The authors wish to thank T. Noguchi for helpful advice on the initial establishment of the culture technique in our laboratory. Research in the lab of R. R.-P. was funded by the DFG within the international collaborative research center TRR81.

הצהרת אתיקה: הפרוצדורות מתוארות בפרוטוקול זה באופן בלעדי כרוכות בעבודה עם melanogaster דרוזופילה ואינן כפופים לחוקים לרווחת בעלי החיים בגרמניה. .1 הכנת מדיה, כלים, וזבובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום שונה זמין מסחרי אבקת M3 צמיחה ללא אשלגן ביקרבונט 17. זהירות: מעצבן לעין ועור. מוסף הבינוני עם 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. השתמש בסרום שור עוברי נבדק חרקי תרבות מומתת חום וקבלת תוצאות הטובות ביותר. סינון הבינוני המלא (המכונה להלן כבינוני) באמצעות יחידת 0.2 מיקרומטר מסנן בקבוק העליון וחנות בaliquots ב -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, מסנן (פילטר קצה המזרק 0.2 מיקרומטר) הבינוני שוב כדי להסיר את משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות מעכב למבחנים תרופתיים. Dissolve הכימיקלים בממס המתאים והחנות בaliquots. לדוגמא, להכין פתרון מניות של 28.69 חומצת anacardic מ&quot;מ (זהירות: ממגר את העין ואת העור) בdimethylsulfoxide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את הכלים לשיבוש אשכים גלמים גזורים ונתיחה של ציסטות בודדות. השתמש בשתי מחטים חדות ונוקשה, ולא זוג המלקחיים. כוח הנימים המתפתח בין שתי זרועותיו של זוג המלקחיים הופך את הנתיחה של ציסטות בודדות בכמויות קטנות של מדיום קשה מאוד. לדוגמא, השתמש בקצה של סיכת חרקים נירוסטה מוכנסת לתוך מחזיק חיסון לולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבל את הגלמים כראוי בגיל, בערך זרע 10 בקבוקוני תרבות גדולים (צינורות עם 4 ס&quot;מ קוטר) עם מספר מספיק של זבובים בוגרים (בערך 40-60 זבובים). כדי לנתח את מתג HP, להשתמש זבובים להביע H2AvD-RFP וProtamineB-eGFP בדפוס אנדוגני 12,16,22. דגירה הבקבוקונים בתנאים סטנדרטיים ב25; מעלות צלזיוס למשך בערך 4-5 ימים עד זחילת זחלי instar השלישי ולהתחיל התגלמות על הקירות של הבקבוקונים 25. </li></ol> .2 סימון או איסוף לבן טרום גלמים להשיג גלמי 24-HR-ישנים לDissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את ההשפעה של כימיקלים מסוימים במתג HP, לנתח אשכים גלמים בקירוב 24 APF 12 שעות. כדי להשיג גלמים מבוימים, לקחת את בקבוקוני תרבות זבוב מוכנים עם pupating זחלים (ראה סעיף 1.4) ולזהות מראש גלמים לבנים רבים ככל האפשר. טרום גלמים במהלך השלב הראשון בהתגלמות מופיעים כחסר תנועה, שאינה האכלה, זחלים ולא קיצרו עם spiracles מופנה החוצה וגולם בצבע לבן. הגולם הופך שזוף בצבע חום בתוך 30 עד 60 דקות, דבר שמצביע על השלב הבא של פיתוח גלמי 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמן את עמדותיהם של טרום הגלמים עם סמן קבוע בצד החיצוני של הבקבוקונים. דגירה הבקבוקונים ב25 מעלות צלזיוס למשך בערך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין,לבחור מראש גלמים מהצד של צלוחיות עם מברשת קטנה טבולה בPBS חיץ. לאחר מכן להעביר את מראש הגלמים לצד השני של צינור תגובה 50 מ&quot;ל טרי ולדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך בערך 24 שעות. </li></ol></li></ol> .3 Dissection של גלמי אשכים בקירוב 24 שעות לאחר היווצרות הגולם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ כמה טיפות (בערך 80 μl כל אחת) של מדיום בתרבית תאי פלסטיק 10 סנטימטר או צלחת פטרי. בעזרת זוג רחב של מלקחיים או מכחול טבול במדיום, לבחור את הגלמים בשלב APF 24 שעות מהבקבוקונים מודגרות (ראה סעיף 2). העבר את הגולם אחד לכל טיפה של מדיום בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה, להשתמש סטריאו מיקרוסקופ מצויד בפנס סיבים אופטיים. אין לחמם את האשכים מעל RT במהלך הנתיחה שכן הדבר עלול למנוע התפתחות תקינה בתרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח גלמים עם שני זוגות של מס &#39;5 מלקחיים. עם זוג אחד, לתפוס את הגולם לכל היותר האחורי שלהחלק (spiracles האחורי) ולהחזיק אותו בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את spiracles הקדמי עם זוג מלקחיים האחר ולפתוח את operculum גלמים בקצה הקדמי שלה. לקלף את המקרה גלמי לפחות עד חלק של בית החזה חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להחזיק את הגולם בעמדה של הקצה האחורי ביותר שלה. כדי לשחרר את הלחץ הפנימי של הגולם, להכניס את שני הידיים של זוג המלקחיים לאזור הראש של הגולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרוע את הגולם הפתוח על ידי פתיחת המלקחיים ומרגשים המלקחיים בכיוון הקדמי. ודא כי הפתיחה שנוצרה עם תנועה זו היא גדולה ככל האפשר, בניסיון הראשון. למנוע נזק לגולם בקצה האחורי שלה לפני הלחץ כבר פורסם שכן הדבר עלול לגרום לאשכים נדחפו דרך הפתח הקטן באופן ישיר ולעתים קרובות ביותר ששבשו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שברגע שהגולם נפתח, הלחץ הפנימי שוחרר מהגולם לוחץ את agglomerates של תאי שומן בגוף ורקמות באמצעות laפתיחת rge באזור הראש. בדקו אם האשכים גלמים כבר דחפו מתוך הגולם עם החומר הזה; זה קורה בחלק מהמקרים. האשכים אינם מחוברים לכל רקמה אחרת ב24 APF שעות ולכן עלול להיות מגורש בקלות מהגולם 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע לוחץ גולם עם המלקחיים שכן הדבר עלול לגרום נזק לאשכים אם הם יישארו בגולם. להגדיל את גודל הפתיחה באמצעות זוג אחד של מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן החזק את הגולם בקצה האחורי ביותר שלה. סגור את הזוג האחר של מלקחיים ובעדינות פס החוצה את התוכן של הגולם מאחורי לקדמי כדי לשחרר את האשכים מהגולם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את האשכים על ידי משייכתם לקצה פיפטה 200 μl מראש לחתוך. נסה להעביר רק כמות קטנה מאוד של מדיום כדי להפחית את מספר תאי שומן בגוף הועברו עם האשכים. מניחים את האשכים לתוך מדיום בצלחת תרבות טרי. שטוף את האשכים כמה פעמים עם מדיום עד שרק תא בגוף כמה שומןים יישאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה חיה, להעביר אשכים למנת תרבות זכוכית תחתונה עם מדיום ולהשתמש מיקרוסקופ הדמיה הפוך. עבור מבחני תרופתיים, להמשיך בשלב 5. </li></ol> .4 Dissection של ציסטות נבט אונליין זכר והדמית חיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אשך גלמים אחד או יותר למנת תרבות זכוכית התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטריאו מיקרוסקופ עם תאורת סיבים אופטית ושתי מחטי נירוסטה (ראה סעיף 1.3) לנתיחה של ציסטות נבט אונליין גבריים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מחט אחת, לנסות בזהירות כדי להצמיד אשך אחד בקדמי שלה או קצה אחורי. להחזיק אותו בעמדה. הכנס את המחט אחרת לאשך ולשבש את נדן האשך על ידי הזזת המחט לצדדים. רבים מציסטות ישוחררו מהאשך על ידי תנועה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להחזיק את האשך בעמדה עם מחט אחת. בעדינות פס החוצה ציסטות שנותרו מהאשך עם המחט אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציסטות נפרדות מצטברות או על ידי ג &#39;נטלמןly נע מחט לצדדים באמצעות המקבץ של ציסטות או על ידי העברת ציסטות לצלחת תרבות טרי עם מדיום באמצעות קצה פיפטה 200 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את צלחת התרבות למיקרוסקופ הדמיה הפוכה להדמית חיה של ציסטות בודדות. לפזר ציסטות שוב עם מחט במידת צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את השלב של ציסטות באמצעות שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בציסטה של ​​השלב הרצוי. לאשר מיקוד ומיקום של ציסטה לעתים קרובות במהלך ניסויי הדמיה יותר, כמו ציסטות לא לדבוק בתחתית צלחת התרבות ולכן נוטה לצוף מחוץ לפוקוס. הערה: ציפוי הצלחת עם פולי-L-ליזין לקיבוע פוגע בהתפתחות של ציסטות נבט אונליין מוקדם. במקום זאת, ניתן לבודד ציסטות בודדות. עם קצת תרגול, זה אפשרי לבודד ציסטה מסוימת על ידי בעדינות דוחף אותו עם המחט. זה יאפשר ההעברה של ציסטות בודדות לכת נפרדתמנות יור עם פיפטה פסטר זכוכית עם קצה מתמשך שנכנס לתוך שדה הראייה של המיקרוסקופ. ציסטות בודדות לאחר מכן ניתן עברו בקלות במנות התרבות גם לאחר דגירה ארוכת הטווח. </li></ol></li></ol> .5 תרופתי Assay עם אשכי גלמים תמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל גם צלחת תרבית תאי 24 גם עם 500 μl של מדיום לניסוי אחד 12 משכפל. העברת אשך גלמים לכל אחד גם, באמצעות קצה פיפטה 200 μl מראש לחתוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדוק את קיומו של protamines באשכים המבודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. האשכים צריכים להיות חופשיים של אות ProtamineB-eGFP, אשר מציינת כי המתג של HP אינו חל בכל אחד מציסטות. החלף אשכים שכבר מראים ציסטות ProtamineB-eGFP חיוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל12 הבארות הראשונות, להוסיף 500 μl של מדיום המכיל תרכובת מעכב מדוללת (חומצת anacardic) כדי להגיע לריכוז הסופי הרצוי(150 מיקרומטר) ב 1 מ&quot;ל של מדיום בכל טוב. השתמש בבארות הנותרות כפקדים שלא טופלו; להוסיף 500 μl של מדיום עם אותה הכמות של ממס המשמשת כעם התרכובות מעכבת. הערה: אם תרכובות שונות וממסים המשמשים, זה יכול להיות יותר יעיל לשימוש לבד בינוני כשליטה ועל מנת לבחון את ההשפעה של הגדלת ריכוזי ממס בניסויים נפרדים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 25 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שוב את קיומו של protamines באשכים מודגרות כפי שתואר לעיל. האשכים השליטה צריכים עכשיו להראות ציסטות אחד או יותר ProtamineB-eGFP חיוביות, המצביעה על מעבר דרך מתג HP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה עם טיפ 200 μl, להעביר את האשכים לשקופיות פולי-L-ליזין מצופה, להיערך סקווש וכתם עם נוגדני ניאון מתאימים כפי שתואר במקום אחר 12,27,28. </li></ol>

<ol>
	<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila+spermatogenesis.">Genetic control of cell proliferation and differentiation in Drosophila spermatogenesis.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9 (4), 433-444 (1998).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138 (14), 2861-2869 (2011).</li><li>Tokuyasu, K. T., Peacock, D. W. J., Hardy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+spermiogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Dynamics of spermiogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 124 (4), 479-506 (1972).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130 (9), 1805-1816 (2003).</li><li>Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can&#8217;t+live+without+them,+can+live+with+them:+roles+of+caspases+during+vital+cellular+processes.">Can&#8217;t live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes.</a> Apoptosis. 14 (8), 980-995 (2009).</li><li>Govin, J., Caron, C., Lestrat, C., Rousseaux, S., Khochbin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histones+in+chromatin+remodelling+during+mammalian+spermiogenesis.">The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis.</a> Eur. J. Biochem. 271 (17), 3459-3469 (2004).</li><li>Hecht, N., Behr, R., Hild, A., Bergmann, M., Weidner, W., Steger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+marmoset+(Callithrix+jacchus)+as+a+model+for+histone+and+protamine+expression+during+human+spermatogenesis.">The common marmoset (Callithrix jacchus) as a model for histone and protamine expression during human spermatogenesis.</a> Hum. Reprod. 24 (3), 536-545 (2009).</li><li>Kanippayoor, R. L., Alpern, J. H. M., Moehring, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protamines+and+spermatogenesis+in+Drosophila+and+Homo+sapiens.">Protamines and spermatogenesis in Drosophila and Homo sapiens.</a> Spermatogenesis. 3 (2), (2013).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+dynamics+during+spermiogenesis.">Chromatin dynamics during spermiogenesis.</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2013).</li><li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells.">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li><li>Rathke, C., Baarends, W. M., Jayaramaiah-Raja, S., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+from+a+nucleosome-based+to+a+protamine-based+chromatin+configuration+during+spermiogenesis+in+Drosophila.">Transition from a nucleosome-based to a protamine-based chromatin configuration during spermiogenesis in Drosophila.</a> J. Cell Sci. 120 (9), 1689-1700 (2007).</li><li>Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+acetylation+is+essential+to+proceed+from+a+histone-+to+a+protamine-based+chromatin+structure+in+spermatid+nuclei+of+Drosophila+melanogaster.">Histone H4 acetylation is essential to proceed from a histone- to a protamine-based chromatin structure in spermatid nuclei of Drosophila melanogaster.</a> Syst. Biol. Reprod. Med. 56 (1), 44-61 (2010).</li><li>Olivieri, G., Olivieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+study+of+nucleic+acid+synthesis+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">Autoradiographic study of nucleic acid synthesis during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Mutat. Res. Fund. Mol. Mech. Mut. 2 (4), 366-380 (1965).</li><li>Gould-Somero, M., Holland, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+RNA+synthesis+for+spermiogenesis+in+organ+cultures+ofDrosophila+melanogaster+testes.">The timing of RNA synthesis for spermiogenesis in organ cultures ofDrosophila melanogaster testes.</a> Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 174 (2), 133-148 (1974).</li><li>Barreau, C., Benson, E., Gudmannsdottir, E., Newton, F., White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-meiotic+transcription+in+Drosophila+testes.">Post-meiotic transcription in Drosophila testes.</a> Development. 135 (11), 1897-1902 (2008).</li><li>Barckmann, B., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+levels+of+regulation+lead+to+protamine+and+Mst77F+expression+in+Drosophila.">Three levels of regulation lead to protamine and Mst77F expression in Drosophila.</a> Dev. Biol. 377 (1), 33-45 (2013).</li><li>Cross, D. P., Shellenbarger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis+in+in+vitro+cultures.">The dynamics of Drosophila melanogaster spermatogenesis in in vitro cultures.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 53 (1), 345-351 (1979).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C., Henderson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Imaging+of+Male+Meiosis+by+Phase-Contrast+and+Fluorescence+Microscopy.">Time-Lapse Imaging of Male Meiosis by Phase-Contrast and Fluorescence Microscopy.</a> Drosophila Cytogenetics Protocols. , 77-87 (2004).</li><li>Kawamoto, T., Kawai, K., Kodama, T., Yokokura, T., Niki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+Drosophila+spermatogonia+in+vitro.">Autonomous differentiation of Drosophila spermatogonia in vitro.</a> Dev. Growth Differ. 50 (7), 623-632 (2008).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138 (16), 3367-3376 (2011).</li><li>Leser, K., Awe, S., Barckmann, B., Renkawitz-Pohl, R., Rathke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain-containing+protein+tBRD-1+is+specifically+expressed+in+spermatocytes+and+is+essential+for+male+fertility.">The bromodomain-containing protein tBRD-1 is specifically expressed in spermatocytes and is essential for male fertility.</a> Biol. Open. 1 (6), 597-606 (2012).</li><li>Jayaramaiah Raja, S., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+by+Drosophila+melanogaster+Protamines+and+Mst77F+of+Histones+during+Chromatin+Condensation+in+Late+Spermatids+and+Role+of+Sesame+in+the+Removal+of+These+Proteins+from+the+Male+Pronucleus.">Replacement by Drosophila melanogaster Protamines and Mst77F of Histones during Chromatin Condensation in Late Spermatids and Role of Sesame in the Removal of These Proteins from the Male Pronucleus.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (14), 6165-6177 (2005).</li><li>Bodenstein, D., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postembryonic+development+of+Drosophila.">The postembryonic development of Drosophila.</a> Biology of Drosophila. , 275-367 (1950).</li><li>Susic-Jung, L., Hornbruch-Freitag, C., Kuckwa, J., Rexer, K. H., Lammel, U., Renkawitz-Pohl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multinucleated+smooth+muscles+and+mononucleated+as+well+as+multinucleated+striated+muscles+develop+during+establishment+of+the+male+reproductive+organs+of+Drosophila+melanogaster.">Multinucleated smooth muscles and mononucleated as well as multinucleated striated muscles develop during establishment of the male reproductive organs of Drosophila melanogaster.</a> Dev. Biol. 370 (1), 86-97 (2012).</li><li>Ashburner, M., Roote, J., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+Culture+of+Drosophila.">Laboratory Culture of Drosophila.</a> Drosophila Protocols. , 585-599 (2000).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66 (1), 57-80 (1981).</li><li>Hime, G. R., Brill, J. A., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+ring+canals+in+the+male+germ+line+from+structural+components+of+the+contractile+ring.">Assembly of ring canals in the male germ line from structural components of the contractile ring.</a> J. Cell Sci. 109, 2779-2788 (1996).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., W, S. u. l. l. i. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+spermatocyte+growth+and+male+meiosis+in+Drosophila+melanogaster.">Cytological analysis of spermatocyte growth and male meiosis in Drosophila melanogaster.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+testes+in+Drosophila.+I.+The+relation+between+vas+deferens+and+testis+within+various+species.">The growth of testes in Drosophila. I. The relation between vas deferens and testis within various species.</a> J. Exp. Zool. 87 (1), 113-158 (1941).</li><li>Lim, J. G. Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+lineage+is+required+for+differentiation+and+not+maintenance+of+germline+stem+cells+in+Drosophila+testes.">Somatic cell lineage is required for differentiation and not maintenance of germline stem cells in Drosophila testes.</a> PNAS. 109 (45), 18477-18481 (2012).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Braun, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+paternal+chromosomes+with+protamine.">Packaging paternal chromosomes with protamine.</a> Nature Genet. 28 (1), 10-12 (2001).</li><li>G&#246;risch, S. M., Wachsmuth, M., T&#243;th, K. F., Lichter, P., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+increases+chromatin+accessibility.">Histone acetylation increases chromatin accessibility.</a> J. Cell Sci. 118 (24), 5825-5834 (2005).</li><li>Demerec, M., Kaufmann, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Guide: Introduction to the Genetics and Cytology of Drosophila melanogaster. , (1996).</li><li>Wang, W., Yoder, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Pupal+Abdomen+Immunohistochemistry.">Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li><li>Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Quantitative+Nutritional+Requirements+of+Drosophila+Melanogaster.">The Quantitative Nutritional Requirements of Drosophila Melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 33 (1), 45-72 (1956).</li><li>Meynadier, G., Vago, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Aseptic rearing of invertebrates for tissue culture. In: Invertebrate tissue culture. 1, (1971).</li><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+acetyltransferase+activity+by+anacardic+acid+sensitizes+tumor+cells+to+ionizing+radiation.">Inhibition of histone acetyltransferase activity by anacardic acid sensitizes tumor cells to ionizing radiation.</a> FEBS Lett. 580 (18), 4353-4356 (2006).</li><li>Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+imaginal+disc+development.">Live imaging of Drosophila imaginal disc development.</a> PNAS. 107 (32), 14217-14222 (2010).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> PNAS. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Church, K., Lin, H. P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetochore+microtubules+and+chromosome+movement+during+prometaphase+in+Drosophila+melanogaster+spermatocytes+studied+in+life+and+with+the+electron+microscope.">Kinetochore microtubules and chromosome movement during prometaphase in Drosophila melanogaster spermatocytes studied in life and with the electron microscope.</a> Chromosoma. 92 (4), 273-282 (1985).</li><li>Rebollo, E., Gonz&#225;lez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO rep. 1 (1), 65-70 (2000).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Live+Imaging+of+Stem+Cells+in+Drosophila+Testis.">Time-lapse Live Imaging of Stem Cells in Drosophila Testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 11, 2E.2.1-2E.2.8 (2009).</li></ol>

אי לנו אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול המובא מתאר שני יישומים שונים המבוססים הן על היכולת לנתח אשכים דרוזופילה וציסטות ניבט שורה אחת בשלב התפתחותי נתון ועל פיתוח vivo לשעבר של תאים ורקמות אלה בצלחת תרבות. יישום אחד הוא המניפולציה התרופתית של תהליכים חיוניים בהתפתחות זרע. חשוב לציין, זה מאפשר גישה ליצירת תאי זרע לאחר meiotic שאינו בקלות צבר באמצעות ניתוחים תפקודיים המבוססים על גנטיקה זבוב. היישום האחר הוא ההתבוננות המיקרוסקופית של חיים ופיתוח תאי נבט ואשכים. במיוחד יתרונות יישום זה מיכולתם של תאי דרוזופילה ואיברים בתרבות לשרוד ולהתפתח בRT ותחת אווירה רגילה. לפיכך, מיקרוסקופ הדמיה הפוך מצוידים בבמה מחוממת (חימום לטמפרטורת גידול סטנדרטי של 25 ° C) הוא מספיק כדי להשיג תוצאות משמעותיות בניסויים חי הדמיה. נוסףיותר, זני זבוב מהונדסים רבים לבטא חלבונים מתויג חלבון פלואורסצנטי עבור הדמיה חיה קיימות או ניתן להקים בקלות. כדי להשיג אשכים או ציסטות נבט אונליין גלמים של שלב התפתחותי מסוים, זה קריטי, כי אחד הוא מכיר את עיתוי פיתוח דרוזופילה. העיתוי המדויק לכל שלב עשוי להשתנות בין מעבדות, תנאי תרבות, ולעוף זנים ויש לקבוע באופן אמפירי. כפי שתואר לעיל, זה חשוב במיוחד עבור מבחני תרופתיים ש, למשל, לכוון את מתג HP. בניסויים כאלה, כדאי תמיד לבדוק לspermatids עם אות ProtamineB-eGFP לפני בדיקת המעכב בפועל משום שהעיתוי יכול להשתנות מעט אפילו בתוך אוכלוסייה אחת. בעקבות הפרוטוקול הנ&quot;ל צריך לאפשר הנסיין לנתח אשכים משלבי גלמים כבר באיברים שלמים חופשיים של רקמת שומן בגוף מצורף. אשכים אלה ועוד יותר מכך, מבודדים geציסטות rm-line הן מאוד שבירות. לפיכך, חשוב לפתח את המיומנות הידנית וניסיון דרוש לטיפול והעברת אשכים וציסטות באמצעות מלקחיים, מחטים, וטפטפות. במיוחד מחקרי מיקוד פיתוח של תא ניבט שלאחר meiotic meiotic ותחילת ירוויחו מזה. אמנם קל יחסית לנתח ציסטות של spermatids מאוחר עם שוטונים ארוכים מאשכים מבוגרים, שקשה להשיג שלבים מוקדמים יותר. לנתח ציסטות אלה מאשכי גלמים מוקדמים בעקבות פרוטוקול זה הוא הרבה יותר יעיל. זכור כי בזן זבוב רגיל, רק בערך 50% מהגלמים יהיו זכר. לכן, להכין לנתח לפחות כפליים גלמים כמספר האשכים הנדרשים. לחלופין, ניתן לזהות זחלי L3 גבריים באמצעות סטריאו מיקרוסקופ, כפי שניתן זיהו את האשכים איברים עגולים שקופים כמוטבעים ברקמות שומן בגוף לרוחב של הזחל שלם 23,34, ולאסוף אותם בצלוחיות תרבות טריות ש יכוללשמש כדי לבחור מראש גלמים לבימוי וניתוחים. כמו כן ניתן לזהות זכר מראש גלמים 35. שם לב ששני ציסטות נבט אונליין מבודדים ואשכי גלמים שלמים בתרבות רגישות לאור, כפי שכבר דווח בעבר גם 18. רגישות לאור זה עשויה גם להחזיק לכמה תרכובות כימיות המשמשות במבחנים תרופתיים. לכן, דרך טובה ביותר הוא לשמור על מנות התרבות של assay בחושך במהלך דגירה. כמו כן, בעת תכנון ניסויי הדמיה הזמן לשגות עם אשכים פיתוח ו, במיוחד, ציסטות בודדות, יש לזכור כי זמני חשיפה ארוכים מדי ו / או שיעורי דגימה גבוהים מדי עלולים לעכב התפתחות ex vivo. קצב הדגימה המתאים צריך להיקבע באופן ניסיוני. זיהום חיידקים ו / או פטרייתי ועל הצמיחה במנות התרבות מהווה בעיה חמורה. מנות תרבות נגועות בחיידקים רבים מדי אינן תומכות vivo לשעבר development של האשכים וציסטות. לכן, מדיום התרבות המתוארת מכיל פניצילין וסטרפטומיצין (ראה שלב 1.1), אבל במהלך דגירה ארוכת טווח, האנטיביוטיקה הללו עשויים להיפגע ופעילותם משום הפחתה. זה יכול להיות אחת הסיבות לזמן המוגבל של הישרדות (מקסימום. 72 hr) של ציסטות בתרבית שנצפו בעת השימוש בפרוטוקול לעיל. עם זאת, מסגרת זמן זה לא יכול להיות מורחב על ידי החלפה קבועה של מדיום התרבות במנות. אנו מסיקים כי גורמים אחרים עשויים להשפיע על ההישרדות בתרבות, כגון חוסר אותות צמיחה מרקמות אחרות של מערכת המין. מצד השני, התפתחות שלאחר meiotic היא מהירה יותר בדרוזופילה מאשר ביונקים. בדרוזופילה, spermiogenesis לוקח כ 90 שעה, ומתג HP מתרחש בין 50 ו60 שעות לאחר מיוזה 9,12. לפיכך, זמן ההישרדות הרגיל של כ 48 שעות הושגו עם פרוטוקול זה הוא גם מתאים למעקב תהליכים התפתחותיים מרכזיים בSPErmatogenesis, כגון חטיבות meiotic או מתג HP. למרות שניתן להימנע מזיהום חיידקים או פטרייתי על ידי שימוש בכלים ובתקשורת נקיים, הפרוטוקול המובא אינו עושה שימוש בתנאי עבודה סטריליים לחלוטין בגלל זבובים ולעוף אשכים כבר להכיל חיידקים כאשר העלו בתנאים סטנדרטיים. עם זאת, חלק מהיישומים של טכניקת תרבות זו עשויות להפיק תועלת מהזבובים גזורים או אפילו העלו בתנאים בקטריאלית (לפרוטוקולים, לראות 17,36,37). מבחני תרופתיים תלויים בשימוש בתרכובות כימיות הפועלות כמעכבים או מפעילים של אנזימים שונים. התרכובות נפוצות בניסויים כאלה לעתים קרובות שונים באופן נרחב ביעד הספציפי שלהם. כיתרון, זה מציע את הפוטנציאל למקד כיתות אנזים שלמות, למשל, עם p300 חומצת anacardic עיכוב / CBP, PCAF, וחברים של כובעים 38 משפחת MYST. החסרון של זה יכול להיות פוטנציאל מחוץ יעד או השפעות רעילות inducאד על ידי תרכובות כגון. לכן, בכל מתחם ששימש בassay עם אשכים או ציסטות גלמים צריך להיבדק לרעיל שלה והשפעה ספציפית בריכוזים שונים. יתר על כן, שינויים קלים בתנאי התרבות, ריכוז תרכובת או פעילות, ושינויים בחדירות התא עלולים להוביל לשונות של תופעות הנגרמים. לכן, יש צורך לפקח על ההצלחה של הטיפול בכל ניסוי. לדוגמא, כאשר אנו משמשים חומצת anacardic ב150 מיקרומטר, צפינו שונות קלות בכוחו של פנוטיפ עיבוי הכרומטין בין ולפעמים בתוך כמה אשכים, ואילו acetylation של H4 היסטון ירד באופן עקבי. מבחני תרופתיים עם האשכים דרוזופילה בתרבות היו בשימוש כדי לנתח מנגנונים של לפני ואחרי meiotic יצירת תאי הזרע 4,12,14,21. מאחר וקשה לגישה יצירת תאי זרע לאחר meiotic עם כלים גנטיים למקד שחקנים עם Essentiaפונקציות l מראש meiotic וmeiotic, גישה זו vivo לשעבר מהווה תחליף. יתר על כן, באופן עקרוני, השיטה יכולה להיות מותאמת לדופק מרדף ניסויים כדי לעקוב אחר ההתפתחות של תאי נבט שטופלו לאורך זמן. עם זאת, אנחנו עדיין לא נבדקו אפשרות זו. תוך שימוש באשכי גלמים מוקדמים הוא יתרון במבחנים תרופתיים. ראשית, המעטפת החיצונית הדק של האשכים גלמים הצעירים (בסביבות 24 שעות APF) עלולה לאפשר חדירות משופרות של תרכובות כימיות. שנית, כאשר לומדים את מתג HP שלאחר meiotic, האשכים גלמים גזורים ב24 APF שעה מקו זבוב protamine-להביע GFP מאפשרים קריאה ישירה של אם מתג HP הושפע או לא. נכון להיום, כמה פרוטוקולים לגידול vivo לשעבר של איברי דרוזופילה ורקמות כולל אשכים וציסטות נבט אונליין פותחו (למשל, לראות 4,14,17,20,39,40). מדיום הגידול ותנאים הכלליים המשמשיםבפרוטוקול המובא כאן הוקמו בשנת 1979 17. מערכת התרבות מאוחר יותר מותאמת להדמית in vivo של מנגנון אינדיבידואליזציה בציסטות לאחר meiotic מאוחר מבודדות מאשכים בוגרים 4. בעבר, יש לנו דיווח כי תנאים אלה תומכים גם בהישרדות ובידול של meiotic ותאי נבט שלאחר meiotic בשלב מוקדם בציסטות שלהם במשך כ 48 12 שעות. בניגוד למערכות תרבות אחרות 19 העיתוי ההתפתחותי שנצפה בתרבויות אלה היה כ בקנה אחד עם העיתוי שנקבע מדגימות קבועות (לפרטים, ראה 12). אותות הקרינה H2AvD-RFP וprotamine-GFP יכולים לשמש כדי לחזות את הרכב המורפולוגיה והכרומטין הגרעיני של תאי הנבט בתרבות. מצאנו כי לזיהוי ברור של שלבי התפתחות בתרבות, זה יש יתרון על פני קריטריונים אחרים, כגון התפתלות של ציסטות. חשוב לציין, בפרוטוקול שהוצג אינו כרוך בתוספת של שלוחה זבובגורמי גדילת ract או אחרים מלבד סרום שור העובר. יתר על כן, אנו מציגים כאן, כי התנאים בקנה אחד עם ההדמיה מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חטיבות meiotic vivo לשעבר בתרבות. ניתן להשיג תמונות ברזולוציה סבירה במדיום קל לשימוש שתומך בפיתוח לטווח ארוך. זאת בניגוד לפרוטוקולים המאפשרים לטווח קצר (בערך 3 שעות) תצפיות בשמן Voltalef 41,42. הנהלים שתוארו לעיל לטיפוח וטיפול תרופתי של אשכים גלמים וציסטות נבט אונליין זכר יחידים הם להתאמה בקלות לרבה גנטית, אפיגנטיים, תא ביולוגי, או שאלות התפתחותיות שניתן לחקור ביצירת תאי זרע דרוזופילה. זה כולל במיוחד מחקר מתמקד בתאי גזע נבט אונליין. הוכח כי פיתוח תאי גזע יכול להיות מלווה הדמיה חיה של מבוגר מתורבת אשכי 20,43. עם זאת, תנועת הנפיחה של האשך הבוגר sheath מפריע לרכישת תמונה. לכן, גם הדמיה נעשה שימוש באשכים מקוטעים 43 או מספר ניסויי הדמיה שבוצעו יש להגדיל לדין וחשבון על מערכי נתונים איבדו 20. אשכים מוקדם גלמים (APF 24hr) עדיין לא סגורים עם תאי שריר. אפילו מעט אשכים מבוגרים (APF 36-45 hr) מופיעים כדי להראות כמה תנועות peristaltic (השוו איור 3 ווידאו נוסף 1). לכן, טיפוח אשכים גלמים צעירים כאיברים שלמים יכול לשמש כחלופה. יתר על כן, שולט פעם אחת, את היכולת לנתח אשכים גלמים וציסטות נבט אונליין מבודד סופו של דבר תאפשר ליישומים נוספים באמצעות ציסטות בודדות כמקור הומוגנית, אם כי אוכלוסייה קטנה, תא. לדוגמא, זה ובכך ניתן לבצע RT-qPCR לנתח את הרגולציה תעתיק של גנים ספציפיים בשלבים מוגדרים של יצירת תאי זרע, כפי שכבר הוכיחו <sup&gt; 15.

הפיתוח של תאי נבט זכר של מינים רבים הוא תהליך רציף. הוא מאופיין על ידי סדרה של אירועים מכריעים שמגיעה לשיאו ביצירת תאי הזרע מורפולוגית וepigenetically מאוד מיוחדים. בmelanogaster דרוזופילה, תאי גזע נבט אונליין בקצה של מתרס האשכים סימטרי להצמיח תאים חדשים גזע וspermatogonium, כלומר, תא הבת שמחויב להתמיינות (ראה איור 1 לסקירה) 1,2 . Spermatogonium עובר ארבעה סבבים של חטיבות המיטוטי ו, עם תחילתה של מיוזה, שלב של צמיחה מרשימה ופעילות תעתיק נקרא שלב spermatocyte. התאים שמקורם spermatogonium אחד להישאר מחוברים זה לזה ולהתפתח כחבילה העטופה מסונכרנת על ידי שני תאים סומטיים מבנה המכונים ציסטה. לאחר השלמת מיוזה, המורפולוגיה של תאי נבט הגבריים לחלוטיןארגון מחדש (מוצג באופן סכמטי באיור 1). בתחילה, spermatids העגול להאריך כדי ליצור את מבנה הראש הידרודינמית, ושוטון מתפתח. סופו של דבר, תאי הזרע מופרדים זה מזה על ידי מנגנון הנקרא אינדיבידואליזציה 3 מורכב, הקשורים לאפופטוזיס - 5. במינים רבים, כולל melanogaster דרוזופילה ומיני יונקים, השינויים מורפולוגיים של תאי הנבט מלווים בהתארגנות אפיגנטיים מדהימה של הכרומטין נבט אונליין הזכר הפלואידים, נקראים מתג היסטון לprotamine (מתג HP) 6 - 9. אולי כמעט כל היסטון הקנונים ומולקולות היסטון-variant רבים יוסרו DNA ומוחלפים על ידי חלבונים קטנים בסיסיים, protamines, וכתוצאה מכך מבנה nucleoprotamine הקומפקטי מאוד ספציפי להכרומטין זרע בוגר. מאפיינים כלליים של מתג HP הם tהוא ההחלפה של ההיסטונים הקנונית הראשונה לפי חלופות היסטון, לאחר מכן על ידי חלבוני מעבר, ולבסוף על ידי protamines. כל זה מלווה בכמה שינויים לסימנים אפיגנטיים, כגון עלייה ברמות acetylation של H4 היסטון רק לפני הסרת היסטון 7,10 - 12. רוב, אם לא כולם, של התהליכים הנ&quot;ל הם חיוניים לפיתוח זרע בוגר, פורה באופן מלא. זה נכון לא רק בדרוזופילה, אלא גם בבני אדם, כמו מניות יצירת תאי זרע של יונקים כמות ניכרת של דמיון עם 1,8,9 מערכת חסרת חוליות. לומד פיתוח ניבט תא זכרי הוא הקל מאוד במערכת מודל דרוזופילה. זבובים הם גנטיים נגישים ביותר. הדור של מוטציות, כמו גם את הקמתה של זנים לטוס לבטא גני היתוך או בונה התערבות RNA לוקחת מעט מאמץ. עם זאת, במחקר של יצירת תאי זרע לאחר meiotic, השימוש במוטציותכלים גנטיים פשוטים ד יכולים להגיע גבול. ביצירת תאי זרע דרוזופילה, שעתוק מפסיק כמעט לחלוטין עם כניסתו לחטיבות meiotic. לפיכך, יצירת תאי זרע לאחר meiotic מתבסס בעיקר על mRNAs translationally המודחק ומאוחסן מסונתזים בprophase meiotic מורחב 13 - 16. לכן, כלים כמו התערבות RNA או השימוש במוטציות שאינן מותנות אינם מתאימים ללימוד באופן ספציפי את תפקידי פוסט meiotic של מוצרי גן שגם למלא את הפונקציות חיוניות בהתפתחות תאי נבט מראש meiotic או meiotic. אחד יתרונות של דרוזופילה שניתן לנצל במקרים כאלה הוא היכולת של אשכים שלמים גזורים ואפילו ציסטות של תאי נבט לפתח vivo לשעבר במדיום תרבות 4,12,17 - 20. הנתיחה וטיפוח אשכים או ציסטות נבט אונליין מאפשר תצפית מיקרוסקופית לא רק של פיתוח נבט תאים בתאים חי, אךסימפוני השימוש במבחנים תרופתיים עם, למשל, מעכבים של אנזים מתחמים כגון acetyltransferases היסטון (כובעים), deacetylases היסטון (HDACs), topoisomerases, או פרוטאזום. לפיכך, ניתן לתפעל פונקציות האנזימטית במהלך יצירת תאי זרע לאחר meiotic ולעקוב אחר תוצאות התפתחותיות ללא קשר לפונקציות עובריים, טרום meiotic, או meiotic 4,12. במבחנים תרופתיים, נתחנו בעבר את לוקליזציה acetylation תלוי של חלבון bromodomain במהלך prophase meiotic כמו גם את הרלוונטיות של רמות acetylation היסטון עבור מתג HP אפיגנטיים ביצירת תאי זרע לאחר meiotic באמצעות מעכבים ספציפיים מיקוד כובעים וHDACs 12,21. מיקוד מתג HP במבחנים אלה התאפשר על ידי שימוש במתח זבוב שמבטא את הגנים ההיתוך histone2AvD-RFP וprotamineB-eGFP 12,22 בדפוסי אנדוגני, והתצפית שspermatids הראשון באשכי גלמים עובר דרך מתג HP בין 24 ו48 שעות 12 APF. הפרוטוקול המובא מתאר את הנתיחה של אשכים וציסטות מגלמי דרוזופילה, תנאי התרבות, וassay תרופתי עם אשכים גלמים שלמים. לצורך כך, אשכים גלמי בסביבות 24 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) הם גזורים (ראו איורים 1 ו -2). בשלב זה, האשכים לא יצרו קשרים לרקמות אחרות ומוקפים רק מעטפת חיצונית דקה, אשר מאפשרת חדירה טובה יותר על ידי תרכובות מעכב 23,24. האשכים הם איברי bean- או בצורת אגס שניתן לנקוט בקלות לתוך התרבות. אשכים אלה הם גזורים, תרבותיים, ושטופלו במעכבי ספציפיים. בהמשך לכך, ההשפעה של מעכבים מנוטרים באמצעות immunofluorescence ניתוחים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של ביטוי חלבון היתוך, ועל ידי השוואה של morphol הגרעיניogy של תאי הנבט שטופלו לזה של תאי נבט שלא טופלו. התנאים שהוצגו בפרוטוקול זה גם מאפשרים הדמיה חיה של פיתוח אשכים וציסטות נבט אונליין בתרבות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:332px;">Anacardic acid</td>
			<td style="width:105px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:99px;">172050</td>
			<td style="width:247px;">brand: Calbiochem (EMD Millipore)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-acetyl-Histone H4</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-598</td>
			<td>brand: Upstate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioObserver.Z1 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont 5-Inox forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fiber optical&#160; illuminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat anti-rabbit IgG (H+L)-Cy5</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-175-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Inoculation loop or pin holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel needles, size 0</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5018</td>
			<td rowspan="2" style="width:247px;">In our hands both these pin sizes worked well in the dissections. The minutiens are less rigid but have a smaller tip diameter.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">Austerlitz INSECT PINS stainless steel minutiens, diam. 0.1 mm</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>N5014</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multiwell plates, 24-wells</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>351147</td>
			<td>brand: Falcon</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen Strep</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>15070</td>
			<td>brand: Gibco</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Shields and Sang M3 Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stemi SV6 binocular</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment

במהלך יצירת תאי זרע ביונקים ובmelanogaster דרוזופילה, תאי נבט זכר לפתח בסדרה של תהליכים התפתחותיים חיוניים. זה כולל בידול מאוכלוסיית תאי גזע, הגברה mitotic, ומיוזה. בנוסף, בתאי נבט שלאחר meiotic לעבור תהליך דרמטי מורפולוגיים עיצוב מחדש, כמו גם שינוי תצורה אפיגנטיים גלובלית של הכרומטין-מתג היסטון לprotamine שורת הנבט. לומד את התפקיד של חלבון בתהליך יצור תאי זרע לאחר meiotic באמצעות mutagenesis או כלים גנטיים אחרים פגע לעתים קרובות על ידי עוברי חיונית, מראש meiotic, או פונקציות meiotic של החלבון הנחקר. פנוטיפ פוסט meiotic של מוטציה של חלבון כזה יכול להיות מוסתר על דרך לחסום התפתחות מוקדמת יותר, או הפרשנות של פנוטיפ יכולה להיות מסובכת. אורגניזם המודל תסיסנית מציע מעקף לבעיה זו: אשכים שלמים ואפילו ציסטות של תאי נבט גזורים מהגלמים מוקדם יכולות לפתח vivo לשעבר במדיום התרבות. תוך שימוש בתרבויות כזה מאפשר הדמיה מיקרוסקופית של תאי חיים נבט באשכים ושל ציסטות נבט אונליין. חשוב לציין, האשכים טיפחו ותאי נבט גם להיות נגישים למעכבים תרופתיים, וכך לאפשר מניפולציה של פונקציות האנזימטית במהלך יצירת תאי זרע, ובכלל זה שלבים שלאחר meiotic. הפרוטוקול המובא מתאר כיצד לנתח ולעבד את האשכים גלמים וציסטות נבט אונליין. מידע על התפתחות אשכים גלמים ותנאי תרבות ניתנת לצד נתוני ההדמיה מיקרוסקופ של אשכים חיים וציסטות נבט אונליין בתרבות. אנו גם מתארים assay תרופתי ללמוד יצירת תאי זרע לאחר meiotic, שהודגם על ידי assay מיקוד מתג היסטון לprotamine באמצעות חומצת anacardic מעכב acetyltransferase היסטון. בעיקרון, שיטת טיפוח זו יכולה להיות מותאמת לתת מענה רב oשאלות מחקר יס ביצירת תאי זרע לפני ואחרי meiotic.

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment at JoVE.com

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

ex-vivo-culture-drosophila-pupal-testis-single-male-germ-line-cysts

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

17.3K Views.  Philipps-Universität Marburg. This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Video: Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.