מייקל הנרי, אוניברסיטת העיר דבלין, באדיבותו סייע באיסוף הנתונים וניתוח שמוצג באיור 5. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) אוניברסיטת ג&#39;ורג מייסון, (2) האיטלקי IstitutoSuperiore di Sanita &#39;במסגרת איטליה / ארה&quot;ב הסכם שיתוף פעולה בין משרד בריאות האמריקאי ולשירותי אנוש, אוניברסיטת ג&#39;ורג מייסון, והמשרד האיטלקי לבריאות הציבור, (3) NIH, מענקי תכנית IMAT 1R21CA137706-01 ו1R33CA173359-01 לLAL, ו( 4) קרס Nanosciences, Inc .

פלזמה ובשתן אנושיים נאספו מתורמים מתנדבים בריאים, עם כתב הסכמה מדעת, הבאים באוניברסיטת ג&#39;ורג מייסון מוסדי המועצה לביקורת שאושרה פרוטוקולים. תורמים חולקו שווים בשווים בין זכרים ונקבות קווקזי בין גילאי 25 ו42. דוגמאות נותחו בנפרד ולא אספו. .1 Nanoparticle עיבוד דגימות סרום או פלזמה סמנים ביולוגיים בשפע פוטנציאל נמוך בפלזמה נלכדים, בפתרון, עם חלקיקי הידרוג&#39;ל. החלקיקים מתווספים לפלזמה, מודגרות, מופרדת על ידי צנטריפוגה, שטף, והחלבונים שנתפסו הם eluted. חלבוני eluted מיובשים תחת זרימת חנקן עבור סידור במורד הזרם המוני ספקטרומטריית והזדהות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 500 μl של סרום 1: 2 עם 50 מ&quot;מ TrisHCl pH 7 (500 סרום μl + 500 μl TrisHCl) בצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL (NIPAm / AAC) nanop ליבה של פולימאמרים. דגירה של 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 thiocyanate μl נתרן (25 מ&quot;מ) לגלולה. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl מים MilliQ לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ elution טרי: הוסף 700 μl אצטוניטריל 300 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות הכנהared מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300 μl של חיץ elution לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המדגם ב 16,100 XG, 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בצנטריפוגה עם הרוטור זווית קבוע. הסר ולשמור את eluate בצינור נקי, שכותרתו microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.9-1.10. לשלב את שני eluates לתוך צינור microcentrifuge אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את eluates תחת זרימת חנקן בסעפת מאייד חנקן ב42.1 ° C, עם זרימת אוויר מוגדרת 8 (איור 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את eluate המיובש ב RT לO / אחסון N, או ב -20 מעלות צלזיוס עבור אחסון לטווח ארוך, לפני ספקטרומטריית מסה, מערבי סופג, או מבחני ELISA (אופציונליים). </li></ol> .2 עיבוד Nanoparticle של דגימות שתן שתן נורמלי מכיל פחות מ 30 מ&quot;ג / ד&quot;ל חלבון ופחות מ 1 + דם. עם זאת, מחלות רבות / תנאים עשויות לשנות את הרמות נורמליות של חלבון בשתן ודם של. כדי לסייע בקביעת הנפח האופטימלי של חלקיקים כדי להוסיף לדגימת השתן, בדיקת שתן מבוצעת לפני קציר חלקיק. סמנים ביולוגיים שתן עשויים להתקיים בריכוזים נמוכים מאוד, שעשויה לדרוש אופטימיזציה של היחס של חלקיקים לנפח שתן. הליך זה מתאר את קצירת חלקיק של דגימות שתן לניתוח כתם מערבי במורד הזרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות שתן בכוס פלסטיק נקייה, יבשה. היקף מינימאלי 22 מ&quot;ל נדרש. שתן חנות דגימות ב -80 ° C עד מוכן לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את השתן הקפוא ב RT או על 4 מעלות CO / N. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. יוצקים לפחות 22 מ&quot;ל של שתן לתוך צינור פוליפרופילן תחתון 50 מ&quot;ל חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין השתן בצנטריפוגה עם הרוטור את הנדנדה ב3,700 XG במשך 15 דקות. למזוג השתן, מבלי להפריע גלולה, לpolypr תחתון 50 מ&quot;ל חרוטי נקיצינור opylene. זורק את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת שתן באמצעות רצועה רב אנליטי &quot;מדיד שתן&quot; מגיב. הערה: לאחסן את הרצועות מגיב במכל סגור היטב הרחק מאור שמש ולחות 17, 18 ישירים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הרצועה מגיב, עם הפנים כלפי מעלה, על מגבת נייר נקיה ויבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיפטה חד פעמית כדי לשאוב 1 מ&quot;ל של השתן מוכן בשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר טיימר למשך 2 דקות, אבל לא להפעיל אותו. מהירות לוותר 1 - 2 טיפות של שתן על כל משטח בדיקה של הרצועה מגיב. מייד להתחיל את הטיימר. הערה: אל להטביע את הרצועה מגיב ישירות במכל השתן. מחווני צבע / הכימיים ברצועה מגיב עלולים לדלוף החוצה של הרצועה מגיב לתוך מיכל השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן מצויינים על גבי מיכל הרצועה מגיב, רשום את התוצאות איכותיות עבור analytes השונים ברצועה מגיב על ידי השוואת הצבע של הרצועות מגיב פרט לאינדיקה בצבעים המקבילהtors על המכל מגיב. תוצאות שתן נורמליות אופייניות הן: (רגילות או שליליות) לדם, חלבון, לויקוציטים, ניטריט, גלוקוז, קטון, בילירובין, וurobilinogen; pH שתן (5.5-7.0); משקל סגולי (1.001-1.020). הערה: רמות חלבון גבוה בדגימת שתן עשויות להתחרות עם החלבון של עניין לאתרי קישור על חלקיקים. על מנת למקסם את קצירת חלבון עם חלקיקים, חלקיק הנפח / יחס נפח השתן יכול להיות מותאם לכל אחד תחרות גבול מחלבונים שפע גבוהים, או יכול להיות מותאם למסוק חלבונים שקיימים בריכוזים נמוכים מאוד. אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף כרכי 2x של חלקיקים בשלב 2.5 להלן. אם אנליטי של עניין הוא חלבון נפוץ מאוד נמוך, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את ההיקף של חלקיקים עד 2 מ&quot;ל (איור 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 מ&quot;ל של השתן הבהיר מצעד 2.3 לתוך צינור פוליפרופילן נקי 50 מ&quot;ל תחתון חרוטי. האם לאלהפריע כל פסולת / גלולה שיכולה להיות בחלק התחתון של צינור השתן. הוסף 200 μl של חלקיקים לדגימת שתן 20 מ&quot;ל. מערבבים בקצרה על מיקסר מערבולת. הערה: אם ערך חלבון בשתן הוא 1+ או גדול יותר, להוסיף 400 μl של חלקיקים ל20 מ&quot;ל שתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את תערובת שתן / חלקיק ל30 דקות ב RT, ללא נדנדה / ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה שתן / חלקיק בצנטריפוגה מצוידת ברוטור את נדנדה ב3,700 XG עבור 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא צנטריפוגה הבאה נראית לעין, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant. מוסיף המים 500 μl MilliQ לגלולת החלקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. מעבירים את פתרון nanoparticle לצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין חלקיקים בצנטריפוגה מצוידת בהרוטור קבוע זווית ב16,100 XG 10 דקות. הערה: אם גלולה היא לא מספק מתה גלויגעיית צנטריפוגה, לסובב את הדגימות ל2 נוספות - 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.8 ו2.11 (פעמיים) עם 200 μl 18 MilliQ מים כדי לשטוף את חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ elution טרי: הוסף 970 μl אצטוניטריל ל30 אמוניום הידרוקסיד μl בצינור נקי. זהירות: הידרוקסיד אמוניום הוא מאכל. השתמש עם אוורור מתאים. הערה: חיץ elution חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש. אל תאחסן את חיץ elution. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ elution 20 μl לגלולת החלקיק. Resuspend חלקיקים על ידי מרץ pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה של 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות החלקיק ב16,100 XG 10 דקות. הסר ולשמור את supernatant ב, צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל נקי. אל תפריע לגלולת החלקיק. זורק את הכדור בפסולת הביולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות במעמד במנדף הכימי. פתח את הכובעים, וincubate ב RT למשך 30 דקות. לחלופין, למקם את הדגימות תחת זרימת חנקן ב40 מעלות צלזיוס עד יבשה (1 - שעה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl חיץ טריס-גליצין SDS מדגם (2x) לדגימות. חום ב100 מעלות צלזיוס בגוש חום יבש ל5 דקות עם הכובעים פתוחים או עד שהנפח שנותר בצינור היא לא יותר מ 20 μl. שים לב: אין להשתמש באמבט מים רותח. לחות מאמבט המים תהיה למנוע אידוי של החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכובע על הצינורות. הסר את הצינורות מהגוש החום. המדגם יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או בשימוש באופן מיידי לניתוח כתם מערבי במורד הזרם. </li></ol>

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside:+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs.">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li><li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+low-abundance,+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry.">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li><li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood.">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li><li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates.">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li><li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads.">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li><li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer.">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li><li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction.">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine,+such+as+Human+Growth+Hormone+(hGH),+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles.">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogel+particles:+biomarker+harvesting:+one-step+affinity+purification,+size+exclusion,+and+protection+against+degradation.">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li><li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A.">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li><li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+core-shell+nanoparticles:+discovery+of+previously+invisible+biomarkers.">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH.">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li><li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+particles+harvest,+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers.">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery.">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals.">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=blotting:+sample+preparation+to+detection.">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264 (2007).</li><li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+(hGH)+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment:+preliminary+results.">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology.">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li><li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum.">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li><li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery.">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li><li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease.">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies.">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li><li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease.">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li><li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+(PDGF):+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle.">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li><li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy.">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li><li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis.">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li><li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2,6-sialyltransferase+secretion+in+vivo.">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis.">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li><li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARC/CCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia.">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li><li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression.">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li></ol>

Benjamin Espina is an employee of Ceres Nanosciences, Inc. that produces reagents used in this Article. Lance Liotta, Alessandra Luchini and Virginia Espina hold patents (US patent 7,935,518 and/or 8,497,137) on the nanoparticle technology used in this Article. As university employees they are entitled to receive royalty from these patents per university policy. Lance Liotta and Alessandra Luchini are shareholders in Ceres Nanosciences and serve on the Scientific Advisory Board.

רלוונטיות קליני הוא חשב מדגם סרום או פלזמה להכיל נמוך שפע במחזור חלבונים ופפטידים אשר יכול לספק מקור מידע עשיר על מצבו של האורגניזם כולו. למרות ההבטחה של פרוטאומיקה סרום, יש שלושה חסמים פיסיולוגיים בסיסיים ורציניים סיכ?...

למרות השלמת רצף הגנום האנושי, התקדמות משמעותית לא נעשתה בסמנים ביולוגיים לזיהוי ניבוי של מחלה בשלב מוקדם, או שמתאם עם תוצאה טיפולית, או הפרוגנוזה 1. אחת סיבות לחוסר ההתקדמות היא שרבים סמנים ביולוגיים שעלולים להיות משמעותיים קיימות בריכוז מתחת לגבול הגילוי של ספקטרומטריית מסה המוסכמת ופלטפורמות גילוי סמן ביולוגי אחרות. ספקטרומטריית מסה (MS) וניטור תגובה מרובה (MRM) יש רגישות זיהוי בדרך כלל גדול יותר מ50 ng / ml בעוד רוב analytes שנמדד על ידי immunoassays במעבדה נפילה קלינית בטווח שבין 50 pg / ml ו10 ng / ml . משמעות דבר היא כי סמנים ביולוגיים רבים, במיוחד בשלב המוקדם של מחלה יכולים לא להיות מזוהים על ידי MS הקונבנציונלי וMRM 2. בנוסף הנוכחות של חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין ואימונוגלובולינים בנוזלים ביולוגיים מורכבים לעתים קרובות להסוות על ידי EXC מיליארדים פינמוך שפע ESS, חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים 3, 4. מסיבה זו מספר צעדי הכנה מדגם נדרשים לפני רצף ספקטרומטריית מסה והזדהות. צעד הכנה אחד כזה מעסיק הדלדול של חלבונים גבוה שפע עם עמודות דלדול זמינות מסחרי 5-8. לרוע המזל שלב זה מוביל להפחתה של התשואה של סמנים ביולוגיים מועמד בגלל שהם קשורים לעתים קרובות שאינם קוולנטית עם חלבונים נשאים שהוסרו. אתגר נוסף הוא מיוצג על ידי היציבות של סמנים ביולוגיים מועמד לשעבר vivo פעם אחת הדגימות שנאספו. חלבונים הם נושא לשפלה על ידי פרוטאזות אנדוגני או אקסוגני 9. חלקיקי הידרוג&#39;ל יכולים להתעלות מעל אתגרים קריטיים אלה על ידי הגברת ריכוז הסמן הביולוגי המשוערת לרמה בטווח של assay, תוך הגנה על החלבון מן השפלה 10-13. חשוב לציין הבLMW חלבונים בדם הם תערובת של חלבונים ללא פגע קטנים, כמו גם שברים של חלבונים גדולים. חלבונים המופקים מרקמות גדולות יותר מ60 kDa הם גדולים מדי כדי להיכנס לזרם הדם באופן פסיבי דרך הקרום במרתף של כלי דם, אבל הם יכולים להיות מיוצגים בדם כפפטידים או שברי חלבון 14. המטרה שלנו היא למדוד סמנים ביולוגיים חדשניים במחזור שיכול להיות מועמדים לגילוי מוקדם של מחלה, ריבוד מטופל לטיפול, ומעקב אחר התגובה לטיפול. חלקיקים שלנו נוצרו כדי לשלול באופן סלקטיבי נוגדנים גבוה שפע ואלבומין, בעת לכידתו זמנית חלבונים ופפטידים קטנים יותר ומתרכזים אותם ל100 פי תלוי בהתחלת הנפח. הקבוצה שלנו זיהתה שורה של צבעים אורגניים קטנים אשר יכול לפעול בהצלחה פיתיונות מולקולריים גבוהה כזיקה לחלבונים ופפטידים. הוא חשב חלבון צבען מחייב להיות בגלל שילוב של אינטראקציה הידרופובי ואלקטרוסטטיים. הטבעות ריחניות בצבע Interleave עם חלבונים באמצעות כיסים הידרופובי על פני השטח חלבון 11. הפיתיונות, תלוי בכימיה שלהם, להראות זיקה מסוימת לשיעורים נבחרים של analytes. הפיתיונות להתחרות עם החלבונים מובילים, כגון אלבומין, לחלבונים או פפטידים. חלבונים / פפטידים המשקל מולקולריים נמוכים נלכדו בחלקיקים. חלבוני משקל מולקולריים גבוהים כגון אלבומין ואימונוגלובולינים מנוע מלהיכנס לחלקיק בגלל יכולת הסנון בשל נקבובית המגבילה של הידרוג&#39;ל 11 (איור 1). חלקיקי הידרוג&#39;ל מסונתזים על ידי פילמור ממטרים ביוזמת persulfate אמוניום 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm), שיתוף מונומרים של חומצה אקרילית (AAC) וallylamine (AA) וצולב מקשר N, N&#39;-Methylenebisacrylamide (BIS) מותר להגיב ב70 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות בתנאים לדלל 11, 13. הזיקה גבוהה מחייבת חלבון של פולי (N-isopropylacrylamide-שיתוף אקריליק חומצה) (פולי (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis מושגת על ידי קוולנטית שילוב צבעים המכיל אמינו (כלומר., צבעי sulfonatedanthraquinonetriazine) לחלקיקים דרך תגובת amidation בוצעה בממסים מימיים או אורגניים בהתאם למאפיינים הידרופילי / הידרופובי של הצבעים 11, 13 חילוף. Nucleophilic של הקבוצות האמינים בחלקיק עם אטום כלוריד של צבע anthraquinonetriazine מנוצל ליצירת פולי המכילים צבע (NIPAm -co-Allylamine) (AA) חלקיקים 11, 12. תהליך פילמור שני שלבים הוא מנוצל כדי ליצור חלקיקי הידרוג&#39;ל המכילים מעטפת חיצונית של חומצת vinylsulfonic (VSA) 11, 13. יכולים להיות מיושמים חלקיקי הידרוג&#39;ל לנוזלים ביולוגיים שונים, ובכלל זה כל דם, פלזמה, סרום, נוזל השדרתי, זיעה, ושתן. בצעד אחד, בפתרון, nanoparticles לבצע מהיר (תוך דקות) תפיסה וריכוז של משקל מולקולרי נמוך analytes 10, 11, 13, 15-18. חלבונים eluted לאחר מכן מהחלקיקים וזוהו באמצעות מערביים סופג 19-21, ספקטרומטריית 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 המוני, 23, immunoassays / 10 ELISA, 11, 15, 18, ​​או microarray חלבון שלב הפוך 16, 24 מבחני. חלקיקים פונקציונליות עם פיתיון כימי, והצגת ארכיטקטורת פגז ליבה או ליבה, לכידה ולהתרכז חלבונים המבוססים על מאפייני physicochemical פיתיון / פגז. צבעים שונים שולבו בחלקיקים ולכן יהיו ללכוד תת שונה של חלבונים עם משתנה יעילות המבוססת על זיקת הצבע, pH של התמיסה, ונוכחות / היעדרות של מתחרות חלבונים גבוהים בשפע 13. יתר על כן, כמות חלקיקים ביחס להיקף הפתרון תשפיע על תשואת החלבון מהחלקיקים. היבטים אלה שלקציר nanoparticle הידרוג&#39;ל הם הפגינו באמצעות שלושה פיתיונות nanoparticle שונים לחלבוני קצירה מדגימות פלזמה שמכילות כמויות גדולות של חלבון, ומדגימות שתן שבדרך כלל לא מכילות כמויות גדולות של חלבון. בפרוטוקול זה אנו מדגימים קצירה וריכוז אלפא גורם נמק גידול (TNFα) מדגימות פלזמה באמצעות פולי (NIPAm-CO-AAC), midi (NIPAm / צבע), וחלקיקי קליפת core- (פולי (NIPAm-CO-VSA)) . חלקיקי midi (NIPAm / צבע) מוצגים להתרכז אנטיגן מיני Mycobacterium שנוסף לדגימות שתן אנושיות, לחקות אנשים נגועים שחפת Mycobacterium.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

גילוי סמן ביולוגי חדשני משחק תפקיד משמעותי במאמץ לספק גילוי מחלה יותר רגיש וספציפי. למרבה הצער רב סמנים ביולוגיים נמוך שפע שקיימים בנוזלים ביולוגיים לא ניתן לאתר בקלות עם ספקטרומטריית או immunoassays כי הם נמצאים בריכוז נמוך מאוד, הם יציבים, ולעתים קרובות הם רעולי פנים על ידי חלבונים גבוה שפע כגון אלבומין או אימונוגלובולינים המוניים. פיתיון המכיל פולי (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) חלקיקים מבוססים מסוגלים להתגבר על מחסומים פיסיולוגיים אלה. בצעד אחד שהם מסוגלים ללכוד, להתרכז ולשמור על סמנים ביולוגיים מנוזלי גוף. analytes משקל מולקולרי הנמוך להיכנס לליבה של החלקיק ונתפס על ידי צבעים שונים אורגניים כימיים, המשמשים כפיתיונות חלבון זיקה גבוהה. חלקיקים הם מסוגלים להתרכז החלבונים של ריבית על ידי צווים שונים של גודל. גורם ריכוז זה מספיק כדי להעלות את רמת החלבון באופן שהחלבונים הם בתוךגבול גילוי של ספקטרומטרים הנוכחיים המוניים, מערבי סופג, וimmunoassays. ניתן מודגרות חלקיקים עם שפע של נוזלים ביולוגיים והם יכולים להעשיר מאוד את הריכוז של חלבוני משקל מולקולריים נמוכים ופפטידים ואילו בניכוי אלבומין וחלבונים במשקל מולקולרי גבוהים אחרים. הנתונים שלנו מראים כי הגברה של פי 10,000 בריכוז של אנליטי מסוים ניתן להשיג, מה שמאפשר ספקטרומטריית המסה וimmunoassays כדי לזהות סמנים ביולוגיים לגילוי בעבר.

גודל הידרוג&#39;ל Nanoparticle ואחידות חלקיקי midi (NIPAm-AAC) שהופקו בתשואה גבוהה במיוחד ושחזור בין ובתוך קבוצות. יש לי החלקיקים יציבות colloidal טוב מאוד ב RT בזמן הנדרש עבור לכידה, אחסון, וelution של חלבונים (לפחות 48 hr), וממטרי חלקיק לא נצפו <str...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins at JoVE.com

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

הידרוג&#39;ל Nanoparticle קציר של פלזמה או שתן לגילוי חלבונים שפע נמוך

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Views.  George Mason University. Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Video: Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

טיפוח האדם ובתאים עצבית ב Hydrogel עצמית להרכבת 3 מימדי פפטיד

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

רוד מבוססי ייצור של מכשירים גריפר פניאומטיים רובוטית להתאמה אישית רך עבור מניפולציה רקמה עדינה

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

משלוח הממברנה ממוקד על Encapsulated מטענים הידרופובי בנושאת Nanoparticle קריסטל נוזלת

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

מכשירי קצירת רקמות Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

ממשקי הידרוג'ל הניתנים לצילום להקרנת חיידקים, בחירה ובידוד

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

סינתזה של הידרוג'ל דבק חזק, ג'לטין O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...