פרוטוקול זה של תרבות התאים נועד למנוע מתאי אנדותל הקרנית לעבור מעבר אפיתל למצ'ימלי במהלך בידוד, התרחבות ותת-תרבות. תרבות תאים הוקמו ממפזרי רקמת הקרנית, אשר ניתן לעשות בהם שימוש חוזר כדי להבטיח אספקה מתמשכת של תאים ראשוניים מתורם אחד. התחל על ידי ציפוי בארות של צלחת תרבות רקמות שש באר עם גורם מצורף באמצעות הוראות היצרן.
לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של תרבות בינוני לכל מקודד היטב. מניחים את צד אנדותל הקרנית לתוך צלחת פטרי סטרילית על הבמה של מיקרוסקופ ניתוח. התאימו את התאורה כך שמשטח הקרנית מואר היטב עם ניגודיות מספקת כדי להדגיש את שכבת ה אנדותל, והתאימה את הזום כך שהקצה וקצת אנדותל קרנית מרכזי נמצאים בתצוגה.
השתמש במטלות השען הסטריליות כדי להרים בעדינות ולקרוע את הממברנה של דסמט הרחק מהסטרומה שמתחת. מניחים את רצועת הממברנה לתוך אחת בארות מוכנות של צלחת התרבות, הקפדה מיד להחליף את המכסה של הצלחת כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הסר תחילה את רצועות הקרום של דסמט מהפריפריה הקיצונית של ה אנדותל, ומתוך אזורי המרכז מאוחר יותר, והצב את כל הרצועות מקורנית אחת לתוך באר אחת.
בסיום, האינקובטים באינקובטור לתרבות תאים לחים נקבעים על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. להרכיב את התא העליון של תא בוידן מיקרו על ידי הצבת טבעת O אדום למרכזו. השתמש טרפין בקוטר 18 מילימטר כדי אגרוף החוצה דיסק מתוך גיליון ביו על קרש חיתוך PTFE.
לאחר מכן, מניחים את הדיסק מעל טבעת O האדומה בתא העליון של תא המיקרו בוידן. בורג התא התחתון לתא העליון, אבטחת הדיסק של החומר הביולוגי בין לבין. ולהשרות את תא המיקרו בוידן שהורכב באתנול של 70% למשך שעה כדי לעקר אותו.
לאחר השרייה, לחלוטין לטבול את התא HBSS סטרילי במשך 10 דקות כדי להסיר את האתנול. ואז לשטוף את התא במדיום תרבות במשך 10 דקות. ולהעביר למדיום תרבות בתוך באר של צלחת שש בארות, לוודא כי התא העליון מכוון כלפי מעלה.
התאימו את רמת המדיום כך שיגעו במשטח התחתון של הממברנה הביו-חומרית, אך לא יזרמו לתא העליון. פיפטה 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים על הממברנה לתוך תא המיקרו בוידן, ודגירה אותו באינקובטור תרבות הרקמה במשך ארבע שעות, לפני הוספת בינוני כדי להטביע לחלוטין את התא. רוב ההתפוצצויות שנגזרו מהקרניות של כבשה בת שנה עד שנתיים או תורמים אנושיים בני פחות מ-30 נקשרו לצלחות תרבות רקמה מקודדות של גורם מצורף בתוך שבוע.
לאחר שישה שבועות, תאים קטנים רבים, ארוזים היטב היו נוכחים ליד explant. תאים קטנים ועמוסים היטב בתוך תרבות תאי ה אנדותל הקרנית עמידים לעיכול עם פי שלושה, בעוד שתאים פיברובלסטיים גדולים יותר רגישים יותר אליו. הבדל זה נוצל כדי להסיר באופן סלקטיבי תאים גדולים מהתרבויות לפני העברת התאים הקטנים יותר לצלחות חדשות.
ניתוחי קמח חיסוני נערכו על תרבות תאי אנדותל הקרנית כדי לאתר ZO-1, חלבון צומת הדוק, ו- N-cadherin, חלבון צומת דבקות. אותם נוגדנים שימשו הן לכבשים והן לתאים אנושיים, ושני החלבונים התגלו בקרום הפלזמה של תאים משני המינים. תא המיקרו בוידן המותאם אישית איפשר לשני צידי הממברנה לשמש כמשטחים של תרבות תאים בו זמנית.
מבט חוצה חתך של מבנה תא מהונדס רקמה מראה שכבה אחת של תאי אנדותל הקרנית על משטח אחד, ותרבות רב שכבתית של תאים סטרומה הקרנית על השני. בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב להימנע מגרד את האנדותל עם המדפים שלך כאשר אתה מקלף את הקרום של Descemet מהקרנית. בעקבות הליך זה, את השלמות של שכבת תא אנדותל הקרנית על קרום ניתן לבדוק על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית שלה.
