerlemesi ile, BE tespit edilmiştir. Ancak, buna rağmen hücre sinyal kesin değişiklikler ve hücre yapısı ve işlevi üzerine daha sonraki etkileri konusunda anlayış farklı olmaması. Özellikle hedeflenen terapötik bileşiklerin etkisini araştıran, hücre sinyal etkilerini incelemek için yararlı araçlar vitro hücre çizgileri bulunmaktadır ölümsüzleştirilmiş. Immortalized hücre çizgilerinin son ticari durumuna bu gibi çalışmalar için izin verir. Gibi yaygın olarak kullanılan canlılığı tahlilleri gibi yüksek verimlilik gösteren deneyler, hücre çoğalması ve su üzerine hedefli tedavilerin etkisini değerlendirmek değerli olmasına rağmenrvival 4-6, bu deneyler, hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerinin araştırılması için yararlı değildir. Immünofloresan boyama (IF) hücrelerin morfolojik, büyüme ve hayatta kalma özellikleri ve söz konusu proteinler üzerine hedefli tedavilerin etkilerinin araştırılması için bir yararlı bir tekniktir. Bizim laboratuvar ilaç tedavisi 7 için olası bir kemopreventif tedavi ve biyogöstergesini çizen umuduyla BE hücre hatları üzerine bir klinik mevcut ilacın etkilerini değerlendirmek için EĞER kullanarak, ölümsüzleştirdi BE hücre hatlarına doğru bu yöntemleri benimsemiştir. Benzer şekilde, EAC bu tekniklerin uygulanması, BE ve ölümsüzleştirdi özofagus hücre hatları EAC ilerlemesi 8-10 BE ile ilgili kritik bulgular tanımlamıştır. Hedeflenmiş tedaviler ile tedavi edilebilir hücrelerin analizi hücre yapısı ve protein yerelleştirme değişiklikleri karakterizasyonu için izin değeri vardır IF buluruz. Burada, bizim yöntemler sunmak IF c ölümsüzleştirilmemiş BE hücrelerinilaç tedavisi haracterize.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-A (Metaplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keratinocyte-SFM (1X), Liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PSN ANTIBIOTIC MIXTURE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular Glass Coverslip 18mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-183-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-catenin Primary Antibody (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9562S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm TC treated PS dish, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-3394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-well TC treated PS plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5666-5180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SKI-606 (Bosutinib)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Square Bioassay Dish&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>240835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Parafilm&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nexcelom Mini Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellometer Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss Apotome microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunofluorescent method for characterization of barrett&#8217;s esophagus cells

Özofagus adenokarsinom (EAC) genel sağkalım az% 17 oranı ve EAC sıklığı son iki yılda önemli ölçüde arttı vardır. EAC primer risk faktörlerinin biri Barrett yemek borusu (BE), kronik mide ekşimesi tepki olarak normal yemek borusunun skuamoz bir metaplastik değişimdir. EAC arasındaki köklü bağlantı rağmen, moleküler olayların ilerlemesini içeren özellikle değiştirilmiş sinyal yollarının sorgulama EAC anlaşılamamıştır BE. Bu büyük ölçüde bu hastalıkların incelemek için uygun in vitro modellerde uygun eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, BE ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri BE arasında, in vitro çalışmalar için izin ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir. Burada, tedavi edici bileşiklere maruz kaldıktan sonra hücre sinyal ve yapısının in vitro karakterizasyonu sağlayan, BE ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin immünofloresan boyama için bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklerin uygulanması hel doyurmayap EAC ilerlemesine BE katılan mekanizmalar içgörü geliştirmek ve tedavi ve EAC önlenmesi için potansiyel yollar sağlamaktadır.

Tarif edilen prosedürlerin uygulanması ile elde edilen sonuçların bir örneği, Şekil 1A-D &#39;de gösterilmiştir. CP-D ve CP-C BE hücreleri ile Lameller Src ailesi inhibitörü, SKI-606, ya da araç (DMSO) içinde 1 uM ile 24 saat boyunca muamele edilir ve protein, β sinyal adherens Kavşak ve Wnt için yukarıda belirtilen prosedürler kullanılarak boyandı P-katenin. Hücre çekirdeğinin etiketleme DAPI (mavi) ile etiketleme ile gerçekleştirilir ise β-katenin görselleştirilmesi, yeşi...

Watch this Scientific Journal Video about An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrettâ€™s Esophagus Cells at JoVE.com

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Barrett Özofagus moleküler sürücüleri geliştirilmiş bilgi için fark edilebilir bir ihtiyaç vardır. Immunofluorescent boyama hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerini anlamak için yararlı bir tekniktir. Biz, Barrett yemek borusu hücrelerinde terapötik tedavi değerlendirmek için immünofloresan boyama kullanımı için basit ve etkin bir protokol sunmaktır.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  St. Joseph's Hospital and Medical Center.  Barrett Özofagus moleküler sürücüleri geliştirilmiş bilgi için fark edilebilir bir ihtiyaç vardır. Immunofluorescent boyama hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerini anlamak için yararlı bir tekniktir. Biz, Barrett yemek borusu hücrelerinde terapötik tedavi değerlendirmek için immünofloresan boyama kullanımı için basit ve etkin bir protokol sunmaktır. 

Video: An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett’s Esophagus Cells

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

İlköğretim Doku İki timidin analogları Immunofluorescent Algılama (CldU ve IDU)

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Biyoloji

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler