Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem St, Joseph-Stiftung (AJF, LJI) und American Lung Association, RG-224607-N (LJI) unterstützt.

1. Zell Line Maintenance <ol><li> Immortalisierte menschliche BE hochgradigen dysplastischen (CP-B,-C CP, CP-D) und metaplastischen (CP-A) Zelllinien durch stabile Transfektion von menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) Protein 11. </li><li> Aufrechtzuerhalten Zelllinien in Keratinozyten-Medium mit Rinderhypophysenextrakt (BPE), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 5% fötales Rinderserum (FBS), nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) ergänzt und Standard Gewebekulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2, 98% Luftfeuchtigkeit). </li></ol> 2. BE Zellüberzug <ol><li> Herstellung von 12-Well-Platte / Deckgläser. Zeigen 18 mm Deckgläschen in eine Glaspetrischale und Autoklaven. Über autoklaviert 18 mm Deckgläschen in eine 12-Well-Gewebekulturschale mit einem sterilen Glaspipette mit einer Vakuumröhre angebracht. Mit sterilem PBS-und Medien Waschen Sie das Deckglas. </li><li> Trypsinize und zählen verewigt Zellen. Zählen von Zellen using eines automatisierten Zellzähler oder einer Zählkammer. Verdünnte Zellen in Kulturmedien in einer Konzentration von 20.000-40.000 Zellen / ml. </li><li> Platz 1 ml der Zellen in jede Vertiefung, die ein Deckglas für eine Gesamtzellzahl von 20.000-40.000 Zellen / Well. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze schieben das Deckglas auf den Boden des Brunnens, um sicherzustellen, dass die Zellen heften sich an die Deckglas. </li></ol> 3. Drug Treatment von BE Cells <ol><li> Verdünnen gewählte Medikament in warm (37 ° C) Medien bis zur gewünschten Konzentration und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens wiederholt oder mit einem Vortex-Mixer. Entschlossen Wirkstoffkonzentrationen empirisch. Beginnen Sie die Behandlung 24 Stunden nach der ersten Aussaat der BE-Zellen, Zellen Befestigung auf dem Deckglas ermöglichen </li><li> Zum Vergleich und zur Kontrolle, Behandlung eine zusätzliche Deckglas von BE-Zellen mit 0,1% Fahrzeug (Dimethylsulfoxid [DMSO] oder Mittel verwendet, um die Verbindung löslich) in Kulturmedien verdünnt. Bezeichnungsschild mit einem Stift, um Drogenlabor erkennen und vezeug behandelten Proben. Zeigen Zellen in einer Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C, 5% CO 2, 98% Luftfeuchtigkeit eingestellt und Inkubation für gewünschten Zeitpunkten. </li></ol> 4. Immunfluoreszenzfärbung <ol><li> Fixierung <ol><li> Nach der gewünschten Inkubationszeit der medikamentösen Behandlung, saugen die Medien und waschen Sie die Deckgläser schnell mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C). </li><li> Saugen Sie den PBS und 1 ml PBS mit 4% PFA [4% PFA / PBS] in jede Vertiefung und Inkubation bei RT für 30 min. </li><li> Saugen Sie den 4% PFA / PBS und waschen Sie die Deckgläser 3x, jeweils 5 min mit PBS bei RT. Speicher Deck für eine Woche in PBS/0.1% PFA bei 4 ° C, wenn gewünscht. </li></ol></li><li> Permeabilisierungs / Sperrung Durchdringbar befestigt PFA Zellen der Antikörper an die intrazellulären Targets zugreifen können. Für extrazelluläre Proteine ​​taucht, führen alle nachfolgenden Schritte ohne Saponin auf die 1x PBS/0.5% BSA-Lösung gegeben. <ol><li> Hintergrund reduzieren durch Inkubation mit 50 mM NH 4 Cl in PBS für 10 min bei RT verdünnt und gründlich mit PBS RT einmal für 5 min. </li><li> BE Zellen Inkubation 30 min bei 100-300 &amp;mgr; l PBS, enthaltend 0,1% Saponin und 0,5% Rinderserumalbumin (BSA). Verdünnen Saponin vom Filter-sterilisiert 10% Lager, in Wasser hergestellt und bei 4 ° C gelagert </li></ol> ANMERKUNG: Dies verhindert, dass nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an zellulären Proteinen durch Blockierung Deckgläser durch die Zugabe von 0,5% BSA. Alternativ ersetzen BSA mit Ziegenserum verdünnt auf 5% zu reduzieren, um zu helfen unspezifische Bindung von Antikörpern. </li><li> Herstellung von Human-Kammer <ol><li> Bereiten Sie einen Platz Bioassay Gericht durch Schichtung der Boden der Kammer mit feuchten Papiertüchern und legen Sie eine Schicht von Parafilm an der Spitze. </li><li> Sanft übertragen Sie die Deckgläser, Zellen nach oben, auf die Parafilm mit einer Pinzette und einer Spritzennadel. </li><li> Markieren Sie die Parafilm mit einem Stift auf Deckgläser Labor identifizieren. </li></ol></li><li>Primäre Antikörper-Inkubation <ol><li> Verdünnte den primären Antikörper in PBS sowohl 0,5% BSA und 0,1% Saponin. </li><li> Tupfen Sie die Blockierungslösung mit einer Labor Gewebe und 100 ul des primären Antikörperlösung. Inkubieren des primären Antikörpers auf den BE-Zellen über Nacht bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Sekundäre Antikörper Inkubation <ol><li> Waschen Sie die Objektträger 3x mit PBS/0.5% BSA/0.1% Saponin für jeweils 5 min bei RT. </li><li> Verdünnte sekundäre Antikörper mit einem fluoreszierenden Marker in PBS/0.5% BSA/0.1% Saponin, daß der sekundäre Antikörper erkennt die Art, in welcher der primäre Antikörper gezüchtet wurde, konjugiert. </li><li> 100 l des verdünnten Antikörpers an jedem Deckglas. Inkubieren des sekundären Antikörpers für 2 h bei RT. </li></ol></li><li> Waschen und Montage der Deckgläser <ol><li> In PBS/0.5% BSA/0.1% Saponin Waschen Sie die Deckgläser 3x, jeweils 5 min. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen 100-300 ul PBS zu den Deckgläsern. HINWEIS: Bei DoppelantiKörperfärbung, wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,5 mit dem gewünschten zusätzlichen Primär-und Sekundärantikörpers nach Informationen in der Diskussion skizziert. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig heben das Deckglas und tupfen Sie das PBS mit einem Labor Gewebe-oder Papiertuch. </li><li> In 15 ul einer geeigneten anti-fade Montage Medien mit 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) mit dem Deckglas und invertieren die Deck, Zellen nach unten, auf einem Glasobjektträger. </li><li> Legen Sie die Folien in eine Folie Ordner und Inkubation vor Licht über Nacht bei RT, damit die Fest gesetzt anti-fade Medium zu heilen, nach den Anweisungen des Herstellers. Nachdem die Anti-verblassen Medium eingestellt, können Folien entweder bei 4 ° C oder -20 ° C bis mikroskopische Visualisierung gespeichert werden. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskopische Visualisierung der Deckgläser Gefärbte Zellen können entweder über die konfokale Mikroskopie oder abgebildet werden IF in der Lage aufrecht mikroskopischE. Obwohl der konfokalen Mikroskopie liefert Bilder mit hoher Auflösung an diskreten Tiefen, ist eine aufrechte mikroskopisch in der Lage, brauchbare Bilder schneller. Aus Gründen der Kürze, Bunt ein Verfahren zur Bildgebung von Zellen unter Verwendung von Standardmikroskopie dargestellt. Im allgemeinen, um Bild Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder ähnliche Fluorophore (dh das grün fluoreszierende Protein), Texas Red und DAPI, erfordert ein Mikroskop mit Filtern, die Unterscheidung dieser Fluorophore. Überprüfen Sie das Mikroskop vor Beginn Protokoll, um kompatibel Fluorophore zu bestimmen. <ol><li> Imaging auf einem Standard-IF-Mikroskop <ol><li> Entfernen gespeicherten Objektträger / Deck von -20 ° C oder 4 ° C und ihnen erlauben, auf Raumtemperatur erwärmen. Power on Mikroskop und Quecksilberdampflampe. </li><li> Zeigen Objektträger mit Deckglas zugewandte Objektiv auf Mikroskoptisch. Für den Einsatz eines Ölimmersionsobjektiv, einen Tropfen Immersionsöl auf Deckglas. </li><li> Wählen Sie das DAPI-Filter und öffnen Sie den Auslöser. </li&gt; <li> Konzentrieren Sie sich das Ziel, während Sie durch die Okulare, bis das Bild erscheint. Da alle Zellen mit DAPI Fleck, sollten die Kerne leicht zu beobachten sein. </li><li> Sammeln von Bildern mit entsprechenden Bildverarbeitungs-Software. </li></ol></li></ol>

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	<li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrett's+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma:+time+for+a+new+synthesis.">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li><li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Barrett's+esophagus+in+the+US:+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data.">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li><li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. 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Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett's+adenocarcinoma+in+vitro.">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase,+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett's+esophagus+cell+lines:+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia.">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li><li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic,+Barrett's+cell+line+(BAR-T).">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li><li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition.">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461 (2011).</li><li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+benign+Barrett's+epithelial+cells,+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks.">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li><li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lifespan+of+Barrett's+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit:+a+useful+in+vitro+model.">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li><li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett's+esophagus.">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling.">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li><li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60(c-Src)-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+&#946;-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling.">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of &#946;-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li><li>Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin/Catenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis.">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li><li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2.">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor.">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li><li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells.">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben ein Verfahren für die Anwendung der IF von BE-Zellen in Richtung der Aufklärung der physiologischen Wirkungen von zielgerichteten Therapien bei diesen Zellen beschrieben. Zwar haben wir die Verwendung dieser Verfahren zur BE-Zellen beschrieben, haben wir gefunden, daß diese Verfahren auch auf eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen 13,17,18. Ferner können diese Verfahren auf verschiedene Weise zu Färbung für bestimmte Ziele zu optimieren verändert werden. Wir fi...

Barrett-Ösophagus (BE) ist eine metaplastischen Veränderung der normalen Plattenepithel der Speiseröhre und Folge einer chronischen Exposition gegenüber den Mageninhalt von gastroösophagealen Reflux-Krankheit (GERD) 1 resultieren. BE wird gedacht, um ein Schutzmechanismus in Reaktion auf GERD sein, aber die Anwesenheit von BE verleiht ein erhöhtes Risiko für Speiseröhrenkrebs Adenokarzinom (EAC), eine Krankheit, die eine deutlich schlechte Überlebens 1 trägt. Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass bis zu 5,6% der amerikanischen Bevölkerung haben sich jedoch als BE ist oft asymptomatisch, es wird vermutet, dass die Mehrheit der BE bleibt unerkannt 2. Als Inzidenzraten sowohl GERD und EAC haben weitere Wachstum 3 zu sehen, ist es wichtig geworden, um die molekularen Mechanismen in der Progression von BE zu EAC Beteiligten verstehen, insbesondere da diese Informationen könnte möglicherweise therapeutische Ansätze zur Verhinderung der Progression werden, um EAC. 1 geführt. Chronische Entzündungen, Verletzungen und gentoxische Schäden durch längere Einwirkung von Mageninhalt ausüben resultierende Selektionsdruck auf der BE-Läsion Förderung neoplastischen Progression zu EAC. Eine Reihe von genetischen Veränderungen identifiziert wurden während EAC Progression BE. Doch trotz dieser gibt es einen deutlichen Mangel an Verständnis über die genauen Änderungen in der Zellsignalisierung und Folgewirkungen auf Zellstruktur und Funktion. In vitro Zellinien immortalisiert sind nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Wirkungen von Zellsignalen, insbesondere bei der Untersuchung der Auswirkungen der gezielten therapeutischen Verbindungen. Die jüngste kommerzielle Verfügbarkeit von verewigt Zelllinien erlaubt für solche Studien. Obwohl Hochdurchsatz-Assays, wie etwa die weit verbreitete Lebensfähigkeitstests, kann wertvoll in der Beurteilung der Auswirkungen von gezielten Therapien bei der Zellproliferation und-su seinrvival 4-6, sind diese Tests nicht sinnvoll, für die Abfrage der Auswirkungen der Zellsignalisierung auf Zellmorphologie. Immunfluoreszenzfärbung (IF) ist eine nützliche Technik für die Untersuchung der Wirkungen von zielgerichteten Therapien auf den morphologischen, Wachstum und Überleben von Zellen und Eigenschaften der Proteine, die beteiligt sind. Unser Labor hat diese Methoden zu verewigen Zelllinien angepasst, mit IF, um die Auswirkungen einer klinisch verfügbare Medikament auf BE-Zelllinien in der Hoffnung auf eine mögliche Abgrenzung chemopreventative Behandlung und Biomarker für die medikamentöse Behandlung 7 zu beurteilen. Ähnlich Anwendung dieser Techniken in EAC, BE und verewigt Speiseröhre Zelllinien hat kritische Feststellungen zu werden, um EAC Progression 8-10 abgegrenzt. Wir finden, ZF-Analyse von BE-Zellen mit gezielten Therapien behandelt hat einen Wert, so dass für die Charakterisierung von Veränderungen in der Zellstruktur und Proteinlokalisierung. Hier präsentieren wir unsere Methoden für ZF von verewigt Zellen characterize medikamentöse Behandlung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-A (Metaplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keratinocyte-SFM (1X), Liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PSN ANTIBIOTIC MIXTURE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular Glass Coverslip 18mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-183-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-catenin Primary Antibody (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9562S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm TC treated PS dish, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-3394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-well TC treated PS plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5666-5180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SKI-606 (Bosutinib)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Square Bioassay Dish&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>240835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Parafilm&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nexcelom Mini Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellometer Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss Apotome microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunofluorescent method for characterization of barrett&#8217;s esophagus cells

Adenokarzinom des Ösophagus (EAC) hat eine Gesamtüberlebensrate von weniger als 17% und die Häufigkeit von EAC hat sich in den vergangenen zwei Jahrzehnten gestiegen. Einer der primären Risikofaktoren EAC Barrett-Ösophagus (BE), ein metaplastischen Veränderungen der normalen Plattenepithel Speiseröhre in Reaktion auf chronische Sodbrennen. Trotz der etablierten Verbindung zwischen EAC und BE, Abfrage der molekularen Ereignisse, insbesondere veränderte Signalwege unter Beteiligung Progression sein, EAC, werden kaum verstanden. Vieles davon ist aufgrund des Fehlens von geeigneten in vitro-Modelle zur Verfügung, um diese Krankheiten zu untersuchen. Kürzlich immortalisierenden Zelllinien sind im Handel erhältlich so dass für in vitro Untersuchungen von BE. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfluoreszenzfärbung von immortalisierenden Zelllinien, so dass in-vitro-Charakterisierung von Zellsignalen und der Struktur nach der Belichtung, um therapeutische Verbindungen. Anwendung dieser Techniken wird help entwickeln Einblick in die Mechanismen sein, um EAC Progression beteiligt und bieten potenziellen Möglichkeiten für Behandlung und Vorbeugung von EAC.

Ein Beispiel für die von der Anwendung der beschriebenen Verfahren erhaltenen Ergebnisse ist in den 1A-D veranschaulicht. Die Deckgläser mit CP-D-und CP-C BE Zellen wurden für 24 h mit 1 uM der Src-Familie-Inhibitor, SKI-606, oder Vehikel (DMSO) behandelt und gefärbt mit den oben beschriebenen Verfahren für die Adherens Junction und Wnt-Signalprotein, β -Catenin. Visualisierung von β-Catenin wurde durch Markierung mit einem Anti-Kaninchen-IgG zu einem grünen Fluorophor gekoppelt erreicht, währe...

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An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

Es gibt einen erkennbaren Bedarf für verbesserte Informationen über molekulare Fahrer von Barrett-Ösophagus. Immunfluoreszenzfärbung ist eine nützliche Technik für das Verständnis der Wirkung von Zell-Signalisierung auf Zellmorphologie. Wir stellen eine einfache, effektive Protokoll für die Verwendung des Immunfluoreszenzfärbung auf therapeutische Behandlung im Barrett-Ösophagus-Zellen zu beurteilen.

Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

14.0K Aufrufe.  St. Joseph's Hospital and Medical Center.  Es gibt einen erkennbaren Bedarf für verbesserte Informationen über molekulare Fahrer von Barrett-Ösophagus. Immunfluoreszenzfärbung ist eine nützliche Technik für das Verständnis der Wirkung von Zell-Signalisierung auf Zellmorphologie. Wir stellen eine einfache, effektive Protokoll für die Verwendung des Immunfluoreszenzfärbung auf therapeutische Behandlung im Barrett-Ösophagus-Zellen zu beurteilen. 

Serie: An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Forschung

Biologie

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Ein Verfahren zur Kultivierung von embryonalen<em&gt; C. elegans</em&gt; Zellen

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.