עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי המוסד למשרד החקלאות האמריקנית הלאומי למזון וחקלאות, תכנית מענקים תחרותיים לאומית, הלאומית למחקר תכנית יוזמה 71.1 2,007 פ.י. כגרנט 2007-35503-18392 מס, והמכונים הלאומיים לבריאות, מכון לאלרגיה ומחלות זיהומיות , R33AI94514-03.

.1 סמים הכנת ספינינג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טווח ריכוזי biopolymer להיחקר (0.1% ל30%, w / v) ולהיות בטוחים לשקול תכולת לחות של אבקת biopolymer בחישובים האלה. עבור כל ריכוז, לשקול את biopolymer (עמילן או pullulan) אבקה לתוך מבחנת 50 מ&quot;ל. הוספת sulfoxide דימתיל המימית פתרון (DMSO) ובר ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך מים רותחים עם ערבוב מתמיד על פלטה חמה בוחש מגנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 1 שעות, לכבות את החום ולאפשר הפיזור להתקרר לטמפרטורת חדר. הפיזור הוא אז מוכן לבדיקה וelectrospinning rheological. </li></ol> .2 שאר Rheology היציב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את rheometer ולהגדיר את טמפרטורת הבמה ב20 מעלות צלזיוס. כייל את הפער בין (קונוס 25 מ&quot;מ בשימוש) בדיקה והשלב (צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 0.41 מ&quot;ל של פיזור biopolymer על מרכז הבמה ולהפחית את הבדיקה כדי לקבוע את positiב( פער 0.053 מ&quot;מ לקונוס 25 מ&quot;מ). לוודא כי הפיזור באופן שווה מתפשט בתוך הפער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את בדיקת rheological עם הפרמטרים הניסיוניים הבאים: מצב לטאטא: להתחבר, שיעור ראשוני: 100 שניות -1, שיעור סופי: 0.1 שניות -1, ממוצע נקודות לעשור: 10, עיכוב לפני מידה: 5 שניות, למדוד זמן: 10 שניות, וכיוונים למידה: שני (שניהם עם כיוון השעון ונגד כיוון שעון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח נתונים rheological להעריך ריכוזי פיזור מתאימים לelectrospinning ניסויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה צמיגויות גזירה לכאורה נגד שיעורי גזירה כפונקציה של ריכוזי פולימר. לכל עקומת זרימה, צמיגויות אפס גזירה משוערת, η 0, על ידי הערכים בפועל או אקסטרפולציה (למשל, בריכוזים נמוכים שבו נתונים שיעור גזירה נמוכים הם לא אמינים) לצמיגות לכאורה ב0.1 שניות - 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב צמיגות מסוימת: η sp = (η 0 - η ים)/ Η של, שבו η s הוא הצמיגות של הממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה צמיגויות מסוימות כפונקציה של ריכוז. לזהות משטרי unentangled והסבוכים semidilute. משטר unentangled semidilute מתחיל מסוף הריכוז הנמוך עם שיפוע קטן, ויש לו את המשטר semidilute הסתבך מדרון גדול הבא משטר unentangled. מודלים של רגרסיה כוח חוק Fit בשני המשטרים. ערכי הכח הם המדרונות (תלות ריכוז) במשטרי unentangled והסבוכים semidilute על מגרש log-log. ההצטלבות של שני קווים מצוידים היא ריכוז ההסתבכות, דואר ג. </li></ol></li></ol> .3 Electrospinning פרמטר וריאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התקנת electrospinning כפי שמוצג באיור 1. טען את המזרק עם פיזור של הרכב מתאים, למשל, 15% (w / v) עמילן או pullulan ב100% DMSO, על משאבת המזרק. קליפ חוט מתח הגבוה (מניחive) למחט. חבר את האמבטיה הקרישה המכילה אתנול טהור לקרקע על ידי טבילת חוט הקרקע (שלילי) לאמבטיה. השתמש בשקע מעבדה כדי להתאים את המרחק בין מחט המזרק ואמבטית קרישה. לטבול את רשת מתכת באמבטיה כדי לאסוף את שטיח הסיבים לאחר electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין biopolymer בפרמטר הבא נע: שיעור הזנה 0.1-.4 מ&quot;ל / שעה, מרחק ספינינג בין 5 ל 10 סנטימטר, ומתח 0-15 ק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם מרחק ספינינג של 5 סנטימטר. לשיעור הראשון הזנה (0.1 מ&quot;ל / שעה), כבש את המתח לאט לאט משים לב 0 V. לצורה של הפיזור נמתחים בקצה המחט ושים לב כאשר הפיזור המטפטף מואץ ולאחר מכן מוארך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב למתח שבו מטוס זעיר שיזם ממשטח הירידה, המצביע על electrospinnability של הפתרון. רשום את המתח שבו סילון רציף יוזם, אם בכלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את הטווח המלא לכל אחד מparamete שלושrs ותנאי ספינינג מוצלחים פתק. לאסוף את הסיבים רק כאשר יש סילון רציף מהקצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כמה איסוף דקות, לשטוף את שטיח סיבים עם אתנול טהור. הנח את מחצלת הסיבים לייבוש המכיל יבוש תחת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל ריכוז biopolymer לאפיון מלא. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51933/51933fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 ציור סכמטי של ההתקנה חשמלית מסתובב רטובה. פיזור biopolymer נמתח ממשאבת מזרק. אספקת חשמל במתח גבוה DC מספקת מתח גבוה למחט הקהה וטענת האמבטיה הקרישה. סילון הפולימר מקצה המחט עובר דרך דרך ישרה ולאחר מכן מפתחת דרך הצלפה מהירה (aka מצליפה חוסר יציבות). .4 מורפולוגי אפיון<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי פיסת שטיח סיבים מיובשים ולשתק אותו על בדל SEM באמצעות קלטת פחמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את בדל המדגם לתוך מכשיר SEM ולהשיג תמונות לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Greiner, A., Wendorff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+self-assembled+nanofibers+by+electrospinning.">Functional self-assembled nanofibers by electrospinning.</a> Self-aseembled nanomaterials. 1, 107-171 (2008).</li><li>Ramakrishna, S., Fujihara, K., Teo, W. E., Lim, T. C., Ma, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to Electrospinning and Nanofibers. , (2005).</li><li>Klossner, R. R., Queen, H. A., Coughlin, A. J., Krause, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+Chitosan&#8217;s+Rheological+Properties+and+Its+Ability+to+Electrospin.">Correlation of Chitosan&#8217;s Rheological Properties and Its Ability to Electrospin.</a> Biomacromolecules. 9 (10), 2947-2953 (2008).</li><li>McKee, M. G., Wilkes, G. L., Colby, R. H., Long, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlations+of+Solution+Rheology+with+Electrospun+Fiber+Formation+of+Linear+and+Branched+Polyesters.">Correlations of Solution Rheology with Electrospun Fiber Formation of Linear and Branched Polyesters.</a> Macromolecules. 37 (5), 1760-1767 (2004).</li><li>McKee, M. G., Hunley, M. T., Layman, J. M., Long, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+rheological+behavior+and+electrospinning+of+cationic+polyelectrolytes.">Solution rheological behavior and electrospinning of cationic polyelectrolytes.</a> Macromolecules. 39 (2), 575-583 (2006).</li><li>Kong, L., Ziegler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+pure+starch+fibers+by+electrospinning.">Fabrication of pure starch fibers by electrospinning.</a> Food Hydrocolloids. 36, 20-25 (2014).</li><li>Singh, R. S., Saini, G. K., Kennedy, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pullulan:+microbial+sources,+production+and+applications.">Pullulan: microbial sources, production and applications.</a> Carbohydrate Polymers. 73 (4), 515-531 (2008).</li><li>Leathers, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+and+applications+of+pullulan.">Biotechnological production and applications of pullulan.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 62 (5), 468-473 (2003).</li><li>Karim, M. R., Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+characterization+of+electrospun+pullulan/montmorillonite+nanofiber+mats+in+aqueous+solution.">Preparation and characterization of electrospun pullulan/montmorillonite nanofiber mats in aqueous solution.</a> Carbohydrate Polymers. 78 (2), 336-342 (2009).</li><li>Stijnman, A. C., Bodnar, I., Hans Tromp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning+of+food-grade+polysaccharides.">Electrospinning of food-grade polysaccharides.</a> Food Hydrocolloids. 25 (5), 1393-1398 (2011).</li><li>Kong, L., Ziegler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+molecular+entanglements+in+starch+fiber+formation+by+electrospinning.">Role of molecular entanglements in starch fiber formation by electrospinning.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2247-2253 (2012).</li><li>Kong, L., Ziegler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+aspects+in+fabricating+pullulan+fibers+by+electro-wet-spinning.">Rheological aspects in fabricating pullulan fibers by electro-wet-spinning.</a> Food Hydrocolloids. 38, 220-226 (2014).</li><li>Han, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fiber Spinning Rheology and Processing of Polymeric Materials: Volume 2: Polymer Processing. , 257-304 (2007).</li><li>Morris, E. R., Cutler, A. N., Ross-Murphy, S. B., Rees, D. A., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+shear+rate+dependence+of+viscosity+in+random+coil+polysaccharide+solutions.">Concentration and shear rate dependence of viscosity in random coil polysaccharide solutions.</a> Carbohydrate Polymers. 1 (1), 5-21 (1981).</li><li>Thompson, C. J., Chase, G. G., Yarin, A. L., Reneker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+parameters+on+nanofiber+diameter+determined+from+electrospinning+model.">Effects of parameters on nanofiber diameter determined from electrospinning model.</a> Polymer. 48 (23), 6913-6922 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם שום דבר לגלות.

Rheology הוא כלי חיוני כדי ללמוד את העיבוד של פולימרים, הכוללים סיבים ספינינג קונבנציונלי וelectrospinning 13. מהמחקרים יציבים גזירת rheological, קונפורמציה פולימר ויחסי הגומלין שלהם בממסים שונים ניתן לפתור (איורים 2 ו -3). בריכוזים לא גבוהים מספיק למולקולות biopo...

Electrospinning היא טכניקה שהוא מסוגל לייצר מיקרו הרציף לסיבים בקנה מידה ננו ממגוון רחב של חומרים. היא צברה עניין גובר אקדמי ותעשייתי 1. למרות שההתקנה והתרגול של electrospinning נראים פשוט, היכולת לחזות electrospinnability ולשלוט במאפייני סיבים עדיין מהווה אתגר. הסיבה נעוצה בעובדה שיש גורמים רבים המשפיעים על תהליך electrospinning 2 ותהליך, במיוחד בדרך נסעה בסיבים, הוא כאוטי 1. לעתים קרובות גישה &quot;לבשל ו-להיראות&quot; אמפירית משמשת לסינון חומרי electrospinnable פוטנציאליים. עם זאת, כדי להשיג שליטה טובה יותר על תהליך electrospinning ומאפייני סיבים כתוצאה, הבנתנו את המנגנונים ששולטים electrospinnability נדרש מלאה יותר. מספר חוקרים מצאו כי הסתבכות מולקולרית של פולימרים בסמי ספינינג היא Essentiaתנאי מוקדם לליטר electrospinning המוצלח 3 5. Rheology הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור מבנה ואינטראקציה מולקולריים בתפוצות פולימר. לדוגמא, מקי et al. חקר את קונפורמציה המולקולרית של יניארי ופולי מסועפים (isophthalate terephthalate שיתוף אתילן אתילן) קופולימרים בממס המכיל כלורופורם / terephthalate דימתיל (7/3, V / V), וקבע כי ריכוז הפולימר היה צריך להיות 2-2.5x ריכוז ההסתבכות לelectrospinning המוצלח 4. יש עניין מחודש כעת בסיבים מbiopolymers בגלל היתרונות שלהם בפריקות ביולוגיות, biocompatibility, וrenewability כלפי מול עמיתיהם סינטטיים. עם זאת, מתרגלים להתמודד עם אתגרים רבים הנובעים בדרך כלל מהמורכבות המבנית שלהם, הקושי בעיבוד תרמי ותכונות מכאניות נחותות. עמילן, נמצא ברקמות צמח, הוא אמוןגרם biopolymers השפע ולא יקר ביותר על פני כדור הארץ. סיבי עמילן טהורים מפוברקים באמצעות מנגנון אלקטרו הרטוב ספינינג תואר 6 לאחרונה. Pullulan הוא פוליסכריד ליניארי מיוצר extracellularly על ידי חיידקים מסוימים. ההתחלפות הקבועה של (1 → 4) ו( 1 → 6) הם האמינו אג&quot;ח glucosidic להיות אחראי על מספר מאפיינים ייחודיים של pullulan, כוללים סיבים מצוינים / סרט להרכיב 7,8 היכולת. Electrospinning של סיבי pullulan מפיזור מימיים כבר דווח על ידי מספר החוקרים 9,10. בפרסומים הקודמים שלנו, electrospinnability של שני biopolymers, עמילן 11 וpullulan 12, כבר דן. דו&quot;ח זה מתמקד בהוכחת הפרוטוקול לניצול עקרונות rheological בחקירה של electrospinnability של שני biopolymers אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:253px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelose 80 starch</td>
			<td style="width:253px;">Ingredion</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used as it is</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pullulan</td>
			<td style="width:253px;">Hayashibara Co. Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used as it is</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:253px;">BDH Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">BDH1115-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:253px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">89125-172</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:253px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rheometer</td>
			<td style="width:253px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:119px;">ARES&#160;</td>
			<td>50 mm cone and plate geometry</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe (10 mL)</td>
			<td style="width:253px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td>Syringe with Luer-Lok&#174; Tip</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">High voltage generator</td>
			<td style="width:253px;">Gamma High Voltage Research, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">ES40P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:253px;">Hamilton Company</td>
			<td style="width:119px;">81620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Environmental scanning electron microscope</td>
			<td style="width:253px;">FEI Company</td>
			<td style="width:119px;">Quanta 200</td>
			<td>for starch fibers</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Environmental scanning electron microscope</td>
			<td style="width:253px;">Phenom-World</td>
			<td style="width:119px;">Phenom G2 Pro</td>
			<td>for pullulan fibers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular entanglement and electrospinnability of biopolymers

Electrospinning היא טכניקה מרתקת לפברק מיקרו לסיבים בקנה מידה ננו ממגוון רחב של חומרים. לbiopolymers, הסתבכות מולקולרית של הפולימרים המרכיבים בסמי ספינינג נמצאה תנאי הכרחי לelectrospinning המוצלח. Rheology הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את המבנה ואינטראקציה המולקולריים של biopolymers. בדוח זה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול לניצול rheology להעריך electrospinnability של שני biopolymers, עמילן וpullulan, מsulfoxide דימתיל (DMSO) / תפוצות מים. סיבי עמילן וpullulan בנויים היטב בקטרים ​​ממוצע בsubmicron לטווח מיקרון התקבלו. Electrospinnability הוערך על ידי תצפית ויזואלית ומיקרוסקופית של הסיבים שנוצרו. באמצעות התאמת מאפייני rheological של תפוצות לelectrospinnability, אנו מראים כי קונפורמציה המולקולרית, הסתבכות מולקולרית, וצמיגות גזירה כל להשפיע נבחריםrospinning. Rheology הוא לא שימושי רק בבחירת מערכת ממס ואופטימיזציה של תהליך, אלא גם בהבנת מנגנון היווצרות סיבים ברמה מולקולרית.

עקומות זרימת תפוצות biopolymer כפונקציה של ריכוז biopolymer וריכוז DMSO בממס התקבלו. שתי דמויות נציג להראות זרימת העקומות של עמילן (איור 2 א) וpullulan (איור 2 ב) כפונקציה של ריכוזם בממס DMSO טהור. צמיגויות מסוימות היו זממו נגד ריכוז biopolymer (איור 3 א לעמילן ו...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers at JoVE.com

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning היא טכניקה מרתקת נהגה לפברק מיקרו לסיבים בקנה מידה ננו ממגוון רחב של חומרים. הסתבכות מולקולרית של הפולימרים המרכיבים בסמי ספינינג היא חיונית לelectrospinning המוצלח. אנו מציגים פרוטוקול לניצול rheology להעריך electrospinnability של שני biopolymers, עמילן וpullulan.

מולקולרי הסתבכות וElectrospinnability של Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

molecular-entanglement-and-electrospinnability-of-biopolymers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Views.  Pennsylvania State University.  Electrospinning היא טכניקה מרתקת נהגה לפברק מיקרו לסיבים בקנה מידה ננו ממגוון רחב של חומרים. הסתבכות מולקולרית של הפולימרים המרכיבים בסמי ספינינג היא חיונית לelectrospinning המוצלח. אנו מציגים פרוטוקול לניצול rheology להעריך electrospinnability של שני biopolymers, עמילן ?...

Video: Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

חלבון נמוך מולקולרית משקל העשרה על סרטים סיליקה mesoporous דק גילוי סמן ביולוגי

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Characteristics of Precipitation-formed Polyethylene Glycol Microgels Are Controlled by Molecular Weight of Reactants

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer several advantages over traditional microsphere fabrication techniques. Contrary to emulsion, suspension, and dispersion techniques, microgels formed by precipitation are of uniform shape and size, i.e.&#160;low polydispersity index, without the use of organic solvents or stabilizers. The mild conditions of the precipitation reaction, customizable properties of the microgels, and low viscosity for injections make them applicable for in vivo purposes. Unlike other fabrication techniques, microgel characteristics can be modified by changing the starting polymer molecular weight. Increasing the starting PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Further modifications are suggested such as encapsulating molecules during microgel crosslinking. Simple adaptations to the PEG microgel building blocks are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Increasing the PEG molecular weight increased microgel diameter and swelling ratio. Simple adaptations to the PEG microgel precipitation reaction are explored for future applications of microgels as drug delivery vehicles and tissue engineering scaffolds.

This work describes the formation of poly(ethylene glycol) (PEG) microgels via a photopolymerized precipitation reaction. Precipitation reactions offer ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant exogenous molecular probes into cells. This work reports a microfluidic electroporation platform capable of performing multiple molecule delivery to mammalian cells with precise and molecular-dependent parameter control. The system&#8217;s ability to isolate cells with uniform size distribution allows for less variation in electroporation efficiency per given electric field strength; hence enhanced sample viability. Moreover, its process visualization feature allows for observation of the fluorescent molecular uptake process in real-time, which permits prompt molecular delivery parameter adjustments in situ for efficiency enhancement. To show the vast capabilities of the reported platform, macromolecules with different sizes and electrical charges (e.g., Dextran with MW of 3,000 and 70,000 Da) were delivered to metastatic breast cancer cells with high delivery efficiencies (&#62;70%) for all tested molecules. The developed platform has proven its potential for use in the expansion of research fields where on-chip electroporation techniques can be beneficial.

A microfluidic vortex assisted electroporation platform was developed for sequential delivery of multiple molecules into identical cell populations with precise and independent dosage control. The system&#8217;s size based target cell purification step preceding electroporation aided to enhance molecular delivery efficiency and processed cell viability.

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.