Michael Henry, Dublin City University, freundlich mit der Datenerhebung und Analyse in Abbildung 5 dargestellt unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von (1) George Mason University, (2) die italienische IstitutoSuperiore di Sanita &#39;, die im Rahmen des Italien / USA Kooperationsvereinbarung zwischen dem US Department of Health and Human Services, George Mason University, und dem italienischen Gesundheitsministerium, (3) NIH, IMAT Programm Zuschüsse 1R21CA137706-01 und 1R33CA173359-01 LAL, und (4) Ceres Nanowissenschaften, Inc .

Humanplasma und Urin wurde von gesunden freiwilligen Spendern gesammelt, mit schriftlicher Einwilligung, nach der George Mason University Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Spender wurden zu gleichen Teilen Männer und Frauen kaukasischen im Alter zwischen 25 und 42 Proben wurden einzeln analysiert zwischen verteilten und wurden nicht vereinigt. 1. Nanopartikel Verarbeitung von Serum-oder Plasma-Proben Potential niedrigen reichlich Biomarker im Plasma erfasst, in Lösung, mit Hydrogel-Nanopartikel. Die Teilchen dem Plasma inkubiert, durch Zentrifugation abgetrennt, gewaschen wird und die gefangenen Proteine ​​eluiert werden. Die eluierten Proteine ​​werden unter Stickstoffstrom für Downstream-Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung getrocknet. <ol><li> 500 ul verdünnte Serum 1: 2 mit 50 mM Tris-HCl, pH 7 (500 ul Serum + 500 ul Tris-HCl) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul von Poly (NIPAm / AAC) Kern NanOpArtikel. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Gib 500 ul Natriumthiocyanat (25 mM) zu dem Pellet. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 700 ul Acetonitril bis 300 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss prep seinaRoten unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Werden 300 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und speichern Sie das Eluat in einem sauberen, beschriftet Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,9 bis 1,10. Kombinieren Sie die beiden Eluate in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Trocknen Sie die Eluate unter Stickstoffstrom in einem Stickstoffverdampfer Verteiler an 42,1 ° C, mit einem Luftstrom bis 8 (2F) eingestellt. </li><li> Das getrocknete Eluat bei RT O / N Lagerung oder bei -20 ° C für die Langzeitspeicherung, vor Massenspektrometrie, Western Blot oder ELISA-Tests (optional). </li></ol> 2. Nanopartikel Verarbeitung von Urinproben Normaler Urin enthält weniger als 30 mg / dl Protein undweniger als 1 + Blut. Doch viele Krankheiten / Bedingungen können die normalen Niveaus der Urin-Protein und Blut verändern. Um bei der Bestimmung der optimalen Volumen von Nanopartikeln auf die Urinprobe hinzu zu erleichtern, wird eine Urinanalyse vor Nanopartikel Ernte durchgeführt wird. Urin Biomarker in extrem niedrigen Konzentrationen, was erfordern kann, die Optimierung des Verhältnisses von Nanopartikeln Urinvolumen vorhanden ist. Dieses Verfahren beschreibt, Nanopartikel-Ernte von Urinproben für nachfolgende Western-Blot-Analyse. <ol><li> Sammeln Urinproben in einem sauberen, trockenen Plastikbecher. Ein 22 ml Minimalvolumen ist erforderlich. Shop Urinproben bei -80 ° C bis bereit zu analysieren. </li><li> Auftauen den gefrorenen Urin bei RT oder bei 4 ° CO / N. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Gießen von mindestens 22 ml Urin in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. </li><li> Drehen Sie das Urin in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor bei 3.700 g für 15 min. Man dekantiert die Urin, ohne das Pellet zu stören, in eine saubere 50 ml konischen Boden polypropylene Röhre. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Urinanalyse durchgeführt mit Hilfe eines Multi-Analyt &quot;Urinstäbchen&quot; Reagensstreifen. Hinweis: Die Teststreifen zu speichern in einem dicht geschlossenen Behälter vor direkter Sonneneinstrahlung und Feuchtigkeit 17, 18. <ol><li> Legen Sie den Reagensstreifen, face-up, auf einem sauberen, trockenen Papiertuch. </li><li> Verwenden Sie einen Einweg-Pipetten zu 1 ml Urin in Schritt 2.3 vorbereitet anzusaugen. </li><li> Stellen Sie einen Timer für 2 min aber starten Sie nicht. Schnell verzichtet werden 1 - 2 Tropfen Urin auf jedem Testkissen des Reagenzstreifens. Der Timer sofort zu starten. Hinweis: Das Reagenz Streifen direkt in der Urinbehälter Tauchen Sie. Die Farbstoff / chemischen Indikatoren im Reagenz Streifen kann möglicherweise aus dem Reagensstreifen auslaugen in den Urinbehälter. </li><li> Zu dem Zeitpunkt, zu dem Reagenzstreifen Behälter angegeben, erfassen die qualitativen Ergebnisse der verschiedenen Analyten auf dem Reagenzstreifen durch Vergleich der Farbe der einzelnen Reagenzstreifen zur entsprechenden farbcodierten indicatoren auf der Reagenzienbehälter. Typische normale Urin Ergebnisse sind: (normal oder negativ) für Blut, Eiweiß, Leukozyten, Nitrit, Glucose, Keton, Bilirubin, Urobilinogen und; Urin-pH (5,5-7,0); spezifisches Gewicht (1,001 bis 1,020). Hinweis: Hohe Proteinspiegel in einer Urinprobe mit dem Protein von Interesse für die Bindungsstellen auf den Nanopartikeln zu konkurrieren. Um Protein Ernte mit Nanopartikeln zu maximieren, kann der Nanopartikel Volumen / Volumen-Verhältnis Urin zu beiden Grenz Konkurrenz von Hochfluss-Proteine ​​reguliert werden, oder optimiert werden, um Proteine, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ernten werden. Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen 2x Volumen von Nanopartikeln in Schritt 2.5 unten. Wenn der Analyt von Interesse ein sehr geringer häufigste Protein, kann es notwendig sein, das Volumen der Nanopartikel bis zu 2 ml (Figur 3) zu erhöhen. </li></ol></li><li> 20 ml des geklärten Urin aus Schritt 2.3 in ein sauberes 50-ml-Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. Unterlassen Siestören jeglichen Schmutz / Pellet, das in dem Boden des Urinröhre sein kann. Geben Sie 200 ul von Nanopartikeln auf die 20 ml Urinprobe. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Hinweis: Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen Sie 400 ul von Nanopartikeln auf 20 ml Urin. </li><li> Inkubieren der Urin / Nanopartikelmischung für 30 min bei RT ohne Schaukel / Mischen. </li><li> Drehen Sie das Urin / Nanopartikel-Suspension in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet bei 3.700 g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet ist nicht sichtbar Nach der Zentrifugation spinnen die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. </li><li> Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Sie die Nanopartikel-Lösung für ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Dreh die Nanopartikel in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 16.100 × g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist folgenden Zentrifugation, drehen Sie die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.11 (zweimal) mit 200 ul 18 MilliQ-Wasser, um die Nanopartikel zu waschen. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 970 ul Acetonitril bis 30 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Mit 20 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Dreh die Nanopartikel-Proben bei 16.100 g für 10 min. Entfernen und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. Stören Sie nicht die Nanopartikel-Pellets. Entsorgen Sie die Pellets in der Biohazard Papierkorb. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Rack in einem Laborabzug. Öffnen Sie die Kappen und incUbate bei RT für 30 min. Alternativ legen Sie die Proben unter Stickstoffstrom bei 40 ° C bis trocken (1 - 2 h). </li><li> Werden 15 ul Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2 x) zu den Proben. Hitze bei 100 ° C in einer trockenen Wärmeblock für 5 min mit den Kappen offenen oder bis das Volumen in dem Rohr bleibt, ist nicht mehr als 20 ul. Hinweis: Verwenden Sie kein kochendes Wasserbad. Die Feuchtigkeit aus dem Wasserbad wird die Verdampfung des Puffers zu verhindern. </li><li> Legen Sie den Deckel auf den Rohren. Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Die Probe kann bei -80 ° C gelagert oder sofort für Downstream Western-Blot-Analyse verwendet werden. </li></ol>

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Benjamin Espina is an employee of Ceres Nanosciences, Inc. that produces reagents used in this Article. Lance Liotta, Alessandra Luchini and Virginia Espina hold patents (US patent 7,935,518 and/or 8,497,137) on the nanoparticle technology used in this Article. As university employees they are entitled to receive royalty from these patents per university policy. Lance Liotta and Alessandra Luchini are shareholders in Ceres Nanosciences and serve on the Scientific Advisory Board.

Klinische Relevanz Eine Serum oder Plasmaprobe wird angenommen, niedrig-abundanten zirkulierenden Proteinen und Peptiden, die eine reiche Quelle von Informationen über den Zustand des Organismus als Ganzes bereitstellen können, enthalten. Trotz der Versprechen der Serum Proteomik, gibt es drei grundlegende und schwerwiegende physiologische Barrieren Vereitelung Entdeckung von Biomarkern und die Übersetzung in die klinische Nutzen 10, 11, 16, 25. <p class="j...

Trotz der Beendigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms, hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von Biomarkern nicht prädiktiv frühen Stadium der Erkrankung durchgeführt wurden oder dass mit therapeutischen Ergebnis, Prognose oder 1 korrelieren. Ein Grund für diesen Mangel an Fortschritt ist, dass viele potenziell signifikante Biomarker in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze der konventionellen Massenspektrometrie und andere Biomarker Discovery-Plattformen existieren. Massenspektrometrie (MS) und Multiple Reaction Monitoring (MRM) eine Erfassungsempfindlichkeit in der Regel mehr als 50 ng / ml, während die Mehrheit der Analyten von Immunoassays in klinischen Labors fallen in den Bereich gemessen zwischen 50 pg / ml und 10 ng / ml . Dies bedeutet, dass viele Biomarker, insbesondere im frühen Stadium einer Krankheit nicht durch konventionelle MS MRM und 2 erkannt werden. Neben der Anwesenheit von Hochfluss-Proteine, wie Albumin und Immunglobulin in komplexen biologischen Flüssigkeiten Maske oft Milliarden fache excess Nieder Fülle, geringes Gewicht Proteine ​​und Peptide Molekular 3, 4. Aus diesem Grund mehrere Probenvorbereitungsschritte sind erforderlich, vor der Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung. Eine solche vorbereitenden Schritt setzt die Erschöpfung der Hochfluss-Proteine ​​mit handelsüblichen Erschöpfung Spalten 5-8. Leider ist dieser Schritt führt zur Verringerung der Ausbeute von Biomarker-Kandidaten, weil sie oft nicht-kovalent mit Trägerproteinen, die entfernt werden verbunden. Eine weitere Herausforderung wird durch die Stabilität der Biomarker-Kandidaten Ex-vivo dargestellt, sobald die Proben werden gesammelt. Proteine ​​unterliegen einem Abbau durch endogene oder exogene Proteasen 9. Hydrogel-Nanopartikel können diese kritischen Herausforderungen durch Verstärkung des mutmaßlichen Biomarker-Konzentration auf ein Niveau im Bereich des Assays zu überwinden, während der Schutz für das Protein vor dem Abbau 10-13. Es ist wichtig zu beachten, thbei LMW-Proteinen im Blut sind ein Gemisch von kleinen intakte Proteine ​​als auch Fragmente von großen Proteinen. Gewebe-abgeleitete Proteine ​​größer als 60 kDa sind zu groß, um den Blutstrom durch das Gefäß Basalmembran passiv geben, aber sie können im Blut als Peptide oder Proteinfragmente 14 dargestellt werden. Unser Ziel ist es, neue Umlauf Biomarker, die Kandidaten für die Früherkennung von Krankheiten, zur Stratifizierung von Patienten für die Therapie und Überwachung des Ansprechens auf die Therapie sein kann, zu messen. Unsere Nanopartikel sind geschaffen, um selektiv auszuschließen hoher Häufigkeit Immunglobuline und Albumin, wobei gleichzeitig die Erfassung kleiner Proteine ​​und Peptide und konzentriert sie bis zu 100-fach in Abhängigkeit von dem Ausgangsvolumen. Unsere Gruppe identifiziert eine Reihe von kleinen organischen Farbstoffe, die als hohe Affinität molekularen Köder erfolgreich agieren kann für Proteine ​​und Peptide. Protein-Farbstoff-Bindungs ​​wird angenommen, dass durch eine Kombination von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungs. Die aromatischen Ringe auf dem Farbstoff zu verschachteln mit Proteinen über hydrophobe Taschen auf der Proteinoberfläche 11. Die Köder, abhängig von ihrer Chemie, zeigen eine besondere Affinität für ausgewählte Klassen von Analyten. Die Köder konkurrieren mit den Trägerproteinen, wie Albumin, die für die Proteine ​​oder Peptide. Die niedermolekularen Proteine ​​/ Peptide werden im Partikel gefangen. Hochmolekulare Proteine ​​wie Albumin und Immunglobulin Eindringen von Teilchen durch die Sieb-Fähigkeit aufgrund der restriktiven Poren des Hydrogels 11 (Figur 1) verhindert. Hydrogel-Nanopartikel werden durch Fällung Polymerisation durch Ammoniumpersulfat 11 eingeleitet synthetisiert. N-Isopropylacrylamid (NIPAm) sind Comonomere Acrylsäure (AAc) und Allylamin (AA) und Vernetzer N, N&#39;-Methylenbisacrylamid (BIS) bei 70 ° C für 6 Stunden in verdünnter Lösung 1 reagieren1, 13. Die hohe Proteinbindungsaffinität von Poly (N-isopropylacrylamid-co-Acrylsäure) (Poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis durch kovalente Einbau aminogruppenhaltige Farbstoffe (dh., Sulfonatedanthraquinonetriazine Farbstoffe) in die Nanopartikel durch erreicht eine Amidierungsreaktion in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln in Abhängigkeit von den hydrophilen / hydrophoben Eigenschaften der Farbstoffe durchgeführt 11, 13. nucleophile Substitution der Amingruppen in dem Nanopartikel mit dem Chloratom eines anthraquinonetriazine Farbstoff wird verwendet, um farbstoffhaltige Poly (NIPAm erstellen -CO-allylamin) (AA) Nanopartikel 11, 12. Ein zweistufiges Polymerisationsverfahren wird verwendet, um Hydrogel-Nanopartikel eine äußere Hülle aus Vinylsulfonsäure (VSA) 11, 13 enthält, zu schaffen. Hydrogel-Nanopartikel können auf verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut, Plasma, Serum, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß und Urin verwendet werden. In einem Schritt, in Lösung, die nanoparticles führen Sie eine schnelle (innerhalb von Minuten) Beschlagnahme und Konzentration der niedermolekularen Analyten 10, 11, 13, 15-18. Proteine ​​werden anschließend von den Nanopartikeln eluiert und detektiert unter Verwendung von Western-Blotting 19-21, Massenspektrometrie 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, Immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​oder Umkehrphasen-Protein-Microarray 16, 24 Assays. Nanopartikel mit chemischen Köder funktionalisiert, und präsentiert eine Kern oder Kern-Schale-Architektur, erfassen und konzentrieren Proteine ​​auf der Grundlage der Köder / Schale physikalisch-chemischen Eigenschaften. Verschiedene Farbstoffe in die Nanopartikel eingebracht werden daher erfassen unterschiedliche Untergruppen von Proteinen mit unterschiedlicher Effizienz bezogen auf die Farbstoffaffinität, pH-Wert der Lösung und die Anwesenheit / Abwesenheit von konkurrierenden hochkonzentrierten Proteine ​​13. Darüber hinaus wird die Menge der Nanopartikel in Bezug auf das Volumen der Lösung, die Proteinausbeute aus den Nanopartikeln beeinflussen. Diese Aspekte derHydrogel-Nanopartikel Ernte werden mit drei verschiedenen Nanopartikel Köder zum Ernten von Proteinen aus Plasma-Proben, die große Mengen an Protein enthalten, nachgewiesen und von Urinproben, die in der Regel große Mengen an Protein enthalten. In diesem Protokoll Ernte und konzentriert Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF) aus Plasmaproben unter Verwendung von Poly (NIPAm-co-AAC), Poly (NIPAm / Farbstoff) und Kern-Schale-Nanopartikel zeigen wir (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel gezeigt, Mycobacterium-Spezies-Antigen, das für die menschliche Urinproben hinzugefügt wurde, zu konzentrieren, um Mycobacterium tuberculosis infizierte Personen zu imitieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

Roman Entdeckung neuer Biomarker spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von empfindlicher und spezifischer Nachweis von Krankheiten. Leider sind viele Niedrigfluss Biomarkern, die in biologischen Flüssigkeiten vorliegen können nicht leicht mit Massenspektrometrie oder Immunassays, weil sie in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, sind labil und werden häufig durch Hochfluss Proteine ​​wie Albumin oder Immunglobulin maskiert detektiert werden. Köder, die Poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAm) auf Basis Nanopartikel sind in der Lage, diese physiologischen Barrieren zu überwinden. In einem Schritt sind sie in der Lage, zu erfassen, zu konzentrieren und zu bewahren Biomarkern aus Körperflüssigkeiten. Niedermolekularen Analyten geben Sie den Kern der Nanopartikel und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen, die als hohe Affinität Protein Köder handeln gefangen genommen. Die Nanopartikel können die interessierenden Proteine ​​von mehreren Größenordnungen zu konzentrieren. Dieser Konzentrationsfaktor ausreicht, um den Proteingehalt zu erhöhen, so daß die Proteine ​​in derNachweisgrenze von Strom-Massenspektrometer, Western Blot und Immuntests. Nanopartikel können mit einer Vielzahl von biologischen Flüssigkeiten inkubiert werden und sie in der Lage, die Konzentration der Proteine ​​und Peptide Gewicht niedermolekulare stark anreichern, während ohne Albumin und andere Proteine ​​Gewichtshochmolekularen sind. Unsere Daten zeigen, dass eine 10000-fachen Verstärkung der Konzentration eines bestimmten Analyten erreicht werden kann, wodurch Massenspektrometrie und Immunoassays, zuvor nicht nachweisbar Biomarker zu detektieren.

Hydrogel Nanopartikelgröße und Gleichmäßigkeit Poly (NIPAm-AAC) Teilchen mit extrem hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb der Serie gefertigt. Die Teilchen haben eine sehr gute kolloidale Stabilität bei RT während der Zeit für die Erfassung, Speicherung, und die Elution von Proteinen (mindestens 48 Stunden) erforderlich ist und Nanopartikel Fällung wurde nicht beobachtet (Abbildung 1) 11. Die kolloidale Stabilität k...

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Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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