Michael Henry, Dublin City University, freundlich mit der Datenerhebung und Analyse in Abbildung 5 dargestellt unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von (1) George Mason University, (2) die italienische IstitutoSuperiore di Sanita &#39;, die im Rahmen des Italien / USA Kooperationsvereinbarung zwischen dem US Department of Health and Human Services, George Mason University, und dem italienischen Gesundheitsministerium, (3) NIH, IMAT Programm Zuschüsse 1R21CA137706-01 und 1R33CA173359-01 LAL, und (4) Ceres Nanowissenschaften, Inc .

Humanplasma und Urin wurde von gesunden freiwilligen Spendern gesammelt, mit schriftlicher Einwilligung, nach der George Mason University Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Spender wurden zu gleichen Teilen Männer und Frauen kaukasischen im Alter zwischen 25 und 42 Proben wurden einzeln analysiert zwischen verteilten und wurden nicht vereinigt. 1. Nanopartikel Verarbeitung von Serum-oder Plasma-Proben Potential niedrigen reichlich Biomarker im Plasma erfasst, in Lösung, mit Hydrogel-Nanopartikel. Die Teilchen dem Plasma inkubiert, durch Zentrifugation abgetrennt, gewaschen wird und die gefangenen Proteine ​​eluiert werden. Die eluierten Proteine ​​werden unter Stickstoffstrom für Downstream-Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung getrocknet. <ol><li> 500 ul verdünnte Serum 1: 2 mit 50 mM Tris-HCl, pH 7 (500 ul Serum + 500 ul Tris-HCl) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul von Poly (NIPAm / AAC) Kern NanOpArtikel. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Gib 500 ul Natriumthiocyanat (25 mM) zu dem Pellet. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 700 ul Acetonitril bis 300 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss prep seinaRoten unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Werden 300 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und speichern Sie das Eluat in einem sauberen, beschriftet Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,9 bis 1,10. Kombinieren Sie die beiden Eluate in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Trocknen Sie die Eluate unter Stickstoffstrom in einem Stickstoffverdampfer Verteiler an 42,1 ° C, mit einem Luftstrom bis 8 (2F) eingestellt. </li><li> Das getrocknete Eluat bei RT O / N Lagerung oder bei -20 ° C für die Langzeitspeicherung, vor Massenspektrometrie, Western Blot oder ELISA-Tests (optional). </li></ol> 2. Nanopartikel Verarbeitung von Urinproben Normaler Urin enthält weniger als 30 mg / dl Protein undweniger als 1 + Blut. Doch viele Krankheiten / Bedingungen können die normalen Niveaus der Urin-Protein und Blut verändern. Um bei der Bestimmung der optimalen Volumen von Nanopartikeln auf die Urinprobe hinzu zu erleichtern, wird eine Urinanalyse vor Nanopartikel Ernte durchgeführt wird. Urin Biomarker in extrem niedrigen Konzentrationen, was erfordern kann, die Optimierung des Verhältnisses von Nanopartikeln Urinvolumen vorhanden ist. Dieses Verfahren beschreibt, Nanopartikel-Ernte von Urinproben für nachfolgende Western-Blot-Analyse. <ol><li> Sammeln Urinproben in einem sauberen, trockenen Plastikbecher. Ein 22 ml Minimalvolumen ist erforderlich. Shop Urinproben bei -80 ° C bis bereit zu analysieren. </li><li> Auftauen den gefrorenen Urin bei RT oder bei 4 ° CO / N. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Gießen von mindestens 22 ml Urin in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. </li><li> Drehen Sie das Urin in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor bei 3.700 g für 15 min. Man dekantiert die Urin, ohne das Pellet zu stören, in eine saubere 50 ml konischen Boden polypropylene Röhre. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Urinanalyse durchgeführt mit Hilfe eines Multi-Analyt &quot;Urinstäbchen&quot; Reagensstreifen. Hinweis: Die Teststreifen zu speichern in einem dicht geschlossenen Behälter vor direkter Sonneneinstrahlung und Feuchtigkeit 17, 18. <ol><li> Legen Sie den Reagensstreifen, face-up, auf einem sauberen, trockenen Papiertuch. </li><li> Verwenden Sie einen Einweg-Pipetten zu 1 ml Urin in Schritt 2.3 vorbereitet anzusaugen. </li><li> Stellen Sie einen Timer für 2 min aber starten Sie nicht. Schnell verzichtet werden 1 - 2 Tropfen Urin auf jedem Testkissen des Reagenzstreifens. Der Timer sofort zu starten. Hinweis: Das Reagenz Streifen direkt in der Urinbehälter Tauchen Sie. Die Farbstoff / chemischen Indikatoren im Reagenz Streifen kann möglicherweise aus dem Reagensstreifen auslaugen in den Urinbehälter. </li><li> Zu dem Zeitpunkt, zu dem Reagenzstreifen Behälter angegeben, erfassen die qualitativen Ergebnisse der verschiedenen Analyten auf dem Reagenzstreifen durch Vergleich der Farbe der einzelnen Reagenzstreifen zur entsprechenden farbcodierten indicatoren auf der Reagenzienbehälter. Typische normale Urin Ergebnisse sind: (normal oder negativ) für Blut, Eiweiß, Leukozyten, Nitrit, Glucose, Keton, Bilirubin, Urobilinogen und; Urin-pH (5,5-7,0); spezifisches Gewicht (1,001 bis 1,020). Hinweis: Hohe Proteinspiegel in einer Urinprobe mit dem Protein von Interesse für die Bindungsstellen auf den Nanopartikeln zu konkurrieren. Um Protein Ernte mit Nanopartikeln zu maximieren, kann der Nanopartikel Volumen / Volumen-Verhältnis Urin zu beiden Grenz Konkurrenz von Hochfluss-Proteine ​​reguliert werden, oder optimiert werden, um Proteine, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ernten werden. Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen 2x Volumen von Nanopartikeln in Schritt 2.5 unten. Wenn der Analyt von Interesse ein sehr geringer häufigste Protein, kann es notwendig sein, das Volumen der Nanopartikel bis zu 2 ml (Figur 3) zu erhöhen. </li></ol></li><li> 20 ml des geklärten Urin aus Schritt 2.3 in ein sauberes 50-ml-Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. Unterlassen Siestören jeglichen Schmutz / Pellet, das in dem Boden des Urinröhre sein kann. Geben Sie 200 ul von Nanopartikeln auf die 20 ml Urinprobe. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Hinweis: Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen Sie 400 ul von Nanopartikeln auf 20 ml Urin. </li><li> Inkubieren der Urin / Nanopartikelmischung für 30 min bei RT ohne Schaukel / Mischen. </li><li> Drehen Sie das Urin / Nanopartikel-Suspension in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet bei 3.700 g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet ist nicht sichtbar Nach der Zentrifugation spinnen die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. </li><li> Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Sie die Nanopartikel-Lösung für ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Dreh die Nanopartikel in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 16.100 × g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist folgenden Zentrifugation, drehen Sie die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.11 (zweimal) mit 200 ul 18 MilliQ-Wasser, um die Nanopartikel zu waschen. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 970 ul Acetonitril bis 30 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Mit 20 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Dreh die Nanopartikel-Proben bei 16.100 g für 10 min. Entfernen und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. Stören Sie nicht die Nanopartikel-Pellets. Entsorgen Sie die Pellets in der Biohazard Papierkorb. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Rack in einem Laborabzug. Öffnen Sie die Kappen und incUbate bei RT für 30 min. Alternativ legen Sie die Proben unter Stickstoffstrom bei 40 ° C bis trocken (1 - 2 h). </li><li> Werden 15 ul Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2 x) zu den Proben. Hitze bei 100 ° C in einer trockenen Wärmeblock für 5 min mit den Kappen offenen oder bis das Volumen in dem Rohr bleibt, ist nicht mehr als 20 ul. Hinweis: Verwenden Sie kein kochendes Wasserbad. Die Feuchtigkeit aus dem Wasserbad wird die Verdampfung des Puffers zu verhindern. </li><li> Legen Sie den Deckel auf den Rohren. Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Die Probe kann bei -80 ° C gelagert oder sofort für Downstream Western-Blot-Analyse verwendet werden. </li></ol>

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Benjamin Espina is an employee of Ceres Nanosciences, Inc. that produces reagents used in this Article. Lance Liotta, Alessandra Luchini and Virginia Espina hold patents (US patent 7,935,518 and/or 8,497,137) on the nanoparticle technology used in this Article. As university employees they are entitled to receive royalty from these patents per university policy. Lance Liotta and Alessandra Luchini are shareholders in Ceres Nanosciences and serve on the Scientific Advisory Board.

Klinische Relevanz Eine Serum oder Plasmaprobe wird angenommen, niedrig-abundanten zirkulierenden Proteinen und Peptiden, die eine reiche Quelle von Informationen über den Zustand des Organismus als Ganzes bereitstellen können, enthalten. Trotz der Versprechen der Serum Proteomik, gibt es drei grundlegende und schwerwiegende physiologische Barrieren Vereitelung Entdeckung von Biomarkern und die Übersetzung in die klinische Nutzen 10, 11, 16, 25. <p class="j...

Trotz der Beendigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms, hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von Biomarkern nicht prädiktiv frühen Stadium der Erkrankung durchgeführt wurden oder dass mit therapeutischen Ergebnis, Prognose oder 1 korrelieren. Ein Grund für diesen Mangel an Fortschritt ist, dass viele potenziell signifikante Biomarker in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze der konventionellen Massenspektrometrie und andere Biomarker Discovery-Plattformen existieren. Massenspektrometrie (MS) und Multiple Reaction Monitoring (MRM) eine Erfassungsempfindlichkeit in der Regel mehr als 50 ng / ml, während die Mehrheit der Analyten von Immunoassays in klinischen Labors fallen in den Bereich gemessen zwischen 50 pg / ml und 10 ng / ml . Dies bedeutet, dass viele Biomarker, insbesondere im frühen Stadium einer Krankheit nicht durch konventionelle MS MRM und 2 erkannt werden. Neben der Anwesenheit von Hochfluss-Proteine, wie Albumin und Immunglobulin in komplexen biologischen Flüssigkeiten Maske oft Milliarden fache excess Nieder Fülle, geringes Gewicht Proteine ​​und Peptide Molekular 3, 4. Aus diesem Grund mehrere Probenvorbereitungsschritte sind erforderlich, vor der Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung. Eine solche vorbereitenden Schritt setzt die Erschöpfung der Hochfluss-Proteine ​​mit handelsüblichen Erschöpfung Spalten 5-8. Leider ist dieser Schritt führt zur Verringerung der Ausbeute von Biomarker-Kandidaten, weil sie oft nicht-kovalent mit Trägerproteinen, die entfernt werden verbunden. Eine weitere Herausforderung wird durch die Stabilität der Biomarker-Kandidaten Ex-vivo dargestellt, sobald die Proben werden gesammelt. Proteine ​​unterliegen einem Abbau durch endogene oder exogene Proteasen 9. Hydrogel-Nanopartikel können diese kritischen Herausforderungen durch Verstärkung des mutmaßlichen Biomarker-Konzentration auf ein Niveau im Bereich des Assays zu überwinden, während der Schutz für das Protein vor dem Abbau 10-13. Es ist wichtig zu beachten, thbei LMW-Proteinen im Blut sind ein Gemisch von kleinen intakte Proteine ​​als auch Fragmente von großen Proteinen. Gewebe-abgeleitete Proteine ​​größer als 60 kDa sind zu groß, um den Blutstrom durch das Gefäß Basalmembran passiv geben, aber sie können im Blut als Peptide oder Proteinfragmente 14 dargestellt werden. Unser Ziel ist es, neue Umlauf Biomarker, die Kandidaten für die Früherkennung von Krankheiten, zur Stratifizierung von Patienten für die Therapie und Überwachung des Ansprechens auf die Therapie sein kann, zu messen. Unsere Nanopartikel sind geschaffen, um selektiv auszuschließen hoher Häufigkeit Immunglobuline und Albumin, wobei gleichzeitig die Erfassung kleiner Proteine ​​und Peptide und konzentriert sie bis zu 100-fach in Abhängigkeit von dem Ausgangsvolumen. Unsere Gruppe identifiziert eine Reihe von kleinen organischen Farbstoffe, die als hohe Affinität molekularen Köder erfolgreich agieren kann für Proteine ​​und Peptide. Protein-Farbstoff-Bindungs ​​wird angenommen, dass durch eine Kombination von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungs. Die aromatischen Ringe auf dem Farbstoff zu verschachteln mit Proteinen über hydrophobe Taschen auf der Proteinoberfläche 11. Die Köder, abhängig von ihrer Chemie, zeigen eine besondere Affinität für ausgewählte Klassen von Analyten. Die Köder konkurrieren mit den Trägerproteinen, wie Albumin, die für die Proteine ​​oder Peptide. Die niedermolekularen Proteine ​​/ Peptide werden im Partikel gefangen. Hochmolekulare Proteine ​​wie Albumin und Immunglobulin Eindringen von Teilchen durch die Sieb-Fähigkeit aufgrund der restriktiven Poren des Hydrogels 11 (Figur 1) verhindert. Hydrogel-Nanopartikel werden durch Fällung Polymerisation durch Ammoniumpersulfat 11 eingeleitet synthetisiert. N-Isopropylacrylamid (NIPAm) sind Comonomere Acrylsäure (AAc) und Allylamin (AA) und Vernetzer N, N&#39;-Methylenbisacrylamid (BIS) bei 70 ° C für 6 Stunden in verdünnter Lösung 1 reagieren1, 13. Die hohe Proteinbindungsaffinität von Poly (N-isopropylacrylamid-co-Acrylsäure) (Poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis durch kovalente Einbau aminogruppenhaltige Farbstoffe (dh., Sulfonatedanthraquinonetriazine Farbstoffe) in die Nanopartikel durch erreicht eine Amidierungsreaktion in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln in Abhängigkeit von den hydrophilen / hydrophoben Eigenschaften der Farbstoffe durchgeführt 11, 13. nucleophile Substitution der Amingruppen in dem Nanopartikel mit dem Chloratom eines anthraquinonetriazine Farbstoff wird verwendet, um farbstoffhaltige Poly (NIPAm erstellen -CO-allylamin) (AA) Nanopartikel 11, 12. Ein zweistufiges Polymerisationsverfahren wird verwendet, um Hydrogel-Nanopartikel eine äußere Hülle aus Vinylsulfonsäure (VSA) 11, 13 enthält, zu schaffen. Hydrogel-Nanopartikel können auf verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut, Plasma, Serum, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß und Urin verwendet werden. In einem Schritt, in Lösung, die nanoparticles führen Sie eine schnelle (innerhalb von Minuten) Beschlagnahme und Konzentration der niedermolekularen Analyten 10, 11, 13, 15-18. Proteine ​​werden anschließend von den Nanopartikeln eluiert und detektiert unter Verwendung von Western-Blotting 19-21, Massenspektrometrie 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, Immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​oder Umkehrphasen-Protein-Microarray 16, 24 Assays. Nanopartikel mit chemischen Köder funktionalisiert, und präsentiert eine Kern oder Kern-Schale-Architektur, erfassen und konzentrieren Proteine ​​auf der Grundlage der Köder / Schale physikalisch-chemischen Eigenschaften. Verschiedene Farbstoffe in die Nanopartikel eingebracht werden daher erfassen unterschiedliche Untergruppen von Proteinen mit unterschiedlicher Effizienz bezogen auf die Farbstoffaffinität, pH-Wert der Lösung und die Anwesenheit / Abwesenheit von konkurrierenden hochkonzentrierten Proteine ​​13. Darüber hinaus wird die Menge der Nanopartikel in Bezug auf das Volumen der Lösung, die Proteinausbeute aus den Nanopartikeln beeinflussen. Diese Aspekte derHydrogel-Nanopartikel Ernte werden mit drei verschiedenen Nanopartikel Köder zum Ernten von Proteinen aus Plasma-Proben, die große Mengen an Protein enthalten, nachgewiesen und von Urinproben, die in der Regel große Mengen an Protein enthalten. In diesem Protokoll Ernte und konzentriert Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF) aus Plasmaproben unter Verwendung von Poly (NIPAm-co-AAC), Poly (NIPAm / Farbstoff) und Kern-Schale-Nanopartikel zeigen wir (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel gezeigt, Mycobacterium-Spezies-Antigen, das für die menschliche Urinproben hinzugefügt wurde, zu konzentrieren, um Mycobacterium tuberculosis infizierte Personen zu imitieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

Roman Entdeckung neuer Biomarker spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von empfindlicher und spezifischer Nachweis von Krankheiten. Leider sind viele Niedrigfluss Biomarkern, die in biologischen Flüssigkeiten vorliegen können nicht leicht mit Massenspektrometrie oder Immunassays, weil sie in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, sind labil und werden häufig durch Hochfluss Proteine ​​wie Albumin oder Immunglobulin maskiert detektiert werden. Köder, die Poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAm) auf Basis Nanopartikel sind in der Lage, diese physiologischen Barrieren zu überwinden. In einem Schritt sind sie in der Lage, zu erfassen, zu konzentrieren und zu bewahren Biomarkern aus Körperflüssigkeiten. Niedermolekularen Analyten geben Sie den Kern der Nanopartikel und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen, die als hohe Affinität Protein Köder handeln gefangen genommen. Die Nanopartikel können die interessierenden Proteine ​​von mehreren Größenordnungen zu konzentrieren. Dieser Konzentrationsfaktor ausreicht, um den Proteingehalt zu erhöhen, so daß die Proteine ​​in derNachweisgrenze von Strom-Massenspektrometer, Western Blot und Immuntests. Nanopartikel können mit einer Vielzahl von biologischen Flüssigkeiten inkubiert werden und sie in der Lage, die Konzentration der Proteine ​​und Peptide Gewicht niedermolekulare stark anreichern, während ohne Albumin und andere Proteine ​​Gewichtshochmolekularen sind. Unsere Daten zeigen, dass eine 10000-fachen Verstärkung der Konzentration eines bestimmten Analyten erreicht werden kann, wodurch Massenspektrometrie und Immunoassays, zuvor nicht nachweisbar Biomarker zu detektieren.

Hydrogel Nanopartikelgröße und Gleichmäßigkeit Poly (NIPAm-AAC) Teilchen mit extrem hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb der Serie gefertigt. Die Teilchen haben eine sehr gute kolloidale Stabilität bei RT während der Zeit für die Erfassung, Speicherung, und die Elution von Proteinen (mindestens 48 Stunden) erforderlich ist und Nanopartikel Fällung wurde nicht beobachtet (Abbildung 1) 11. Die kolloidale Stabilität k...

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Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Aufrufe.  George Mason University. Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Serie: Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Forschung

Biotechnik

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying cellular responses under various culture conditions in vitro. The three dimensional environment more closely mimics what the cells observe in vivo due to the application of mechanical and chemical stimuli in all dimensions 1. Three-dimensional hydrogels can either be made from synthetic polymers such as PEG-DA 2 and PLGA 3 or a number of naturally occurring proteins such as collagen 4, hyaluronic acid 5 or fibrin 6,7. Hydrogels created from fibrin, a naturally occurring blood clotting protein, can polymerize to form a mesh that is part of the body's natural wound healing processes 8. Fibrin is cell-degradable and potentially autologous 9, making it an ideal temporary scaffold for tissue engineering.
Here we describe in detail the isolation of neonatal cardiomyocytes from three day old rat pups and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. Neonatal myocytes are a common cell source used for in vitro studies in cardiac tissue formation and engineering 4. Fibrin gel is created by mixing fibrinogen with the enzyme thrombin. Thrombin cleaves fibrinopeptides FpA and FpB from fibrinogen, revealing binding sites that interact with other monomers 10. These interactions cause the monomers to self-assemble into fibers that form the hydrogel mesh. Because the timing of this enzymatic reaction can be adjusted by altering the ratio of thrombin to fibrinogen, or the ratio of calcium to thrombin, one can injection mold constructs with a number of different geometries 11,12. Further we can generate alignment of the resulting tissue by how we constrain the gel during culture 13.
After culturing the engineered cardiac tissue constructs for two weeks under static conditions, the cardiac cells have begun to remodel the construct and can generate a contraction force under electrical pacing conditions 6. As part of this protocol, we also describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including functional analysis of the active force generated by the cardiac muscle construct upon electrical stimulation, as well as methods for determining final cell viability (Live-Dead assay) and immunohistological staining to examine the expression and morphology of typical proteins important for contraction (Myosin Heavy Chain or MHC) and cellular coupling (Connexin 43 or Cx43) between myocytes.

We describe the isolation of neonatal cardiomyocytes and the preparation of the cells for encapsulation in fibrin hydrogel constructs for tissue engineering. We describe methods for analyzing the tissue engineered myocardium after the culture period including active force generated upon electrical stimulation and cell viability and immunohistological staining.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Culturing cells in a three dimensional hydrogel environment is an important technique for developing constructs for tissue engineering as well as studying ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

Rod-basierte Herstellung von Anpassbare Weiche Robotic Pneumatic Gripper Geräte für empfindliche Gewebe Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Rod-basierte Herstellung von Anpassbare Weiche Robotic Pneumatic Gripper Geräte für empfindliche Gewebe Manipulation

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

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Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

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