עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע.

1. יום 1 לפני שתתחיל: אוכלוסיה בריאה של זבובים יש לשמור על שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים culturing: להסיר מבוגרים מבקבוקי או צלוחיות לאחר 3-4 ימים של ביצה להניח ולאפשר פיתוח להמשיך בטמפרטורה קבועה עד נדודים 3 rd הזחלים instar ליזום pupariation. המעבר הזחל / גלמי מסומן על ידי היווצרות של prepupae (0 נחשב שעות לאחר puparium היווצרות-APF). גלמים תנועה נבדלים גלמים מבוגרים על ידי צבע לבן שלהם מפני הזחלים, כי טרם החלו pupariation ידי מלבן שלהם, צורה מעוגלת בליטה של ​​spiracles הקדמי. יהיה עליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכחול לאיסוף גלמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חדר לח עבור גלמים culturing: צלחת פטרי מרופדת במגבת נייר הרטובות מכוסה בנייר מסנן המסומנים בנקודות זמן שונות של גנוטיפ אוסף, או מין של גלמים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 1X שנאגרו מלוחים (PBS) לרחצה גלמים </li></ul> , אוסף culturing ובימוי גלמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול הרטובות בעדינות להסיר 0hr APF גלמים מבקבוקי תרבות / צלוחיות למקם אותם מכסה תא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מכחול ו 1X PBS לשטוף בעדינות את גלמים להסיר פסולת במקרה גולם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך למיין גלמים לפי מין. Primordia בלוטת המין של גלמים ניתן להשתמש כדי למיין את המינים. Primordia בלוטת המין הגברי הם זוג לרוחב של דיסקים שקוף לראות בקלות דרך לציפורן גלמי כ 2 / 3 לאורך הגוף 5. Primordia בלוטת המין הנשי הם קטנים ולא מזוהים בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלמים בעמדה שכותרתו כראוי בחדר לח ולחזור טמפרטורה קבועה. תרבות לנקודת הזמן המתאים ההתפתחותי. </li></ol> 2. יום 2: Dissection, קיבעון ו הדגירה נוגדן ראשוני לפני שתתחיל: יהיה עליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזמל כירורגי עם מספר 11 להבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני תשע גם דיכאון זכוכית מנות (מוצר קורנינג # 7220-85) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בארות מנה אחת עם 1X PBS: זהו מאכל שטיפה לניקוי גלמים גזור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בארות מנה שנייה עם חיץ קיבעון </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא לחים עבור הדגירה נוגדן. אנחנו משתמשים בקופסאות פלסטיק כריך סגר מרופדת במגבות נייר הרטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ קיבוע: 1x PBS, paraformaldehyde 4%, חומצה deoxycholic 0.2% (עבור permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטפורמה Dissection: שקופיות מיקרוסקופ נקה עם חתיכת סרט דו צדדית דבק בצד אחד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 או p200 pipettor </li></ul> בתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בעדינות להסיר את אחד גלמים בכל פעם ולמקם אותם על פלטפורמה דיסקציה עם סיום הקדמי של גלמים מול רוחב הרחב ביותר של הסרט. אם גלמים רטובות יתר על המידה, קודם למחוק אותם יבשים בעזרת מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני גלמים יש דבק לחלוטין לקלטת, להשתמש במכחול כדי למקם אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר גלמים לאוויר יבש לדבוק קלטת (5-10 דקות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל מנתחים לנתח כל גלמים בילטרלי. מטרה זו מושגת בצורה הטובה ביותר עם חתך מהיר אחד מן הקדמי עד הסוף האחורי של גלמים. אם נעשה כראוי, לחתוך יהיה לחצות בשני הקדמי ואת האחורי זוגות spiracles. לנתח לא יותר מ 10 גלמים בכל פעם כמו כביסה וניקוי דגימות במהירות נחוצה כדי למנוע נזק proteolytic לרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכחול, העברת כמות קטנה של 1X PBS על גלמים כל גזור כדי לשחרר אותם מן הקלטת. </li></ol> , ניקוי קיבעון ו הדגירה נוגדן ראשוני <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג מלקחיים כירורגיים לתפוס חצי אדם גולם anteriorly ומיד לטבול אותו היטב של צלחת השטיפה. הפלטפורמה לנתיחה צריך להיות מוחלף על ידי צלחת השטיפה על הבמה מיקרוסקופ. המקרה גלמים יש להשאיר על המדגם עד להשלמת העיבוד דגימות מוכנים להרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעודו אוחז את המחצית גולם להשתמש pipettor בעדינות כדי לשטוף את הרקמה הפנימית של הבטן. לחץ רב מדי במהלך הכביסה יכול להוביל לאובדן של תאים אפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את החצי נקי גולם למאגר קיבעון בטמפרטורת החדר תהליך החצאים הנותרים גולם דומה. עם, בפועל לנתיחה ושטיפת של 20 חצאים גולם צריך לקחת פחות מ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר גלמים כדי לדגור במאגר קיבעון בטמפרטורת החדר 1 (אחד) לשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קבוע 3x גלמים חמש דקות 1X PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות יכול להיות מעובד באופן מיידי עבור אימונוהיסטוכימיה או עשויים להיות מאוחסנים אתנול 100% ב -20 ° C עד 3 חודשים ללא הפסד של תאים או תגובתיות epitope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאחסן דגימות, לאזן דגימות באמצעות דילולסדרה של PBS: EtOH (03:01, 01:01, 01:03) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כל דילול לפני ההעברה EtOH 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות יש מחדש equilibrated ב PBS באמצעות סדרה הפוכה לפני עיבוד אימונוהיסטוכימיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק דגימות 1x PBS (בתוספת 2% אלבומין בסרום שור) עבור 1 (אחד) שעה לפני תוספת של הנוגדן הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני מדולל לריכוז המתאים 1X PBS לאורך הלילה 4 ° C ללא נדנדה. </li></ol> 3. יום 3: נוגדן הדגירה משניים, הרכבה הדמיה לפני שתתחיל: יהיה עליך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מלקחיים כירורגיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקשורת הרכבה (גליצרול, Vectashield [וקטור מעבדות], או Slowfade זהב [Invitrogen]) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם דיכאון מיקרוסקופ שקופיות (0.8 מ&quot;מ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips (24 x 40 מ&quot;מ) </li></ul> נוגדן הדגירה ואת הרכבה משניים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 3x דקה 10 כל אחד עם 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק דגימות 1x PBS (בתוספת 2% אלבומין בסרום שור) עבור 1 (אחד) שעה לפני תוספת של נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני מדולל לריכוז המתאים 1X PBS בטמפרטורת החדר בחושך בלי נדנדה במשך 3 (שלוש) שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף דגימות 3x דקה 10 כל אחד עם 1x PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, counterstain גלמים (דוגמה אנו כתם גרעינים עם DAPI [4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole] מדולל PBS למשך 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דגימות (מינימום של 30 דקות) בתקשורת המתאים לפני הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית המדגם. המורפולוגיה של גלמים מונע הרכבה שטוחה. דוגמאות מורכבים בבאר של שקופית דיכאון (שקופית ירידה) עבור הדמיה. מקום 75 ​​100ul התקשורת הרכבה בשקע היטב. מספר דוגמאות יכול להיות מותקן בשקופית אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקרה גולם יש להסיר מן הדגימות לפני הרכבה. אחוז מקרה בודד גולם anteriorly להיות בטוח שלא לתפוס את קרום גלמי פנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג נוסף של מלקחיים בעדינות לתפוס את קרום גלמי פנימי על ידי ראש ולהסיר ממנו במקרה גלמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את המדגם לדיכאון היטב ולהמשיך עיבוד דגימות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עמדת בדיקה או מלקחיים דגימות אחיד הדיכאון היטב את פני השטח לרוחב פונה כלפי מעלה. בועות אוויר מזדמנים ניתן להסיר עם בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוריד את coverslip על דגימות מקפיד שלא להכניס בועות אוויר </li></ol> 4. נציג התוצאות: דוגמאות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה לשמור על מורפולוגיה ברוטו של הבטן מבוגר. ערימות תמונה עשוי להיות מוקרן כדי ליצור תמונה דו מימדי או 3-D טיוח ניתן להחיל לחקור טופולוגיה הבטן. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. גן פילוח מוצרים תסיסנית גלמים חלבון כנפיים וביטוי Engrailed (En-gal4: כטב&quot;מ-GFP). דמיינו היו בשעה 26 לאחר היווצרות puparium (APF) עם העכבר אנטי WG (4D4: איווה Hybridoma בנק) ואנטי GFP. הגדלה 10x, הקדמי הוא עזב הגבי הוא למעלה. Nucleii היו counterstained עם DAPI. ערימות של כ -50 תמונות (ΔZ בין פרוסות היא 2.5μm) הוקרנו.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקות שהוצגו וידאו זה יכול לשמש כדי להכין תסיסנית גלמים ממגוון רחב של נקודות זמן התפתחותי. גלמים מעובד במהלך התקופה של 24 שעות ל 32 שעות APF APF נוטים ביותר לאובדן התא האפיתל. השימוש בחומרי ניקוי (כגון טריטון X-100 ו Tween-20) במהלך השלבים דגירה ממושכת מגבירה את הסבירות של אובדן תאים ולכן אינו מומלץ. במקום זאת, חומצה deoxycholic משמש חומר ניקוי במהלך השלב הראשוני קיבעון. כל הצעדים הבאים מתבצעים 1X PBS ללא חומרי ניקוי. בנוסף, נדנדה דגימות במהלך השלבים דגירה ממושכת מגבירה איבוד התא יש להימנע. דוגמאות ניתן הדמיה באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, תסיסנית גלמים מעובד כפי שתואר יכול להיות גם הדמיה באמצעות מערכת תאורה מובנית מיקרוסקופיה מניב איכות התמונה דומה טכניקות confocal.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection stereomicroscope </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כירורגי מלקחיים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזמל כירורגי עם מספר 11 להבים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתשעה גם דיכאון זכוכית מנות (Corning מוצר # 7220-85) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא לחים עבור גלמים culturing </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 1X שנאגרו מלוחים (PBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 11 באזמל כירורגי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעמיים צדדי קלטת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ קיבוע: 1x PBS, paraformaldehyde 4%, חומצה deoxycholic 0.2% (עבור permeabilization) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P100 או p200 pipettor </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם דיכאון מיקרוסקופ שקופיות (0.8 מ&quot;מ) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

הבטן גלמי תסיסנית היא מערכת מודל הוקמה לחקר המורפוגנזה אפיתל לבין התפתחות מינית מורפולוגיות דימורפית 1-3. במהלך התגלמות, אשר משתרע על פני כ 96 שעות (במהירות של 25 ° C), אוכלוסיות של תאים מתרבים דמותי להחליף את האפידרמיס הזחל כדי ליצור את קטעי בטן מבוגר. תאים אלה דמותי, נולד במהלך embryogenesis, קיימים זוגות לרוחב של קינים histoblast בכל מגזר בטן של הזחלים. ארבעה זוגות של קנים histoblast להצמיח לציפורן הגב מבוגר (קינים הגבית קדמית אחורית), לציפורן הגחוני (קינים הגחון) ואת spiracles קשור כל פלח (קינים spiracle) 4. עם puparation, תאים אלה דיפלואידי (להבחין לפי גודל גדול יותר מן הזחל polyploid אפידרמיס התאים-LECs) להתחיל בתהליך סטריאוטיפי של הגירה התפשטות, והחלפת LECs. כלים מולקולריים וגנטיים שונים יכול להיות מועסק לחקור את תרומתם של המסלולים הגנטיים המעורבים המורפוגנזה של הבטן מבוגר. פנוטיפים מבוגר האולטימטיבי מנותחים בדרך כלל לנתיחה הבא של העור הקרני בטן מבוגר. עם זאת, חקירה של התהליכים המולקולריים שבבסיס דורש ניתוח immunohistochemical של האפיתל גלמי, אשר נוכח אתגרים ייחודיים. באופן זמני המורפוגנזה דינמי את יחסי הגומלין של שתי אוכלוסיות נפרדות אפיתל (הזחל ואת דמותי) ליצור רקמת שברירי מועדים לאובדן התא מופרז במהלך עיבוד לנתיחה שלאחר מכן. פיתחנו שיטות לנתיחה, קיבעון, הרכבה הדמיה של האפיתל תסיסנית abdominem גלמי ללימודי immunohistochemical שיוצרים עקבי דגימות באיכות גבוהה מתאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או רגיל.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry at JoVE.com

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

נוגדן מכתים של<em&gt; תסיסנית</em&gt; גלמים יכול לשפר ניתוח גנטי של מבוגר גנטיקה התפתחותית הבטן. אנו מציגים פרוטוקול שלנו מכתים, דיסקציה קיבוע של נוגדן ו מבוים<em&gt; תסיסנית</em&gt; גלמי הבטן.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.1K Views.  University of Alabama. נוגדן מכתים של תסיסנית גלמים יכול לשפר ניתוח גנטי של מבוגר גנטיקה התפתחותית הבטן. אנו מציגים פרוטוקול שלנו מכתים, דיסקציה קיבוע של נוגדן ו מבוים תסיסנית גלמי הבטן.

Video: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

חתך דק של ההכנות פורסים עבור אימונוהיסטוכימיה

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

בפרוטוקול באתרו על כנפי פרפר גלמי שימוש Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...