مايكل هنري، جامعة مدينة دبلن، يرجى المساعدة في جمع البيانات وتحليلها هو مبين في الشكل 5. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) جامعة جورج ماسون، (2) الإيطالية IstitutoSuperiore دي سانيتا &quot;في إطار ايطاليا / الولايات المتحدة الأمريكية اتفاقية تعاون بين وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، جامعة جورج ماسون، والوزارة الإيطالية للصحة العامة، (3) NIH، برنامج المنح IMAT 1R21CA137706-01 و1R33CA173359-01 إلى LAL، و (4) سيريس العلوم النانوية، وشركة .

وقد تم جمع البلازما البشرية والبول من المانحين المتطوعين صحية، مع الموافقة المسبقة الخطية، بعد الموافقة عليها جامعة جورج ميسون مجلس المراجعة المؤسسية البروتوكولات. تم توزيع المانحين بالتساوي بين الذكور والإناث القوقاز الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 42. عينات تم تحليلها بشكل فردي، ولم تجميع. 1. جسيمات متناهية الصغر تجهيز المصل أو البلازما عينات يتم التقاط المؤشرات الحيوية المحتملة وفيرة منخفضة في البلازما، في الحل، مع الجسيمات النانوية هيدروجيل. تضاف الجزيئات إلى البلازما، والمحتضنة، مفصولة الطرد المركزي، وغسلها، ومزال البروتينات القبض عليه. يتم تجفيفها البروتينات مزال تحت تدفق النيتروجين لالمصب الشامل تسلسل الطيف وتحديد الهوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 500 ميكرولتر من المصل 1: 2 مع 50 ملي TrisHCl درجة الحموضة 7 (500 ميكرولتر مصل + 500 ميكرولتر TrisHCl) في أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من بولي (NIPAm / AAC) nanop الأساسيةالمقالات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر ثيوسيانات الصوديوم (25 ملم) لبيليه. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من المياه MilliQ إلى بيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شطف العازلة الطازجة: إضافة 700 ميكرولتر أسيتونتريل إلى 300 هيدروكسيد الأمونيوم ميكرولتر في أنبوب نظيفة. الحذر: هيدروكسيد الأمونيوم غير قابلة للتآكل. مع استخدام التهوية المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون شطف العازلة الإعداديةعرب كورب فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين شطف العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 300 ميكرولتر من شطف العازلة لبيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينة في 16،100 x ج، 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة. إزالة وحفظ شطافة في نظيفة، وصفت أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 1،9 حتي 1،10. الجمع بين اثنين الى واحد eluates أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف eluates تحت تدفق النيتروجين في مشعب المبخر النيتروجين في 42.1 درجة مئوية، مع وضع تدفق الهواء إلى 8 (الشكل 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين شطافة المجففة في RT لO / N التخزين، أو في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل، وذلك قبل مطياف الكتلة، النشاف الغربي، أو فحوصات ELISA (اختياري). </li></ol> 2. تصنيع جسيمات متناهية الصغر من عينات البول يحتوي البول الطبيعي أقل من 30 ملغ / ديسيلتر البروتين وأقل من 1+ الدم. ومع ذلك، كثير من الأمراض / الأحكام قد يغير مستويات طبيعية من بروتين البول والدم. للمساعدة في تحديد حجم الأمثل للالنانوية إضافة إلى عينة البول، ويتم إجراء تحليل البول قبل الحصاد جسيمات متناهية الصغر. قد توجد البول المؤشرات الحيوية في تركيزات منخفضة للغاية، والتي قد تتطلب تحسين نسبة الجسيمات النانوية إلى حجم البول. يصف هذا الإجراء تجميع جسيمات متناهية الصغر من عينات البول لتحليل لطخة المصب الغربي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات البول في نظيفة، كوب من البلاستيك الجاف. مطلوب 22 مل حجم الحد الأدنى. عينات البول المخزن في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد البول المجمدة في RT أو عند 4 درجة CO / N. مزيج لفترة وجيزة على خلاط دوامة. صب لا يقل عن 22 مل من البول إلى قاع مخروطي 50 مل أنبوب البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور البول في جهاز للطرد المركزي مع الدوار سوينغ التدريجي في 3،700 x ج لمدة 15 دقيقة. صب البول، من دون إزعاج بيليه، إلى أسفل نظيفة polypr 50 مل المخروطيةأنبوب opylene. تجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل البول باستخدام متعددة الحليلة &quot;البول مقياس&quot; الشريط الكاشف. ملاحظة: تخزين أشرطة الكاشف في حاوية مغلقة بإحكام بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة والرطوبة 17 و 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريط الكاشف، وجها حتى، على نظيفة، منشفة ورقية جافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة المتاح لنضح 1 مل من البول أعدت في الخطوة 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد توقيت لمدة 2 دقيقة ولكن لا تشغيله. الاستغناء بسرعة 1 - 2 قطرات من البول في كل لوحة اختبار الشريط الكاشف. بدء فورا في الموقت. ملاحظة: لا يغرق قطاع كاشف مباشرة في الحاوية البول. المؤشرات صبغ / الكيميائية في قطاع كاشف يحتمل أن يتسرب من قطاع كاشف في وعاء البول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الوقت المشار إليه على الحاوية الشريط الكاشف، تسجيل النتائج النوعية للالتحاليل المختلفة على الشريط الكاشف بمقارنة لون الشرائط كاشف الفردية إلى مرمزة المقابل إنديكاالاختصاصات على الحاوية كاشف. نموذجية نتائج البول طبيعية هي: (عادي أو سلبية) للدماء، والبروتين، الكريات البيض، النتريت، والجلوكوز، كيتون، البيليروبين، ويوروبيلينوجين. درجة الحموضة البول (5،5-7،0). الثقل النوعي (1،001-1،020). ملاحظة: مستويات عالية من البروتين في عينة البول قد يتنافس مع البروتين من الفائدة للمواقع على الجسيمات النانوية ملزمة. لتعظيم حصاد بروتين مع الجسيمات النانوية، وحجم جسيمات متناهية الصغر / نسبة حجم البول يمكن تعديلها إما المنافسة الحد من وفرة البروتينات عالية، أو يمكن أن يكون الأمثل لحصاد البروتينات التي توجد في تركيزات منخفضة للغاية. إذا كانت قيمة بروتين البول هي 1+ أو أكثر، وإضافة وحدات 2X النانوية في الخطوة 2.5 أدناه. إذا الحليلة الاهتمام هو وفرة البروتين المنخفض جدا، قد يكون من الضروري زيادة حجم الجسيمات النانوية لتصل إلى 2 مل (الشكل 3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 مل من البول أوضح من الخطوة 2.3 إلى تنظيف قاع مخروطي 50 مل أنبوب البولي بروبلين. لاتخل أي حطام / بيليه التي قد تكون في الجزء السفلي من أنبوب البول. إضافة 200 ميكرولتر من الجسيمات النانوية لعينة البول 20 مل. مزيج لفترة وجيزة على خلاط دوامة. ملاحظة: إذا كانت قيمة بروتين البول هي 1+ أو أكثر، إضافة 400 ميكرولتر من الجسيمات النانوية إلى 20 مل البول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط البول / جسيمات متناهية الصغر لمدة 30 دقيقة في RT، دون هزاز / الاختلاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور تعليق البول / جسيمات متناهية الصغر في جهاز للطرد المركزي مجهزة الدوار سوينغ التدريجي في 3،700 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا كان بيليه هو غير مرئي الطرد المركزي يلي، وتدور في عينات لعدد إضافي من 2-7 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل طاف. إضافة الماء 500 ميكرولتر MilliQ إلى بيليه جسيمات متناهية الصغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل الحل إلى جسيمات متناهية الصغر نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الجسيمات النانوية في أجهزة الطرد المركزي مجهزة الدوار زاوية ثابتة في 16،100 x ج لمدة 10 دقيقة. ملاحظة: إذا كان بيليه ليس فل مرئيةخوار الطرد المركزي، وتدور في عينات لعدد إضافي من 2-7 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.8 و 2.11 (مرتين) مع 200 ميكرولتر 18 MilliQ المياه لغسل النانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد شطف العازلة الطازجة: إضافة 970 ميكرولتر أسيتونتريل إلى 30 هيدروكسيد الأمونيوم ميكرولتر في أنبوب نظيفة. الحذر: هيدروكسيد الأمونيوم غير قابلة للتآكل. مع استخدام التهوية المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا المخزن المؤقت شطف فورا قبل الاستخدام. لا تقم بتخزين شطف العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر شطف العازلة لبيليه جسيمات متناهية الصغر. Resuspend والجسيمات النانوية من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينات جسيمات متناهية الصغر في 16،100 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة وحفظ طاف في نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. لا تعطيل بيليه جسيمات متناهية الصغر. تجاهل بيليه في سلة المهملات واقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات في رف في غطاء الدخان الكيميائي. فتح القبعات والمؤتمر الوطني العراقيأوباتي في RT لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، وضع العينات تحت تدفق النيتروجين عند 40 درجة مئوية حتى الجافة (1 - 2 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر تريس، جليكاين العازلة عينة SDS (2X) للعينات. الحرارة عند 100 درجة مئوية في كتلة الحرارة الجافة لمدة 5 دقائق مع قبعات مفتوحة أو حتى حجم اليسار في أنبوب ليس أكثر من 20 ميكرولتر. ملاحظة: عدم استخدام حمام الماء المغلي. فإن الرطوبة من حمام الماء يمنع تبخر المخزن المؤقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غطاء على الأنابيب. إزالة أنابيب من كتلة الحرارة. ويمكن تخزين العينة في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لالمصب تحليل لطخة الغربي. </li></ol>

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Gerszten, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+translating+plasma+proteomics+from+bench+to+bedside:+update+from+the+NHLBI+Clinical+Proteomics+Programs.">Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).</li><li>Merrell, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+low-abundance,+low-molecular-weight+serum+proteins+using+mass+spectrometry.">Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry.</a> J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).</li><li>Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood+peptidome:+a+higher+dimension+of+information+content+for+cancer+biomarker+discovery.">The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery.</a> Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).</li><li>Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+selective+isolation+and+enrichment+of+carrier+protein-bound+low-molecular+weight+proteins+and+peptides+in+the+blood.">A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood.</a> Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).</li><li>Geho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionation+of+serum+components+using+nanoporous+substrates.">Fractionation of serum components using nanoporous substrates.</a> Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).</li><li>Sennels, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+human+blood+serum+using+peptide+library+beads.">Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads.</a> J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).</li><li>Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+low+molecular+weight+serum+peptidome+using+ultrafiltration+and+a+hybrid+ion+trap-Fourier+transform+mass+spectrometer.">Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer.</a> J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).</li><li>Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+serum+proteins+underlies+the+mass+spectral+fingerprinting+of+myocardial+infarction.">Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction.</a> J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+Preservation+of+Very+Low+Abundance+Biomarkers+in+Urine,+such+as+Human+Growth+Hormone+(hGH),+by+Cibacron+Blue+F3G-A+Loaded+Hydrogel+Particles.">Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles.</a> Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+hydrogel+particles:+biomarker+harvesting:+one-step+affinity+purification,+size+exclusion,+and+protection+against+degradation.">Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation.</a> Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).</li><li>Patanarut, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+hydrogel+particles+containing+Cibacron+Blue+F3G-A.">Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A.</a> Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).</li><li>Tamburro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+core-shell+nanoparticles:+discovery+of+previously+invisible+biomarkers.">Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).</li><li>Anderson, N. L., Anderson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+plasma+proteome:+history,+character,+and+diagnostic+prospects.">The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+amplifying+the+effective+sensitivity+of+biomarker+detection+to+create+a+urine+test+for+hGH.">Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH.</a> Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).</li><li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+particles+harvest,+concentrate+and+preserve+labile+low+abundance+biomarkers.">Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers.</a> PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery.">Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).</li><li>Luchini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Analyte+Harvesting+Nanoparticle+Technology+to+the+Measurement+of+Urinary+HGH+in+Healthy+Individuals.">Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals.</a> J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=blotting:+sample+preparation+to+detection.">blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Penna, A., Cahalan, M., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels.">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (7), 264 (2007).</li><li>Bosch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+urinary+human+growth+hormone+(hGH)+using+hydrogel+nanoparticles+and+isoform+differential+immunoassays+after+short+recombinant+hGH+treatment:+preliminary+results.">Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results.</a> J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+ovarian+and+prostate+cancer+peptidome+for+candidate+early+detection+markers+using+a+novel+nanoparticle+biomarker+capture+technology.">Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology.</a> AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).</li><li>Longo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+biomarker+harvesting+nanotechnology+identifies+Bak+as+a+candidate+melanoma+biomarker+in+serum.">A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum.</a> Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).</li><li>Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+technology:+Addressing+the+fundamental+roadblocks+to+protein+biomarker+discovery.">Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery.</a> J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).</li><li>Douglas, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+hydrogel+microparticles+to+sequester+and+concentrate+bacterial+antigens+in+a+urine+test+for+Lyme+disease.">The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease.</a> Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).</li><li>Prakash, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+reproducibility+of+selective+reaction+monitoring+assays+using+multiple+upfront+analyte+enrichment+strategies.">Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies.</a> J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).</li><li>Choi, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+lipocalin-2+and+visfatin+levels+in+patients+with+coronary+heart+disease.">Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease.</a> Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).</li><li>Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor+(PDGF):+actions+and+mechanisms+in+vascular+smooth+muscle.">Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle.</a> Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).</li><li>Izycki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+levels+of+IGF-I+and+IGF-II+in+patients+with+lung+cancer+during+chemotherapy.">Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy.</a> Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).</li><li>Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+methylprednisolone+and+mitoxantrone+on+CCL5-induced+migration+of+lymphocytes+in+multiple+sclerosis.">The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis.</a> Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).</li><li>Kitazume, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+insights+into+beta-galactoside+alpha2,6-sialyltransferase+secretion+in+vivo.">Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo.</a> Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+hepatic+NKT+cells+in+leukocyte+cell-derived+chemotaxin+2-deficient+mice+contributes+to+severe+concanavalin+A-induced+hepatitis.">Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).</li><li>Struyf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARC/CCL18+is+a+plasma+CC+chemokine+with+increased+levels+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia.">PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).</li><li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression.">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li></ol>

Benjamin Espina is an employee of Ceres Nanosciences, Inc. that produces reagents used in this Article. Lance Liotta, Alessandra Luchini and Virginia Espina hold patents (US patent 7,935,518 and/or 8,497,137) on the nanoparticle technology used in this Article. As university employees they are entitled to receive royalty from these patents per university policy. Lance Liotta and Alessandra Luchini are shareholders in Ceres Nanosciences and serve on the Scientific Advisory Board.

الصلة السريرية ويعتقد أن المصل أو البلازما عينة لاحتواء منخفضة وفرة البروتينات والببتيدات المنتشرة التي يمكن أن توفر مصدرا غنيا للمعلومات عن حالة الكائن الحي ككل. على الرغم من الوعد البروتينات في الدم، وهناك ثلاثة حوا?...

على الرغم من الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري، لم يتم إحراز تقدم كبير في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية المرض مرحلة مبكرة، أو التي ترتبط مع نتائج علاجية، أو التكهن 1. وأحد أسباب ذلك عدم إحراز تقدم هو أن العديد من المؤشرات الحيوية الهامة المحتملة توجد بتركيز أقل من حد الكشف عن مطياف الكتلة التقليدية وغيرها من منصات اكتشاف العلامات البيولوجية. مطياف الكتلة (MS) ومتعددة رصد رد الفعل (MRM) لديهم حساسية الكشف عادة أكبر من 50 نانوغرام / مل في حين أن الغالبية العظمى من التحاليل المناعية تقاس في سقوط المختبر السريري في نطاق بين 50 جزء من الغرام / مل و 10 نانوغرام / مل . وهذا يعني أن العديد من المؤشرات الحيوية، وخاصة في المرحلة المبكرة من المرض لا يمكن الكشف عنها بواسطة MS التقليدية وMRM 2. وبالإضافة إلى ذلك وجود وفرة عالية من البروتينات مثل الألبومين والغلوبولين المناعي في السوائل البيولوجية المعقدة غالبا ما تخفي من مليار أضعاف مريض بالحبوفاق سطيف منخفضة وفرة، منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات والببتيدات 3، 4، ولهذا السبب هناك حاجة العديد من الخطوات التحضيرية عينة قبل التسلسل الطيف الكتلي وتحديد الهوية. إحدى هذه خطوة تمهيدية توظف استنزاف البروتينات عالية فرة مع الأعمدة استنزاف المتاحة تجاريا 5-8. للأسف هذه الخطوة تؤدي إلى تخفيض العائد من المؤشرات الحيوية مرشح لأنها غالبا ما تكون مرتبطة تساهميا مع غير البروتينات الحاملة التي يتم إزالتها. ويمثل تحديا آخر من استقرار المؤشرات الحيوية مرشح فيفو السابقين مرة واحدة يتم جمع العينات. بروتينات قابلة للتحلل بواسطة البروتياز الذاتية أو الخارجية 9. يمكن النانوية هيدروجيل تجاوز هذه التحديات الحرجة عن طريق تضخيم تركيز العلامات البيولوجية المفترضة إلى مستوى ضمن نطاق الفحص، مع حماية البروتين من تدهور 10-13. من المهم أن نلاحظ عشرفي LMW البروتينات في الدم هي مزيج من البروتينات سليمة الصغيرة وكذلك أجزاء كبيرة من البروتينات. البروتينات المشتقة من الأنسجة أكبر من 60 كيلو دالتون كبيرة جدا للدخول بشكل سلبي مجرى الدم من خلال الغشاء القاعدي الأوعية الدموية، ولكنها يمكن أن تمثل في الدم والببتيدات أو شظايا البروتين 14. هدفنا هو قياس المؤشرات الحيوية تعميم الرواية التي يمكن أن تكون مرشحة للكشف المبكر عن المرض، والطبقية المريض للعلاج، ومراقبة الاستجابة للعلاج. يتم إنشاء النانوية جهدنا لاستبعاد انتقائي المناعية وفرة عالية والزلال، في وقت واحد أثناء التقاط البروتينات والببتيدات الصغيرة والتركيز عليها ما يصل إلى 100 أضعاف اعتمادا على حجم انطلاق. حددت مجموعتنا مجموعة من الأصباغ العضوية الصغيرة التي يمكن أن تعمل بنجاح تقارب عالية والطعوم الجزيئية للبروتينات والببتيدات. ويعتقد ملزم البروتين صبغ أن يكون نتيجة لمزيج من التفاعل مسعور وكهرباءق. الحلقات العطرية على صبغ تعشيق مع البروتينات عبر جيوب مسعور على سطح البروتين 11. الطعوم، اعتمادا على الكيمياء، وتظهر تقارب معين لفئات مختارة من التحاليل. الطعوم تتنافس مع البروتينات الحاملة، مثل الزلال، على البروتينات أو الببتيدات. منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات / الببتيدات تصبح المحاصرين في الجسيمات. يتم منع البروتينات عالية الوزن الجزيئي مثل الألبومين والغلوبولين المناعي من دخول الجسيمات بسبب القدرة النخل بسبب المسام تقييدا ​​من هيدروجيل 11 (الشكل 1). وقد تم تجميع الجسيمات النانوية هيدروجيل من قبل هطول البلمرة التي بدأها بيرسلفات الأمونيوم 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm)، يسمح شارك أحادية من حمض الاكريليك (AAC) وآليلامين (AA) وعبر رابط N، N&#39;-Methylenebisacrylamide (BIS) للرد على 70 درجة مئوية لمدة 6 ساعة في ظروف المخففة 11، 13، وتقارب نسبة عالية من البروتين ملزمة من بولي (N-isopropylacrylamide-CO-حمض الاكريليك) (بولي (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis من خلال دمج تساهميا الأصباغ التي تحتوي على الأمينية (أي.، والأصباغ sulfonatedanthraquinonetriazine) في الجسيمات النانوية من خلال تحقيق رد فعل amidation أجريت في المذيبات المائية أو العضوية تبعا ل/ خصائص ماء مسعور من 11 الأصباغ، يستخدم 13. استبدال أليف النواة للمجموعات الأمينات في جسيمات متناهية الصغر مع ذرة كلور لصبغ anthraquinonetriazine لخلق بولي تحتوي على صبغة (NIPAm -co-آليلامين) (AA) النانوية 11، 12. يتم استغلال عملية البلمرة من خطوتين لخلق الجسيمات النانوية هيدروجيل تحتوي على الغلاف الخارجي من حمض vinylsulfonic (VSA) 11، 13. النانوية هيدروجيل يمكن تطبيقها على السوائل البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الدم الكامل، والبلازما، المصل، السائل النخاعي، والعرق، والبول. في خطوة واحدة، في الحل، نanoparticles إجراء سريع (في غضون دقائق) عزل وتركيز منخفض الوزن الجزيئي التحاليل 10، 11، 13، 15-18. ومزال البروتينات في وقت لاحق من الجسيمات النانوية والكشف باستخدام ويسترن النشاف 19-21، مطياف 10، 11، 13، 15، 18، 22 كتلة (23 عاما) المناعية / ELISA 10، 11، 15، 18، أو مرحلة عكس البروتين ميكروأري 16، 24 المقايسات. النانوية بين functionalized مع الطعم الكيميائية، وتقديم الأساسية أو الأساسية قذيفة الهندسة المعمارية، والتقاط وتركز البروتينات على أساس الخصائص الفيزيائية الطعم / شل. لذا سوف الأصباغ المختلفة دمجها في التقاط الجسيمات النانوية مجموعات فرعية مختلفة من البروتينات مع اختلاف الكفاءة على أساس تقارب صبغ، ودرجة الحموضة من الحل، وحضور / غياب المنافسة بروتينات عالية وفيرة 13. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الجسيمات النانوية فيما يتعلق حجم الحل يؤثر على العائد البروتين من الجسيمات النانوية. هذه الجوانب منوأظهرت هيدروجيل حصاد جسيمات متناهية الصغر باستخدام ثلاثة جسيمات متناهية الصغر الطعوم المختلفة للبروتينات الحصاد من عينات البلازما التي تحتوي على كميات عالية من البروتين، وعينات من البول والتي عادة لا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين. في هذا البروتوكول نظهر الحصاد والتركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) من عينات البلازما باستخدام بولي (NIPAm-CO-AAC)، بولي (NIPAm / صبغ)، وقذيفة النانوية الحدقة (بولي (NIPAm-CO-VSA)) . وتظهر بولي (NIPAm / صبغ) الجسيمات النانوية للتركيز المستضد الأنواع المتفطرة التي تم إضافتها إلى عينات البول الإنسان، لتقليد السل المتفطرة الأفراد المصابين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="957">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">hydrogel nanoparticles</td>
			<td style="width:187px;">Ceres Nanoscience</td>
			<td style="width:119px;">CS003</td>
			<td style="width:336px;">NanoTrap ESP particles</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl, 50mM pH7.0</td>
			<td style="width:187px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">IC816116</td>
			<td>50mM, pH 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH1103-4LP</td>
			<td>available from VWR</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ammonium Hydroxide NH4OH</td>
			<td style="width:187px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">BDH3014</td>
			<td>available from VWR, assayed at 28-30% NH3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium thiocyanate 25mM</td>
			<td style="width:187px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">419675000</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-analyte Urine Reagent Strips</td>
			<td style="width:187px;">Siemens</td>
			<td style="width:119px;">2161</td>
			<td style="width:336px;">for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LC2676</td>
			<td style="width:336px;">use at room temperature to prevent SDS from precipitating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dry bath incubator (100 oC) with heating block</td>
			<td style="width:187px;">Barnstead</td>
			<td>11-715-125DQ</td>
			<td>do not substitute a boiling water bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator manifold</td>
			<td style="width:187px;">Organomation Associates</td>
			<td>Microvap118</td>
			<td>for serum/plasma samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, swing-out rotor</td>
			<td style="width:187px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">Legend series</td>
			<td>50ml tube capacity, rcf 3700 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Centrifuge, fixed angle rotor</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424</td>
			<td>1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">50ml conical centrifuge&#160;tubes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td>with screw caps for urine samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1.5ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Disposable plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td>at least 1ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Timer</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S04782</td>
			<td>seconds/minutes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydrogel nanoparticle harvesting of plasma or urine for detecting low abundance proteins

اكتشاف العلامات البيولوجية رواية يلعب دورا حاسما في توفير أكثر حساسية ومحددة كشف المرض. للأسف كثير من المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة التي توجد في السوائل البيولوجية لا يمكن الكشف عنها بسهولة مع مطياف الكتلة أو المناعية لأنها موجودة في تركيز منخفض جدا، هي عطوب، وغالبا ما يخفيها وفرة البروتينات عالية مثل الألبومين أو المناعي. الطعم تحتوي على بولي (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) النانوية استنادا قادرة على التغلب على هذه الحواجز الفسيولوجية. في خطوة واحدة أنها قادرة على التقاط، والتركيز والحفاظ على المؤشرات الحيوية من سوائل الجسم. منخفضة الوزن الجزيئي التحاليل تدخل جوهر جسيمات متناهية الصغر وأسرت من قبل مختلف الأصباغ الكيميائية العضوية، والتي تكون بمثابة الطعم تقارب عالية البروتين. النانوية قادرة على تركيز البروتينات من الاهتمام من قبل عدة أوامر من حجمها. هذا العامل هو تركيز كاف لزيادة مستوى البروتين مثل أن البروتينات هي ضمنحد الكشف من الطيف الحالية الكتلة، النشاف الغربي، والمناعية. يمكن تحضين النانوية مع مجموعة كبيرة من السوائل البيولوجية وأنها قادرة على تخصيب كثيرا من تركيز البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات مع استبعاد الزلال وغيرها من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. تظهر بياناتنا أن 10،000 التضخيم أضعاف في تركيز الحليلة معين لا يمكن أن يتحقق، مما الطيفي والمناعية للكشف عن المؤشرات الحيوية لا يمكن الكشف عنها سابقا.

هيدروجيل الجسيمات النانوية الحجم والتوحيد وقد تم إنتاج بولي (NIPAm-AAC) الجسيمات مع ارتفاع العائد للغاية والتكاثر بين وداخل دفعات. الجسيمات الغروية لها الاستقرار جيدة جدا في RT خلال الوقت اللازم لالتقاط وتخزين وشطف من البرو?...

Watch this Scientific Journal Video about Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins at JoVE.com

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Views.  George Mason University. Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Video: Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

تصميم وبناء الاصطناعي خارج الخلية مصفوفة (aECM) والبروتينات من<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; للبشرة هندسة الأنسجة

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

تصنيع مقرها قضيب من تخصيص لينة الروبوتية هوائي أجهزة القابض للتلاعب الأنسجة الحساسة

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

جهاز لقطع الأنسجة ميكروكولومنس

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to develop practical technologies that couple microscopic cell screening with cell isolation at high purity for downstream genetic analysis. Here, the use of photodegradable poly(ethylene glycol) hydrogels for screening and isolation of bacteria with unique growth phenotypes from heterogeneous cell populations is described. The method relies on encapsulating or entrapping cells with the hydrogel, followed by culture, microscopic screening, then use of a high-resolution light patterning tool for spatiotemporal control of hydrogel degradation and release of selected cells into a solution for retrieval. Applying different light patterns allows for control over the morphology of the extracted cell, and patterns such as rings or crosses can be used to retrieve cells with minimal direct UV light exposure to mitigate DNA damage to the isolates. Moreover, the light patterning tool delivers an adjustable light dose to achieve various degradation and cell release rates. It allows for degradation at high resolution, enabling cell retrieval with micron-scale spatial precision. Here, the use of this material to screen and retrieve bacteria from both bulk hydrogels and microfabricated lab-on-a-chip devices is demonstrated. The method is inexpensive, simple, and can be used for common and emerging applications in microbiology, including isolation of bacterial strains with rare growth profiles from mutant libraries and isolation of bacterial consortia with emergent phenotypes for genomic characterizations.

The use of photodegradable hydrogels to isolate bacterial cells by utilizing a high-resolution light pattering tool is reported. Essential experimental procedures, results, and advantages of the process are reviewed. The method enables rapid and inexpensive isolation of targeted bacteria showing rare or unique functions from heterogeneous communities or populations.

واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

تخليق هيدروجيل لاصق قوي ، جيلاتين O-نيتروسوبنزالديهيد

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...