Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.

הערה: פרוטוקול זה נבדק ואושר על ידי אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה. 1. הכנת פתרון קרבס השתנה ובדיקת הסמים Aliquots <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 6 L של פתרון קרבס שונה המכיל (מ&quot;מ): 117.9 NaCl, 4.7 KCl, 25 3 NaHCO, 1.3 Nah 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 2.5 CaCl 2, 11.1 D-גלוקוז, וטיראט 2 נתרן, אצטט נתרן 20 , 0.004 nifedipine (לחסום התכווצויות שרירים ספונטניות), ו0.003 indomethacin (לחסום סינתזה של פרוסטגלנדינים אנדוגני). השתמש בפתרוני קרבס קרים כקרח וחמים לנתיחה רקמה והקלטה חד-סיבים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסות כימיות כלשהו (למשל, IS, קפסאיצין, ATP) בaliquots בריכוזים רצויים. </li></ol> 2. Dissection של רקמות Colorectum העצבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי ולהרדים עכברי זכרים (6 - 20, 8 שבועות - 30 גרם) בתא CO 2 בקצב זרימה שמחליף 10-30% מתא הנפח לדקה עד עכברים להפסיק לנשום לחלוטין כפי שעולה מהיעדר התנועה בחזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר המתת חסד, exsanguinate על ידי חיתוך פתוח קאמרי בית החזה, ניקוב העלייה הימנית, וטבילת פגר העכבר בנפח מספיק (~ 500 מיליליטר) של קרבס קר כקרח (4 ° C) פתרון מבעבע עם carbogen (95% O 2 , 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את כל הקרביים אבל איברי מעי גס ואגן. Transect העכבר במחצית פני מגזר השדרה T12 מעט מעל הסרעפת ולהעביר את מחצית הזנב לחדר נתיחה המכיל קר כקרח, מבעבע פתרון קרבס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, להסיר את שלפוחית ​​השתן ואברי רבייה על ידי transecting בצמתים שלהם לשופכה, ולהסיר יורד / אב העורקים בבטן עד שמתפצל לעורקי הכסל משותפים. לשחרר את PN או LSN מsurroundinרקמות g ידי נתיחה בוטה ובצע את העצבים מחוץ לפסגת הכסל עד נקודת כניסת גחונה לL6 והעמודה S1 חוליות (לPN) או T13 ועמוד השדרה L1 (לLSN). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את תִצמוֹדֶת הערווה ותקינה ומפרקי מרחשתי עזבו, ולהסיר את עצם הכסל. חופשי בזהירות או PN או LSN מהשרירים ורקמות חיבור המצורפים מקרובים לcolorectum עד היכן העצב נכנס לעמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות בזהירות את עצם הכסל לחשוף colorectum דיסטלי. לנתח את colorectum הדיסטלי עם PN המצורף או LSN ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את colorectum עם העצב המחובר לתא האמבטיה של חדר הרקמה. הסר רקמת חיבור מופרזת על ידי נתיחה נוספת, ולפתוח את colorectum longitudinally לאורך הגבול נגד mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צד הרירי פונה כלפי מעלה, להצמיד את קצה mesenteric של colorectum הסמוך לתא ההקלטה לתוך בסיס סיליקון של chamber ולצרף את אורך antimesenteric של colorectum למגרפה של קרסים מחוברים למפעיל כוח (באיור 1 וצילם באיור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאריך את PN או LSN לתוך תא ההקלטה, אשר מחובר לתא האמבטיה על ידי חור עכבר ושער. בעדינות להניח את תא מטען העצב על מראה זכוכית קטן בתא ההקלטה, אשר מספק משטח הידרופילי לעצב לדבוק. Superfuse תא האמבטיה עם חמה (30-32 מעלות צלזיוס), מחומצן פתרון קרבס ולמלא את תא ההקלטה עם שמן מינרלים. </li></ol> הקלטת 3. Single-סיבים ולוקליזציה של שדה פתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף בזהירות בחזרה epineurium (נדן עצב) מPN או LSN תחת סטראו בהגדלה גבוהה (50 - 60x). באמצעות מלקחיים עדינים, להקניט את תא מטען העצב לתוך 5-8 צרורות עצבים של ~ עובי 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את התייחסות הפלטינה-אירידיוםהאלקטרודה במגע עם פתרון קרבס בתא הרקמה. רצף למקם את צרורות עצבים בודדות על האלקטרודה ההקלטה שנעשתה מאותו החומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במברשת צבע רכה לעורר נקודתי גישה מafferents המעי הגס על ידי בעדינות ליטף למעלה ולמטה על פני השטח המעי הגס. אתר את צרור העצבים (ים) שמעצבב את המעי הגס דרך AP זיהוי (פוטנציאל פעולה) הקלטות. הערה: PN וLSN גם מעצבבים את שלפוחית ​​השתן ואברי אגן אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג 30 טיפים מחט G לפצל עוד יותר את צרור עצבים לחוטי צרור נאה של ~ 10 מיקרומטר עובי ולמקם את נימה אישית על גבי האלקטרודה ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה קונצנטריים הטה העגולה בניצב למשטח הרירי לרגש חשמלי סופים מביא בעוצמת גירוי suprathreshold (10 גודל mA, 0.5 משך msec @ 0.3 הרץ), אשר מייצרת רדיוס ~ 2 מ&quot;מ של התפשטות נוכחית. הזז את האלקטרודה באופן שיטתי (~ 1.5 מ&quot;מ צעדים) לאורכו ורוחבו של colorectum השטוח למקם סופים פתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר סוף מביא מתרגש, להתאים את המיקום האלקטרודה כדי לאתר את האתר של ההפעלה (שדה פתוח, RF) שדורש עוצמת מינימום גירוי (סף גירוי). בטל סופים עם סף גירוי&gt; 3 mA 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מהירות ההולכה (CV) מ1) המרחק בין האלקטרודה מגרה בשדה פתוח (RF) ואתר ההקלטה ו -2) עיכוב ההולכה (למשל, איור 2) בין חפץ הגירוי ותחילתו של פוטנציאל הפעולה . קורות חיים (m / sec) = מרחק (מ&quot;מ) / עיכוב הולכה (אלפיות שני). </li></ol> 4. סיווג פונקציונלי של afferents המעי הגס Mechanosensitive <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איתור RF על ידי גירוי חשמלי, חלים שלושה הגירויים מכאניים הבאים כדי RF: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את גירוי החיטוט על ידי לחיצה על קצה calibramonofilament כמו-פריי טד פון ניילון (0.4 ו 1 כוח g) בניצב לכיוון RF על colorectum השטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את הגירוי מלטף בעדינות על ידי מלטף את רירית המעי הגס עם גדיל קנס חוט ניילון (10 כוח מ&quot;ג) כדי ליצור לחץ גזירת משטח קטן בRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את המתיחה היקפית באמצעות מפעיל כוח מבוקר מחשב, אשר מספק כוח מתיחת ramped (0-170 MN ב 5 MN / sec) בכיוון היקפי לאורך הקצה אנטי-mesenteric של colorectum באמצעות המגרפה של קרסים מתוארים בשלב 2.8 . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג afferents כserosal (להגיב רק כדי להקהות חיטוט), רירית (להגיב לרירית מלטפת ולהקהות חיטוט), שרירי (מגיב למתיחה היקפית ולהקהות חיטוט) שרירי / רירית (מגיב למתיחה היקפית, ליטוף הרירי ולהקהות חיטוט), או MIA (לא מגיב לכל אחת משלושת הגירויים מכאניים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לafferents mesenteric (רק בעצבוב LSN) שקשה להפעיל באופן סלקטיבי על ידי גירוי חשמלי, איתור קצוות פתוחים שלהם על ידי ליטוף מכאני / חיטוט של לפדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לafferents למתוח רגיש (-רירית שרירי שרירים ו), לקבוע את סף התגובה, אשר מוגדר ככוח המעורר את AP הראשון במתיחת ramped. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לafferents serosal, להקליט את התגובות שלהם לעולים רמות של punctate חיטוט של השדה פתוח מונע על ידי מפעיל הכוח מבוקר מחשב. </li></ol> 5. כימי יישום / אפנון של Endings פתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התגובה בסיסית לגירוי מכאני (כלומר, תגובה למתיחת ramped, punctate חיטוט, או ליטוף הרירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל הקצה התחתון של פיסת צינור (פליז או נירוסטה, 10 מ&quot;מ גבוה ו -4 x 4 מ&quot;מ מרובע או 2 4-5 מ&quot;מ קוטר) עם וזלין ולמקם אותו על פני השדה פתוח בcolorectum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרפתרון קרבס בתוך צינורות, ולחשוף את הסוף פתוח במשך 3 - 5 דקות ל -170 μl של התמיסה המכילה את הכימיקל (ים) להיבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התגובה של הביא במהלך יישום כימי (כמה afferents היא chemosensitive). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון הכימי וצינורות כדי לסיים את הפעולה של החומר הכימי. תוך 4 - 6 דקות, לבדוק את התגובה מביא לאותו גירוי מכאני כמו בתגובת תחילת המחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מחדש את הגירוי המכני שוב לאחר תקופה מספיקה של שטיפה-out (&gt; 15 דקות). </li></ol> 6. קוצים ההקלטה והאפליה AP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספרת האותות החשמליים שנרשמו מהאקסונים ב 20 קילוהרץ ולשמור את הנתונים למחשב. לפקח על האות על-ידי קו צג אודיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הקוצים AP off-line ולהפלות יחידות בודדות המבוססות על ניתוח מרכיבים עיקרי של צורות גל עלייה חדה פרט 25. הערה: שיא אחת צריך להכיל לא יותר השתי יחידות פעילים בקלות discriminable. </li></ol>

<ol>
	<li>Naliboff, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+two+distinct+perceptual+alterations+in+irritable+bowel+syndrome.">Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome.</a> Gut. 41, 505-512 (1997).</li><li>Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+visceral+and+cutaneous+hyperalgesia+by+local+rectal+anesthesia+in+irritable+bowel+syndrome+(IBS)+patients.">Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients.</a> Pain. 105, 223-230 (2003).</li><li>Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarectal+lidocaine+is+an+effective+treatment+for+abdominal+pain+associated+with+diarrhea-predominant+irritable+bowel+syndrome.">Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome.</a> Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).</li><li>Chey, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linaclotide+for+irritable+bowel+syndrome+with+constipation:+a+26-week,+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+trial+to+evaluate+efficacy+and+safety.">Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).</li><li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+12-week,+randomized,+controlled+trial+with+a+4-week+randomized+withdrawal+period+to+evaluate+the+efficacy+and+safety+of+linaclotide+in+irritable+bowel+syndrome+with+constipation.">A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).</li><li>Busby, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+properties,+metabolism,+and+disposition+of+linaclotide,+a+novel+therapeutic+peptide+approved+for+the+treatment+of+irritable+bowel+syndrome+with+constipation+and+chronic+idiopathic+constipation.">Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).</li><li>Mei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+chemosensitivity.">Intestinal chemosensitivity.</a> Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).</li><li>Mei, N., Lucchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+data+and+ideas+on+digestive+sensitivity.">Current data and ideas on digestive sensitivity.</a> J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).</li><li>Su, X., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat+are+polymodal+in+character.">Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character.</a> J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).</li><li>McMahon, S. B., Morrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+neurones+with+long+projections+activated+from+the+abdominal+viscera+of+the+cat.">Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat.</a> J Physiol. 322, 1-20 (1982).</li><li>Cervero, F., Sann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+evoked+responses+of+afferent+fibres+innervating+the+guinea-pig's+ureter:+an+in+vitro+study.">Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study.</a> J Physiol. 412, 245-266 (1989).</li><li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+properties+of+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+urinary+bladder+of+the+rat.">Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat.</a> J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).</li><li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat.">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).</li><li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+unmyelinated+afferent+fibres+by+mechanical+stimuli+and+inflammation+of+the+urinary+bladder+in+the+cat.">Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat.</a> J Physiol. 425, 545-562 (1990).</li><li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+unmyelinated+chemosensitive+nociceptor+in+the+acutely+inflamed+urinary+bladder.">A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder.</a> Agents Actions. 25, 219-221 (1988).</li><li>Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice.">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).</li><li>Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+insensitive+afferents+(MIAs)+in+cutaneous+nerves+of+monkey.">Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey.</a> Brain Res. 561, 252-261 (1991).</li><li>Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unresponsive+afferent+nerve+fibres+in+the+sural+nerve+of+the+rat.">Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat.</a> J Physiol. 435, 229-242 (1991).</li><li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum.">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).</li><li>Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irritable+bowel+syndrome:+methods,+mechanisms,+and+pathophysiology.+Neural+and+neuro-immune+mechanisms+of+visceral+hypersensitivity+in+irritable+bowel+syndrome.">Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+sensitization+of+mechanosensitive+and+-insensitive+afferents+in+mice+with+persistent+colorectal+hypersensitivity.">Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+colorectal+afferent+function+associated+with+TNBS-induced+visceral+hypersensitivity+in+mice.">Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).</li><li>Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+stretch-sensitive+pelvic+nerve+afferents+innervating+mouse+distal+colon+and+rectum.">Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents.">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).</li><li>Jolliffe, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principal component analysis. , (2002).</li><li>La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+hypertonicity+and+acidity+modulate+colorectal+afferents+and+induce+persistent+visceral+hypersensitivity.">Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).</li><li>Christianson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=plasticity+and+modulation+of+visceral+afferents.">plasticity and modulation of visceral afferents.</a> Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).</li><li>Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+genetic+and+pharmacological+inhibition+of+TRPV1+and+P2X3+attenuates+colorectal+hypersensitivity+and+afferent+sensitization.">Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).</li><li>Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystitis+increases+colorectal+afferent+sensitivity+in+the+mouse.">Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).</li><li>Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+P2X+receptor+contributions+to+colon+mechanosensitivity+and+hypersensitivity+in+the+mouse.">Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse.</a> Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).</li><li>Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+visceral+hypersensitivity+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+family+receptor+&#945;-3+in+colorectal+afferents.">Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor &#945;-3 in colorectal afferents.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בהכנת colorectum העצבים מבחנה המתוארת כאן הוכיחה להיות גישה רבת עוצמה כדי לחקור פונקציות קידוד עצביות של מעי גס afferents בודדת, אשר יפה משלימה גישות אחרות שאינם פונקציונליות (למשל מחקרים, סלולריים, מולקולריים, והיסטולוגית) על עצב סנסורי קרביים ( ראה סקירה 27</s...

כאב ורגישות יתר הם התלונות העיקריות של חולים הסובלות מהפרעות תפקודיות במערכת העיכול, כוללים תסמונת מעי רגיז (IBS), אשר קיימים בהעדר הסיבה הנראית לעין pathobiological או נזק לרקמות. לדוגמא, חולי IBS להפגין רגישות יתר, כולל תגובות מוגברות להתנפחות בלון רקטלית ורגישות מוגברת במהלך פעולת מעיים רגילה, כמו גם רגישות יתר של הפניה גופנית (כלומר, רגישות למישוש באזור הבטן) 1. בגלל מיקוד afferents מעי גס הוכיח להיות יעיל בהקלת כאב ורגישות יתר בחולי IBS (למשל, החדרה תוך-רקטלי בהרדמה מקומית 2,3; בליעה דרך הפה של linaclotide guanylate cyclase-C אגוניסט 4-6) הבנה, שיפור של עצבוב מביא של colorectum חשוב. afferents הקרביים, כולל afferents מעי גס, הם מסוגלים להגיב לשיטות כימיות / nutrient- ותרמית (למשל, 7-9). עם זאת, afferents הקרביים להגיב לגירויים מכאניים (כלומר, afferents mechanosensitive) הייתה נחקר ביותר ביסודיות כי גירויים מכאניים (למשל, התנפחות luminal, מתיחה) הם אלה שבדרך כלל להצמיח תחושות מודעים, כוללים אי נוחות וכאב 10-16. בנוסף, את הקרביים גם innervated ידי afferents מכאנית רגישה (נעדרים), בדרך כלל מכונים nociceptors שקט או שינה 17. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, נעדרים אינם מגיבים לגירוי מכאני או שיש לי גבוהה מאוד תגובת ספי 18, אבל יכולים להיות פעיל ולרכוש mechanosensitivity בתנאי pathophysiological ולתרום לרגישות יתר. שימוש בהכנה במבחנה והפרוטוקול המתוארת כאן, שפיתחנו ומועסקים אסטרטגית גירוי חשמלית לים<html> rch לסופים פתוחים, המאפשרים זיהוי משוחד של שני קצות mechanosensitive וMIA בcolorectum 19. עצבוב המעי הגס נובע מsplanchnic המותני (LSN) ומסלולי עצבים אגן (PN), וכולל afferents מעי גס שיכול להיות מסווגת לחמש כיתות mechanosensitive (serosal, ריריים, שרירים, שרירי-רירית, mesenteric) ואחד בכיתה MIA 20. שימוש בתכשיר זה במבחנה, מצאנו כי mechanosensitivity רכש נעדרי מעי גס (רגישות) בעקבות חשיפה קצרה של השדות פתוחים שלהם למרק דלקתי (IS), אשר רגיש 71% מנעדרים במסלול PN ו -23% מנעדרים במסלול LSN 19. אנחנו גם תיעדנו רגישות לטווח ארוך (עד 28 יום) של נעדרים בהקשר של רגישות יתר לטווח ארוך התנהגות קרביים (כלומר, בעכברים שקבלו טיפולי intracolonic עם zymosan 21 או חומצת 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; בין afferents mechanosensitive, afferents שרירים ושרירים-הרירית הם השיעורים היחידים שtonically לקודד מתיחה היקפית של colorectum (כלומר, הם מתיחה רגישה) וsubserve הקידוד של התנפחות מעי גס רעיל 23,24. שימוש במחשב שבשליטה כוח מפעיל, אנחנו מוחלים סטנדרטיים ואחידים, ולמתוח ramped לשחזור בכיוון ההיקפי של רקמת המעי הגס השטוחה ומסווגים נוסף afferents למתוח רגיש כנמוך סף וגבוה סף 23. בנוסף, במהלך הרגישות של הזמן למתוח afferents -sensitive לאחר zymosan intracolonic 21 או 22 TNBS טיפול מתאים לתחילה, ההתמדה, ו / או ההתאוששות של רגישות יתר קרביים התנהגות, המצביעה על תפקידו של מעי גס afferents למתוח רגיש בכאב ורגישות יתר קרביים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1173">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:291px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:372px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica MZ16 stereo microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica IC D camera</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Amplifier</td>
			<td>World Precision instruments, Inc.</td>
			<td>SYS-DAM80&#160;</td>
			<td>Low-noise differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Two-compartment tissue chamber</td>
			<td style="width:291px;">Custom made</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Power1401</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited</td>
			<td style="width:137px;">Power1401</td>
			<td>Data acquisition, analog signal input/out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Spike2 v5.02</td>
			<td>Cambridge Electronic Design Limited</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Software package that works with the Power1401</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Audio monitor</td>
			<td>Natus</td>
			<td style="width:137px;">Am 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Square pulse stimulator</td>
			<td>Natus</td>
			<td style="width:137px;">S48</td>
			<td>To deliver electrical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Photoelectric isolation unit</td>
			<td>Natus</td>
			<td style="width:137px;">PSIU6</td>
			<td>Stimulus isolation to reduce noise</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Concentric bipolar microelectrode</td>
			<td style="width:291px;">FHC Inc.</td>
			<td style="width:137px;">CBFFG75</td>
			<td>To deliver electrical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual-mode lever system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc.</td>
			<td style="width:137px;">Series 300C&#160;</td>
			<td>To deliver mechanical stimuli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>forceps with fine tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro functional characterization of mouse colorectal afferent endings

וידאו זה מדגים בפירוט פרוטוקול במבחנה חד-סיבי אלקטרו הקלטה באמצעות הכנת colorectum עצבים עכבר. הגישה מאפשרת זיהוי משוחד ואפיון פונקציונלי של afferents מעי גס בודדת. הקלטות תאית של פוטנציאלים מופצים פעולה (APS) שמקורם אחד או כמה מביא (כלומר, חד-סיבים) שדות פתוחים (RFS) בcolorectum עשויים מסיבי עצב fascicles הקניט. Colorectum מוסר גם עם האגן (PN) או עצב splanchnic המותני (LSN) מצורף ופתח longitudinally. הרקמה ממוקמת בחדר הקלטה, הצמיד את שטוח וperfused עם פתרון קרבס מחומצן. גירוי חשמלי מוקד משמש כדי לאתר את קצוות מביא המעי הגס, אשר נבדקו על ידי שלושה נוספות גירויים מכאניים שונים (להקהות חיטוט, ליטוף הרירי ומתיחה היקפית) לסווג תפקודי afferents לחמש mechanosensiשיעורים מופרזים. סופים מגיבים לאף אחד מגירויים מכאניים אלה מסווגים כafferents מכאנית שאינו רגישה ל( נעדרים). שני mechanosensitive והנעדרים ניתן להעריך ולרגישות (כלומר תגובה משופרת סף,, מופחת, ו / או רכישה של mechanosensitivity) על ידי חשיפה מקומית של RFS לכימיקלים (למשל, מרק דלקתי (IS), קפסאיצין, אדנוזין טריפוספט (ATP)). אנו מתארים את הציוד והכנת הקלטת colorectum עצבים, קציר של colorectum עם PN המצורף או LSN, זיהוי של RFS בcolorectum, ההקלטה חד-סיבים מfascicles העצב, ויישום מקומי של כימיקלים לRF. בנוסף, אתגרים של ההכנה והיישום של גירוי מכאני סטנדרטי גם דנו.

ההתקנה מתוארת באיור 1. הוא כולל תא רקמת מחוייט כי בתי colorectum בתא מרחץ מצופה סיליקון והעצב המצורף בתא מלא שמן מינרלים רציפים. התא דו-התא היה במכונה מגוש מוצק של פלסטיק אקרילי על ידי מכונת CNC; החלק התחתון של שני התאים היה מצופה לאחר מכן עם סיליקון המוצק כדי לאפשר ס...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings at JoVE.com

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

באפיון פונקציונלי מבחנה של עכבר המעי הגס מביא Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

9.5K Views.  University of Pittsburgh. This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation. 

Video: In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

השימוש בפיברובלסטים אנושיים ראשוניים לניטור פנוטיפים מיטוכונדריאלי בתחום מחלת פרקינסון

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable noninvasive method is essential to assess real-time cardiac morphological and functional changes in animal models of heart disease. Transthoracic echocardiography represents an important tool for noninvasive assessment of cardiac structure and function2. Here we used a high-resolution ultrasound imaging system to monitor myocardial remodeling and heart failure progression over time in a mouse model of TAC. B-mode, M-mode, and Doppler imaging were used to precisely assess cardiac hypertrophy, ventricular dilatation, and functional deterioration in mice following TAC. Color and pulse wave (PW) Doppler imaging was used to noninvasively measure pressure gradient across the aortic constriction created by TAC and to assess transmitral blood flow in mice. Thus transthoracic echocardiographic imaging provides comprehensive noninvasive measurements of cardiac dimensions and function in mouse models of heart disease.

The goal of this protocol is to noninvasively assess cardiac structural and functional changes in a mouse model of heart disease created by transverse aortic constriction, using B- and M-mode echocardiography and color/pulse wave Doppler imaging.

שינויים הערכה לב מורפולוגי תפקודי עכבר דגם של מועקה הרוחבית אב עורקים על ידי הדמית אקו

Transverse aortic constriction (TAC) in mice has been used as a valuable model to study mechanisms of cardiac hypertrophy and heart failure1. A reliable ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Occlusion of the Great and Small Saphenous Vein Using Copolymeric Glue Based on N-Butyl Cyanoacrylate and Methacryloxy Sulfolane

We present the preliminary results of a longitudinal observational study aimed at evaluating the effectiveness and safety at different short- and long-term follow-ups of vascular occlusion of the great saphenous vein (GSV) and small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an innovative modified cyanoacrylate surgical glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS). Ninety patients, prospectively recruited for 1 year, underwent the study with EcoColor-Doppler (ECD) to evaluate the maximum diameters of the GSV and SSV in the orthostatic position and the reflux time (RT). An RT greater than 0.5 s was considered pathologic. Clinical, etiology, anatomy, and pathophysiology (CEAP) assessment was used for the complete evaluation of each patient in the study. All the patients were treated by NBCA+MS glue to obtain vein occlusion and observed before treatment (baseline; T0), within 6 h after treatment (T1), 1 month after treatment (T2), 3 months after treatment (T3), 6 months after treatment (T4), and 1 year after treatment (T5). Chi-square (&#967;) analysis was performed to evaluate the effectiveness and safety of the treatment. All the patients participated in the entire duration of the study. Complete occlusion was maintained in 100% of patients at T1, 98.9% at T2 and T3, and 97.8% at T4 and T5 (p &lt; 0.001). None of the patients suffered from post-surgical thrombosis. No blue hyperpigmentation, or paresthesia was observed during the entire observation period. Immediately after treatment, 7.7% of patients needed painkillers; 1 week after treatment, 100% of patients returned to normal life. Vascular occlusion of the great or small saphenous vein using NBCA+MS glue is a safe procedure with persistent benefits after a 1 year follow-up. This procedure can be performed with local anesthesia, allowing a quick return to normal life. Thanks to its low invasiveness, the treatment is not painful.

Here, we present a protocol to treat the great saphenous vein (GSV) and the small saphenous vein (SSV) affected by severe pathological reflux, using an original sclerosing and embolizing cyanoacrylate-based glue composed of N-butyl cyanoacrylate and methacryloxy sulfolane (NBCA+MS).