אנו מודים סגל, חברים, תושבים, עוזרי רופא של בריגהאם ובית החולים לנשים, המחלקה לפתולוגיה להכנת רקמה זמין עבור מחקרים אלו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מ-NIH / המכון הלאומי לסרטן (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), סרטן השחלות קרן מחקר, קרן קיי, נוברטיס פרמצבטיקה, רוברט ודבורה ראשון הקרן, רנדי וג&#39;ואל סרטן השחלות מאי קאטלר מחקר הקרן, מרשה ריבקין קרן - פרס המלומד מדעי, AACR - ג&#39;ורג&#39; פטרישיה Sehl אחוות סרטן וגנטיקה המחקר, ואת אחוות רופא האמריקנית לרפואת בישראל - קלייר ועמנואל ג&#39;רוזנבלט קרן גרנט.

1. קולגן הכנה ציפוי מסנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את השליה קולגן אנושי, למרוט את 30 מ&quot;ג של קולגן השליה האנושית לשים על גבי 50 מ&quot;ל של מים מזוקקים (DH 2 O) בכוס 500 מ&quot;ל עם בר ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μls של חומצה אצטית קרחונית ישירות על קולגן כדי להקל לפזר. חם עד 37 ° C ומערבבים אותו לפזר את הקולגן. יש להמיס 20-30 דקות. אם גדילי קולגן להישאר פתרון, עיקור לסנן יהיה קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות עם 50 מ&quot;ל 450 מ&quot;ל של DH 2 O ו-מסנן לעקר עם קרום 0.2 מיקרומטר. זהו הפתרון הסופי עובד. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ממברנות Transwell לסנן ידי ציפוי אותם עם קולגן (5-10 μl) לילה. קולגן מצוננים יש לחמם RT ואז הוסיף לתא העליון על מנת לכסות את קרום לילה ועל RT. לפני ציפוי הצינור ניתק השחלה ראשונית (FT) אפיתל (ראה להלן) על גבי מסנני Transwell, לשטוף את המסננים שלוש פעמים פוספט 1X בופר סליין (PBS) לפחות 1 שעה לפני השימוש כדי להסיר עודפי קולגן. </li></ol> 2. רקמות איסוף דיסוציאציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החצוצרה טרי (FT) fimbria צריך להיות סטרילי שנאספו 1X PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל ושמרה על הקרח לפני הפקודה עיבוד ברדס רקמה סטרילית תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את דגימת רקמות פעם 20 מ&quot;ל מקורר 1X PBS (אם המדגם נאסף בסוג אחר של מדיה או לשטוף הדמים לפחות 3X להיפטר כמו דם רב בתקשורת הזרה ככל האפשר זה עלול להפריע יעילות ציפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש סטרילי FT פינצטה להעביר צלחת 10 ס&quot;מ עם רקמה תרבות PBS מעט, בעזרת פינצטה אזמל סטרילי סטריליות, לחתוך longitudinally על מנת למקסם את החשיפה של תאים אפיתל. פתח את fimbria כך הוא כבר לא צינור אלא גיליון כמעט שטוח של רקמה. ואז לחתוך לחתיכות קטנות יותר אבל עדיין לשחזור (כ 3 מ&quot;מ קוטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים ל 45 מ&quot;ל של צונן ניתוק התקשורת (ממ המכיל 1.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Pronase ו 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNAse) בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוק בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות. (מניסיון, 48 שעות הוא אופטימלי). כדי לבדוק את כמות דיסוציאציה, לשים טיפה של ניתוק התקשורת בשקופית ולבדוק כמות clumping ואת הכדאיות רקמות (מכות ריסי התאים). אתה רוצה לראות שני תאים בודדים וכמה גושים קטנים. </li></ol> 3. החצוצרה ציפוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כמות דיסוציאציה תא אפיתל הוא אופטימלי, להשבית את התקשורת על ידי הוספת נפח 10% FBS. ללא מרחב זה כמה פעמים כדי לסלק את ההשעיה לתוך תא אגרגטים קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר גושי רקמה גדול (רקמת סטרומה) ​​להתיישב לתחתית הצינור. הסר מדיה המכילה תאים אפיתל לתוך צינור 50 second מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ל של ממ קר (לא FBS) אל הצינור המקורי 50 מ&quot;ל. היפוך לאסוף תאים נוספים. איסוף מדיה לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל השלישי (אם המדגם הוא גדול מאוד ומספר גבוה של תאים צפוי, שלב זה ניתן לחזור על מנת למקסם את אוסף תאים). חתיכות גדולות של רקמה סטרומה / תאיים יכולים כעת להיות מושלך. כעת יש שני צינורות 50 מ&quot;ל של השעיה התא. צנטריפוגה בסל&quot;ד 1000 למשך 5 דקות לשאוב התקשורת ניתוק מן כדורי התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב כ 5-10 מ&quot;ל של USG מדיה (DMEM: F12 USG בתוספת 2% ו עט סטרפטוקוקוס 1%) חימם עד 37 ° C. פיפטה בעדינות. היזהר שלא פיפטה גם במרץ כמו זה עלול לגרום נזק לתאי האפיתל ולהפחית את האיכות של תרבויות. לא צריך להיות תאים בודדים ו גושים קטנים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה על גבי צלחות Primaria תרבות דגירה מינימום של 1 שעה או עד 3 שעות. Fibroblasts ותאי דם אדומים ידבק הפלסטיק אבל התאים FT אפיתל לא. תסתכל על הצלחת אחרי שעה כדי לראות אם משהו הוא דבק. נוכחות של תאים ריסי ניתן לראות על ידי ציון הפועם של הריסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה זה, מסננים קולגן מצופה ניתן לכבס ועשה מוכן ציפוי התא (ראה שלב 1.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 1-3 שעות של דגירה על צלחות Primaria, להעביר את ההשעיה התא צינור 15 מ&quot;ל ולשטוף את הצלחת Primaria עם 5 מ&quot;ל USG התקשורת, להעביר את התקשורת הצינור לעשות נפח סופי של 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה בסל&quot;ד 1000 למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב התקשורת למנוע שיבוש התא גלולה. אם לשפוט לפי גודל כדורית, resuspend בכמות המתאימה של USG התקשורת. (בדרך כלל בין 1-3 מ&quot;ל) פחות טוב בהתחלה, כך שאתה יכול לדלל עוד יותר אם אתם צריכים. Resuspend בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של תאים resuspended hemacytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים. טיפים: אתם מחפשים לתאי האפיתל שיש להם קרום התא כהה בבירור והם לא עמודי. ניתן גם לספור תאים ריסי זה בהחלט מרגש. תאים קטנים יותר, כי יש appearan הילהce הם כדוריות דם אדומות ולא צריך לסמוך. יהיו כמה clumping, אז אתה צריך להעריך את זה לתוך לספור את התא. המטרה היא זריעת 1.65 x10 5 תאים / קרום, או לפחות 75% כיסוי המסנן (איור 1). אם התאים מצופה גם בדלילות, התאים לא יוכלו ליצור שכבת האפיתל להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של התקשורת USG לתחתית הבאר של צלחת גם 24 והכנס Transwell. נפח הנדרש ההשעיה תא FT (ראה לעיל) ניתן להוסיף על גבי קרום אחד, זה בדרך כלל 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ולגדול עבור 1-2 ימים ללא למעלה מטרידה של הממברנה. ניתן לשנות את התקשורת בצד הבסיס באותם ימים אם יש צורך. לאחר 1-2 ימים, אתה יכול לשטוף היטב את החלק העליון עם USG מדיה להוסיף כמות קטנה (5-10 μl) של התקשורת על גבי הממברנה. קל יותר לקבוע את מפגש של תרביות תאים אם התקשורת מוסר מהצד apical של המסננים לפני במיקרוסקופ. תא נמוך צריך תמיד להכיל התקשורת. לאחר תרבויות הם ומחוברות במלואו (בדרך כלל תוך 5 ימים), כמות התקשורת העוברים דרך המסננים מן הבסיס אל הצדדים apical צריך להיות זניח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת הבסיס פעם ביומיים במשך 10 הימים הראשונים. תא התחתון חייב תמיד התקשורת כדי לשמור על התאים בחיים. ברגע שהתאים יצרו שכבת האפיתל צמודים (איורים 1 ו -2) הם יכולים לשמש מחקרים נוספים, כגון immunofluorescence (IF) או אימונוהיסטוכימיה (IHC). </li></ol> 4. ממברנה עיבוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוד ממברנה תלוי בסוג מחקר זה יבוצע, אבל בדרך כלל כרוכה הסרת המסנן מ מחדיר Transwell. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המסננים נשטפים בדרך כלל 3 פעמים 200 μl של 1X PBS לפני ההסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS מצד apical ואת הבסיס של המסננים. זה צריך להיעשות 1 היטב בכל פעם כדי למנוע את הקרומים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכנס מהצלחת, להפוך אותו הפוך ולהשתמש אזמל סטרילי לחתוך סביב הממברנה. נסה להסיר את הקרום בחתיכה אחת על ידי ביצוע חתכים ישר מסביב לקצה קרום, במקום לגרור את האזמל מסביב לקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה כדי להסיר את המסנן מתוך הכנס את, שמירה על מסלול של איזה צד התאים על. מסנן אז יכול להיות מעובד על IF, IHC, וכו &#39;בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמה: אם עבור מחקרים, המסנן (לאחר permeabilization קיבוע, חסימת הדגירה עם נוגדנים מתאימים, על פי תקן אם הליכים) צריך להיות ממוקם בשקופית, התאים כלפי מעלה, Vectashield עם DAPI הוא ירד על המסנן מכוסה זכוכית coverslip. </li></ol> 5. נציג תוצאות: המסננים transwell ניתן להסיר בקלות לבחון את אפיתל vivo לשעבר ידי אימונוהיסטוכימיה שניהם (IHC) ו immunofluorescence (IF). שימוש השושלת סמנים ספציפיים, אפשר לכמת את התמונה הפרשה (Pax8 חיובי) ו ריסי (Sall2 חיובי) תאים תא בתרבויות אלה (איור 3). יתר על כן, באמצעות סמנים אלה, ניתן לעקוב כיצד כל סוג תא מגיב לאותות פיזיולוגיים שונים 10. מערכת זו נעשה שימוש על מנת לאפיין את השינויים phosphoproteome secretome ו תאיים של האפיתל FT בתגובה לגירויים השונים. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. איור המתאר כיצד לשעבר תרבויות vivo נוצרות מרקמת הצינור האנושי העיקרי השחלה. רקמת החצוצרה fimbrial מתקבל חבילת כירורגית טחון ליצור שברים קטנים 1, כי הם שטף מודגרות עם ניתוק התקשורת 24-72 שעות 2. לאחר הניתוק הוא מוחלט, שברי הרקמה מותר ליישב לתחתית של התחתית הדגירה והתקשורת המכיל את לתאי האפיתל הוא ניתק שנקטפו 3. היעילות של דיסוציאציה יכולה להיות במעקב על ידי בדיקה תחת 4 שלב בניגוד מיקרוסקופ. תאים אפיתל ניתק הם מתורבתים אז על צלחות Primaria לעזור להסיר תאים פיברובלסטים hematopoietic כי תמיד ונכללה בה תאים אפיתל 5. לאחר אי - אפיתל תאים יוסרו כראוי, התאים אפיתל הם זורעים על גבי מסנני transwell כי הם מצופים השליה קולגן אנושי 5. התקשורת מסופק על ידי דיפוזיה דרך transwell מלמטה. תרבויות מודגרת במשך 24-48 שעות ואז התקשורת apical מוסר. תרבויות vivo לשעבר מותר אז לגדול במשך 5-8 ימים כדי ליצור דשא מלא, שלם על מסנני transwell. תרבויות vivo לשעבר יכול להישמר viably עד 4 שבועות במצב הזה. הקריקטורה 5 מראה ייצוג של תרבות בוגרת vivo לשעבר עם דוגמה של מסנן להסיר להכניס את ומוכתמים והמטוxylin ו eosin (H &amp; E) כדי להדגים את הקוטביות ואת הארכיטקטורה של האפיתל vivo לשעבר. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. במיקרוסקופ שדה מוארת של FT תרבויות לשעבר vivo. מוסיף Transwell הם מצופים האדם הנקבוביות 0.4μm השליה קולגן נראים (א). תאים אפיתל FT הם מתורבתים על קולגן מוסיף מצופים (ב), שם הם יוצרים שכבת אפיתל (ג). פסולת כמה הוא ציין שבדרך כלל לדבוק תאים בתרבות אפיתל (מסומנת בחצים), לרוב תאים ריסי. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. FT לשעבר vivo תרבות immunofluorescence (IF). דוגמאות אם התמונות של תרבויות vivo לשעבר קבוע מוכתם נוגדנים כנגד הפרשה (א) (Pax8) ו - (ד) תא ריסי (Sall2) סמנים. DAPI משמש לשלוט על המיקום של גרעיני תאים (כחול) (ב ו - ה) ו נוגדן הממוזג מכתים DAPI מוצג גם (ג ו - ו). מספר התאים תלוי משך הזמן התאים בתרבית (Pax8 מכתים, 7 ימים; Sall2 מכתים, 3 ימים).

<ol>
	<li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J., Ward, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics.">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li><li>Markman, M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+chemotherapy+of+ovarian+cancer:+a+review,+with+a+focus+on+practical+aspects+of+treatment.">Intraperitoneal chemotherapy of ovarian cancer: a review, with a focus on practical aspects of treatment.</a> J. Clin. Oncol. 24, 988-994 (2006).</li><li>Liu, J., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+advances+in+ovarian+cancer.">New advances in ovarian cancer.</a> Oncology (Williston Park). 24, 721-728 (2010).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Kurman, R. J., Shih, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer:+a+proposed+unifying+theory.">The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory.</a> Am. J. Surg. Pathol. 34, 433-443 (2010).</li><li>Fong, M. Y., Kakar, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+mouse+models:+a+summary+of+current+models+and+their+limitations.">Ovarian cancer mouse models: a summary of current models and their limitations.</a> J Ovarian Res. 2, 12-12 (2009).</li><li>Shan, W., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer:+focus+on+genetics+and+animal+models.">Epithelial ovarian cancer: focus on genetics and animal models.</a> Cell Cycle. 8, 731-735 (2009).</li><li>Levanon, K., Crum, C. P., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+pathogenesis+of+serous+ovarian+cancer+and+its+clinical+impact.">New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact.</a> J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, 932371-932371 (2010).</li><li>Levanon, K., Ng, V., Piao, H. Y., Zhang, Y., Chang, M. C., Roh, M. H., Kindelberger, D. W., Hirsch, M. S., Crum, C. P., Marto, J. A., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+ex+vivo+cultures+of+human+fallopian+tube+epithelium+as+a+model+for+serous+ovarian+carcinogenesis.">Primary ex vivo cultures of human fallopian tube epithelium as a model for serous ovarian carcinogenesis.</a> Oncogene. 25, 1103-1113 (2010).</li><li>Landen, C. N., Birrer, M. J., Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer.">Early events in the pathogenesis of epithelial ovarian cancer.</a> J. Clin. Oncol. 26, 995-1005 (2008).</li><li>Vermeer, P. D., Einwalter, L. A., Moninger, T. O., Rokhlina, T., Kern, J. A., Zabner, J., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+receptor+and+ligand+regulates+activation+of+epithelial+growth+factor+receptor.">Segregation of receptor and ligand regulates activation of epithelial growth factor receptor.</a> Nature. 422, 322-326 (2003).</li></ol>

ד&quot;ר Drapkin הוא יועץ נוברטיס פרמצבטיקה. לא מחברים אחרים להכריז על כל הקונפליקטים הפוטנציאליים של עניין.

הזיהוי של FT כאתר מועמד ממוצא עבור SOC מספק הזדמנות למחקר בסיסי translational שמטרתן לפענח את המנגנונים המקשרים גורמי סיכון ידועים ותהליך בפועל מסרטנים הצפק. קריטי עבור זה הוא פיתוח של מערכות מודל ממושמע שיאפשר לנו להתחיל לבדוק את ההשערה כי FTSEC הוא תא-of-מקור עבור קרצינומה הצפק האגן. Vivo לשעבר התרבות המודל שתואר להלן, היא מערכת חדשנית המאפשרת את הבידוד ושיתוף תרבות של הפרשה FT ראשוניים בתאים ריסי באופן שמשמר את המורפולוגיה והביולוגיה של האפיתל FT הילידים. באמצעות מערכת זו, אנו לאחרונה שאפיינה את secretome של האפיתל הזה ואיך האפיתל מגיב פגיעה מכנית genotoxic 10. הביוץ, גורם סיכון מרכזי הקשור tumorigenesis השחלות, מאופיין על ידי שילוב של פגיעה ברקמות, מתווכים דלקתיים, גורמי גדילה, והורמונים 11. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של הסביבה הביוץ על התגובה ואת הכדאיות של הפרשה ותאי ריסי. בנוסף, ההשפעה של סוגי תאים אחרים (כלומר תאים דלקתיים) ניתן היה לבדוק על מנת לאפשר הבנה טובה יותר של אירועים מסוג זה בתא הכונן בידול הגורמים שתורמים השינוי neoplastic של תאים אלה. מודלים דומים תוארו ברקמות האפיתל מקוטב אחר שבו הוא ההווה. למשל, בתרבויות העיקרי מקוטב של אפיתל דרכי הנשימה, ההשפעה של heregulin על צמיחת התאים בתגובה לפציעה הסלולר הוערך 12. אלו סוגים של מערכות מודל לספק דרך חדשה ושימושית ללמוד את חניכה בפתוגנזה של גידולים אשר נובעים רקמות אפיתל, ואת זה הוא בעל חשיבות קריטית ברקמות כגון FT שבו אין שורות תאים קיימות כיום, והיכן יש גדול לצורך זיהוי של המסלולים מפתח ופיתוח של אסטרטגיות טיפול חדשניות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

סרטן השחלות אפיתל היא הגורם המוביל לתמותה מסרטן נשי בארצות הברית. בניגוד לנשים ספציפיים סרטן אחרים, כמו השד קרצינומה של הרחם, כאשר שיעור התמותה ירדו בשנים האחרונות, שיעורי ריפוי סרטן השחלות נותרו ללא שינוי יחסית לאורך שני העשורים האחרונים 1. זה נובע במידה רבה מחוסר כלים ההקרנה המתאים לגילוי המחלה בשלב מוקדם בו ניתוח וכימותרפיה הם יעילים ביותר 2, 3. כתוצאה מכך, רוב המטופלים עם מחלה בשלב הנוכחי מתקדמים מעורבות הבטן מפוזר. זה מסתבך עוד יותר בשל העובדה סרטן השחלות היא מחלה הטרוגנית עם תת היסטולוגית מספר 4, 5. סרטן שחלות נסיובי (SOC) הוא תת הנפוצים ביותר אגרסיבי הטופס הקשורים לרוב עם מוטציות בגנים BRCA. מודלים ניסיוניים מקומי בתחום זה כרוכות בשימוש שורות תאים סרטניים מודלים העכבר כדי להבין טוב יותר את האירועים גנטי ייזום בפתוגנזה של מחלות 6, 7. לאחרונה, החצוצרה התפתחה כאתר הרומן מוצא SOC, עם החצוצרות (FT) התאים מפרישים אפיתל (FTSEC) כתא המוצע של 8 המוצא, 9. כרגע אין קווים סלולריים או מערכות תרבות זמין ללמוד את האפיתל FT או FTSEC. כאן אנו מתארים לשעבר רומן vivo התרבות מערכת שבה העיקרי בתאי האפיתל FT אדם מתורבתים באופן שמשמר ארכיטקטורה שלהם, קוטביות, immunophenotype, ובתגובה ללחצים פיזיולוגי genotoxic. מודל זה vivo לשעבר מספק כלי שימושי לחקר SOC, ומאפשר הבנה טובה יותר של כמה גידולים יכול לנבוע רקמה זו, המנגנונים המעורבים בייזום התקדמות הגידול.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

החצוצרה (FT) מתגלה כאתר חלופי ממוצא עבור סרטן השחלות הצפק (SOC). פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה בידוד ו<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; התרבות של תאים החצוצרה אפיתל. מערכת זו משחזר<em&gt; In vivo</em&gt; האפיתל, ומאפשר את לימוד בפתוגנזה SOC.

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K Views.  Dana-Farber Cancer Institute. החצוצרה (FT) מתגלה כאתר חלופי ממוצא עבור סרטן השחלות הצפק (SOC). פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה בידוד ו לשעבר vivo התרבות של תאים החצוצרה אפיתל. מערכת זו משחזר In vivo האפיתל, ומאפשר את לימוד בפתוגנזה SOC.

Video: Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

בידוד, תרבות והנדסה גנטית של תאי אפיתל פיגמנט ראשוני של יונקים לטיפול גנטי לא ויראלי

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...