עבודה זו נתמכה על ידי פרס CIRM הקדומה II Translational מחקר TR2-01821, NIH / NIDCR (מענקים R21 DE0177711 ו RO1 DE01607), UC דיסקברי גרנט 07-10677, AWJ ו RKS יש T32 מלגות להכשרת פרסים (5T32DE007296-14), JNZ יש אחווה אימון CIRM (TG2-01169).

1. גזע Perivascular תא בידוד זה מתואר בפרטים על &quot;טיהור גזע תאים Perivascular של רקמה אנושית השומן הלבן&quot; סמוך המאמר, על ידי מ Corselli et al. 2. פיגום הבריאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומים הם מחוייט לפי הפרוטוקול שפורסם קודם לכן פולי (לקטית, חומצה גליקולית שותף) (PLGA, Burmingham פולימר) עם ציפוי hydroxyapatite 4-6. אפטיט מצופים פיגומים PLGA מיוצרים מ 85/15 PLGA ידי יציקת ממס תהליך שטיפת חלקיקים. פיגומים נוצרים בצורה כדורית (2 מ&quot;מ קוטר) להשתלה שריר כיס, צורה discoid (4 מ&quot;מ קוטר) להשתלה calvarial, או גלילית (4 מ&quot;מ קוטר, 6 מ&quot;מ אורך) על פגמים המגזרי הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, PLGA / כלורופורם פתרונות מעורבב עם סוכרוז (פולימר / יחס סוכרוז 5/95, W / W) נוצקו לתוך התבנית 200-300 מיקרומטר, טפלון בקוטר ליצור את מחוייט חסרונותtruct. לאחר ההקפאה ייבוש לילה, פיגומים יוסרו עובש טפלון שקוע DDH 2 O לפרק סוכרוז. פיגומים הם לחטא על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 דקות, ואחריה שלוש שטיפות של DDH 2 א &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציפוי אפטיט, פתרון מדומה נוזל (SBF) הגוף שהוכן על ידי המסת ברצף CaCl 2, MgCl2 • 6 שעות 2 O, NaHCO 3, ו-K 2 HPO 4 • 3H 2 O ב DDH 2 א &#39; פתרון ה-pH יורדת ל 6 על ידי הוספת חומצת מלח 1M להגדיל את מסיסות. Na 2 SO 4, KCl ו NaCl מתווספים ו pH הסופי מותאם 6.5 (SBF 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mg2 + ו HCO 3 - חינם SBF (SBF 2) מכינים על ידי הוספת CaCl 2 ו - K 2 HPO 4 • 3H 2 O ב DDH 2 O ו-pH יורדת ל 6. KCl ו NaCl מתווספים ו pH הסופי מותאם 6.8. פתרונות כרגע סטרילי הסתנן membr 0.22 מיקרומטר PESane (Nalgene). בסמוך לפני תהליך הציפוי, פיגומים את מיובשים PLGA כפופים הפרשות זוהר ארגון פלזמה תחריט (Harrick מדעי) כדי לשפר את הרטבת ואחידות ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומים חרוט מודגרת מכן עבור 12 שעות ב SBF 1 ושינה את Mg2 + ו HCO 3 - 2 SBF חינם עבור 12 שעות נוספת ב 37 מעלות צלזיוס מתחת ערבוב עדין. פיגומים מצופה נשטפים עם DDH 2 O להסיר עודפי יונים ו lyophilized לקראת מחקרים נוספים. </li></ol> 3. פאוץ שריר דגם השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl של השעיה PSC ב PBS (פוספט שנאגרו מלוחים) מושמטים בעדינות על גבי השתל PLGA מבוסס כדורי מיד לפני ההשתלה. התאים כבר מראש על ידי הכנסת שכותרתו lentiviral של גחלילית בלוציפראז, כדי לאפשר מעקב על השתלת vivo הודעה. צפיפות התאים הוא 2.5 x 10 -5 השתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCID (חמור immunodeficient משולב) עכברים משמשים לאחר 6 שבועות של גיל. בעלי חיים הם anesthetized משאיפת isoflurane ו premedicated עם עצירות (בדפורד Labs). לאחר הכנת בבטאדין רגיל, חתכים הבילטרלי hindlimbs נעשות (האורך ו 2 מ&quot;מ אורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסים נחתכים בשרירים femoris שרירי במקביל על ידי דיסקציה קהה לציר סיבי שריר ארוך. עבור כל עכבר, שתל PLGA מבוסס עם PSCs מוכנס, ו fascia שמעל השריר לצורך איחוי עם Vicryl 5-0 (Ethicon). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העור נסגר הבא עם 5-0 Vicryl בדפוס subcuticular. בעלי החיים מטופלים לאחר הניתוח למשך 48 שעות ו tmp / SMX (Trimethoprim / sulfamethoxazole, קווליטסט) עם עצירות במשך 10 ימים. </li></ol> 4. פגם Calvarial דגם השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה isoflurane של עכברים SCID (12-14 שבועות), השיער נחתך העור וחיטוי בבטאדין לכל פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החתך 8 מ&quot;מ העור נעשה לאורך תפר באמצע sagittal calvarium של העכבר. לאחר מכן, calvArial periosteum מוסר בעדינות על ידי יישום Q-עצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, באמצעות יהלום מצופים פיסות מקדחה בתרגיל במהירות גבוהה שיניים, 4 מ&quot;מ עצם פגם הקודקודית נוצר. הפגם הוא בעובי מלא - אך הטיפול הוא נלקח לא לפגוע מאטר הבסיסית דורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחוייט PLGA מבוסס השתל עם PSCs engrafted ממוקם מכן בעדינות באתר פגם. צפיפות התאים הוא 2.5 x 10 -5 השתל. בסופו של דבר, העור מאוחה על ידי תפירה עם Vicryl 6-0. בעלי החיים מטופלים לאחר הניתוח למשך 48 שעות ו TMP / SMX במשך 10 ימים עם עצירות. </li></ol> 5. דגם עצם הירך המגזרי פגם השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות Athymic (12-14 שבועות) מורדמים תחת שאיפת isoflurane. עצם הירך הוא מצוחצח ומוכן לכל פרוטוקול סטנדרטי בבטאדין (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החתך 27-30 מ&quot;מ אורך נעשה על היבט anterolateral של עצם הירך. פיר הירך נחשף אז על ידי הפרדת לאט vastuseralis ואת שרירי femoris השרירים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת למקסם את העקביות של התחדשות העצם, periosteum המכסה את הפגם הירך נמחק לחלוטין עם קטע resected הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת פוליאתילן (אורך, 23 מ&quot;מ, רוחב, 4 מ&quot;מ, גובה 4 מ&quot;מ) ממוקמת על משטח anterolateral של עצם הירך. הצלחת מכילה שישה חורים שנקדחו מראש כדי להתאים בקוטר 0.9 מ&quot;מ חוטים הליכי קירשנר (צימר). אם ניקח צלחת כתבנית, שישה חוטים הליכי קירשנר הם קדחו דרך צלחת ושני קליפת המוח (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, עם להב מסור קטן נדנוד (סטרייקר, MI), 6 מ&quot;מ באמצע diaphyseal הפגם נוצר. פגמים המגזרי מטופלים מכן על ידי החדרה של שתלים PLGA מבוססי אשר היו עמוסות תאים לפי פרוטוקול (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרירים שמעליה ו fascia סגורות עם 4-0 התפרים נספגים Vicryl להבטיח את השתל במקום, ואת העור איחוי. </li&gt; </ol> 6. בהערכות ב vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכות רדיוגרפי מבוצעות באופן אורך על ידי שני XR ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה μCT (מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת) ניתוח. לניתוח μCT (Skyscan 1172F), תמונות נסרקים ברזולוציה של 19.73 מיקרומטר (100 kV ו 100 mA מקור קרינה, באמצעות 0.5 מ&quot;מ אלומיניום מסנן). התמונות מנותחות באמצעות DataViewer, Recon, CTAn, ותוכנות CTVol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה ביולומינציה נעשית גם באופן סדרתי על מנת להעריך engraftment התא, כדאיות, שגשוג לכלול הגירה מחוץ לאתר את השתל. הדמיה ביולומינציה מתבצע באמצעות לומינה IVIS המכשיר השני (Caliper מדעי החיים). יציאות קלות הם לכמת באמצעות תוכנה תמונה חיים (Xenogen). תפוקת האור סך הכל נרשם פוטונים / שנייה / מ&quot;ר ס&quot;מ / steradian. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח היסטולוגית ו histomorphometric מבוצעת הנתיחה שלאחר המוות. כתמים שגרתיות המועסקים כוללים trichrome מאסון של, אנילין כחול, עמ &#39;entachrome, ו Picrosirius אדום. ניתוח Histomorphometric מתבצע בקלות גם עם כחול אנילין או כתמים pentachrome, בו דמוי עצם נראה כחול כהה וצהוב, בהתאמה. פיקסלים לכל השדה מופעל גבוהה מחושבים באמצעות הכלי מטה קסמים ב-Adobe Photoshop. </li></ol> 7. נציג תוצאות כמו גם את הפגמים calvarial ו הירך הם קריטיים בגודל, ריפוי לא משמעותי יש לצפות ללא טיפול עם גורמי גדילה או בתאי גזע חיצוניים. מבחינת תמרונים כירורגיים, דיסקציה כיס שרירים צריכים להיות יחד מטוסים fascial ולכן הדימום מינימלית יש נתקלו. אף על פי מודל כיס השריר מתבצע באופן בילטרלי, העכבר צריך ללכת בקלות ביום לאחר הניתוח 1. לפגם calvarial, הדימום הוא נתקל אך ניתן ספוגה Q-עצה. במשנה זהירות יש לנקוט לא לפגוע מאטר הבסיסית דורה - כמו זה יפריעעם ריפוי תקין. עבור דגם FSD, טיפול נלקח לא לפגוע בכלי הדם הגדולים, כדי לא לגרום לדימום יתר או עצב הירך כדי למנוע נזק נוירולוגי. חוטי קירשנר הם קדחו עם לחץ עדין כדי לא לפגוע בעצמות קליפת המוח בתהליך. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" /> באיור 1. הכנה לפני הניתוח לפגם המגזרי עצם הירך (FSD) בחולדות Athymic. חולדות זכרים (12-14 שבועות) מורדמים תחת שאיפת isoflurane. עצם הירך הוא מצוחצח הכינו לפי הפרוטוקול הסטנדרטי בבטאדין. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" /> איור 2. חשיפה כירורגית של עצם הירך הבריאה המגזרי פגם (FSD). החתך 27-30 מ&quot;מ אורך נעשה על היבט anterolateral של עצם הירך. בצד הלטרלי של הירך הפיר חשוף לאחר מכן על ידי הפרדת lateralis vastusוזרועותיו femoris השרירים. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" /> איור 3. קיבוע של עצם הירך הבריאה המגזרי פגם (FSD). הצלחת פוליאתילן (אורך, 23 מ&quot;מ, רוחב, 4 מ&quot;מ, גובה 4 מ&quot;מ) ממוקמת על משטח anterolateral של עצם הירך. הצלחת מכילה שישה חורים שנקדחו מראש כדי להתאים בקוטר 0.9 מ&quot;מ חוטים הליכי קירשנר. אם ניקח צלחת כתבנית, שישה חוטים הליכי קירשנר הם קדחו דרך צלחת ושני קליפת המוח. לאחר מכן, 6 מ&quot;מ פגם באמצע diaphyseal נוצר. כאשר זה מתבצע, מחוייט הפיגום מוחדר ישירות מה בדיוק מתאים לאתר פגם (לא מוצג). <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" /> באיור 4. דוגמה של פגם Calvarial לאחר הניתוח. 4, מ&quot;מ פגם calvarial מעגלית נוצר בעצם הקודקודית הימנית בעכברים athymic. הדמיה כאן הוא אתר פגם מושתל עםPSCs אחרי 8 שבועות לאחר הניתוח. הערה נוכחותו של עצם חדשה בתוך אתר פגם.

<ol>
	<li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li><li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs:+regenerative+units,+cytokine+sources+or+both.">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li><li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells.">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li><li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model.">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , (2010).</li><li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li><li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds.">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li><li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation.">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li><li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts.">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li><li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration.">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li><li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication:+role+of+canonical+Wnt+signaling.">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li><li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li></ol>

KT, BP, ו - CS הם ממציאי perivascular תא הקשורות פטנטים שהוגשו גזע מאוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג&#39;לס. בני הזוג. KT, ו CS הם מייסדי Scarless מעבדות בע&quot;מ, אשר sublicenses perivascular תא הקשורות פטנטים גזע העוצרים UC. ד&quot;ר סו Chia גם קצין Scarless Laboratories, Inc

הבידוד של PSCs מתוארת היטב 1-3 במקומות אחרים, לרבות פרסום יופיטר הגיש בנפרד באופן ספציפי לטיפול פרוטוקולים PSC בידוד ושיטות. התכלית הספציפית של מאמר זה היא לתאר ולהדגים 3 פרוטוקולים PSC ביישום vivo על עצם היווצרות / התחדשות. נרתיק SCID שרירים העכבר הוא מודל המתואר בדרך כלל להיווצרות חוץ רחמי עצמות אדם 7. קיימים הבדלים חשובים בין (פגם) מודלים מחוץ לרחם ו orthotopic של העצם, כולל אינטראקציה עם עצם paracrine יוצרי תאים מארחים 8, כמו גם שפע של osteogenic גורמים איתות הנמצאים microenvironment פגם השלד. שני פגמים מוצגים כאן, defect8 calvarial פגם סגמנטלי הירך 4. שניהם מתועד היטב להיות קריטי בגודל (כלומר, לא ירפא לבד). הבדלים מעניינים קיימים בין פגמים calvarial ו הירך. ראשית,תאים: תא אינטראקציה בין PSCs xenografted ותאי אנדוגניים שונה מאוד. במונחים של פגם calvarial, PSCs אינטראקציה עם דורה מאטר הבסיס (השכבה החיצונית ביותר של קרומי המוח את), כמו גם אלה osteoblasts ותאי periosteal circumscribing באתר פגם. חשוב לציין, את האינטראקציה בין התאים המושתלים לבין osteoblasts סביב 8, או תאים מושתלים ודורא הבסיסית (לוי et al., In press) הן קריטיות עבור בתאי גזע נורמליים בתיווך osteogenesis כדי להמשיך. במונחים של פגם סגמנטלי הירך (FSD), PSCs xenografted נחשפים התא שונה מאוד לסביבה ציטוקינים. לדוגמה, אתר FSD מורכב של תאים במח וליווי גזע mesenchymal, כמו גם endosteum, periosteum ו ארוכת עצם osteoblasts. לכאורה, בכל תא יש תגובה משלו על פשע, וכל אחד יכול להיות נייד: אינטראקציות עם התא xenografts PSC. הבדלים ברורים אחרים הקיימים בין calvarialופגמים הירך. עצמות calvarial בתחילה להקים את התאבנות intramembranous, תוך העצמות הארוכות ליצור דרך ביניים סחוס (התאבנות endochondral). יתר על כן, תהליך המתקן לאחר פגיעה גם מחקה את מקורות התפתחותיים. לאחר FSD, היווצרות יבלות הסחוס הוא ציין, והואיל ולא ביניים הסחוס נוצר תוך פגם עצם הקודקודית. לבסוף, את המקור העוברי של הגולגולת עשוי להיות שונה מזה של העצמות הארוכות. רוב הגולגולת (כולל תאים perivascular - pericytes - באזור כל הראש) נגזר לפסגה עצבית (mesectoderm), בעוד השלד appendicular היא גזרה והמזודרם הפרקסיאלית 9. כל ההבדלים הללו עלול לגרום הבדלים משמעותיים במונחים של תיקון PSC בתיווך העצם. השימוש PSCs יש מספר יתרונות על פני שומן שמקורם בתאי סטרומה מסורתיים (ASCs). PSCs אינם דורשים תרבות הם האוכלוסייה מטוהרים WHI התאפרק לא כולל תאים סטרומה אחרים שאינם משתתפים - והוא יכול גם לווסת באופן שלילי - בידול osteogenic, כגון לתאי אנדותל 10. לעומת זאת, למשל, ניתוחים משובט של ASCs מראים כי רק subpopulation מסוגלים לעבור התמיינות osteogenic במבחנה 11. בסופו של דבר, המאמצים רקמות השלד הנדסה צפויה לשלב בתאי גזע osteocompetent (כגון PSCs) עם גורמי גדילה אקסוגניים ו הפיגום osteoconductive (כגון HA-PLGA שימוש בשיטות הנוכחיות), כדי הטובה ביותר לרפא פגמים השלד.

use of human perivascular stem cells for bone regeneration

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) ניתן לבודד בכמות מספקת של רקמות רבות לצורך הנדסת רקמות השלד 1-3. PSCs הם אוכלוסייה FACS, מיון של &quot;pericytes&quot; (CD146 + CD34-CD45-) ו &#39;תאים adventitial &quot;(CD146-CD34 + CD45-), שכל אחד מהם דיווחנו בעבר יש מאפיינים של בתאי גזע mesenchymal. PSCs, כמו MSCs, יכולים לעבור התמיינות osteogenic, וכן להפריש בעד osteogenic 1,2 ציטוקינים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים את osteogenicity של PSCs במודלים של בעלי חיים שונים, כולל השתלת שריר כיס ב SCID (קשות) בשילוב immunodeficient עכברים, פגם העכבר SCID calvarial ו פגם סגמנטלי הירך (FSD) בחולדות athymic. שריר הירך מודל כיס שנועדה לבחון היווצרות העצם חוץ רחמי. פגמים Calvarial מרוכזים על העצם הקודקודית והם standardly 4 מ&quot;מ קוטר (בגודל אנוש) 8. FSDs הם bicortical והם התייצבו עםבר פוליאתילן ו-K-4 חוטים. FSD תיאר גם פגם לגודל קריטי, אשר אינו משמעותי לרפא על 4 משלו. לעומת זאת, אם בתאי גזע או גורמי גדילה נוספים לאתר את הפגם, התחדשות העצם משמעותי יכול להיות מוערך. המטרה הכללית של xenografting PSC היא להפגין את היכולת osteogenic מסוג זה תא מודלים התחדשות הן מחוץ לרחם ו orthotopic העצם.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration at JoVE.com

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות העצם<em&gt; In vivo</em&gt;.

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

use-of-human-perivascular-stem-cells-for-bone-regeneration

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

20.0K Views.  School of Dentistry, UCLA. אדם בתאי גזע perivascular (PSCs) הם גזע הרומן הסלולרי בכיתה לשחזור רקמות השלד דומה בתאי גזע mesenchymal (MSCs). PSCs יכול להיות מבודד על ידי FACS (תא הקרינה מיון פעיל) מרקמת השומן רכש במהלך הליכים סטנדרטיים שאיבת שומן, בשילוב מכן עם פיגום osteoinductive להשיג היווצרות העצם In vivo.

Video: Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates after injection into injured tissues as well as the observed massive cell death rates lead to very restricted therapeutic effects. To overcome these limitations, we sought to establish a non-viral based protocol for suitable cell engineering prior to their administration. The modification of human CD133+ expressing SCs using microRNA (miR) loaded magnetic polyplexes was addressed with respect to uptake efficiency and safety as well as the targeting potential of the cells. Relying on our protocol, we can achieve high miR uptake rates of 80&#8211;90% while the CD133+ stem cell properties remain unaffected. Moreover, these modified cells offer the option of magnetic targeting. We describe here a safe and highly efficient procedure for the modification of CD133+ SCs. We expect this approach to provide a standard technology for optimization of therapeutic stem cell effects and for monitoring of the administered cell product via magnetic resonance imaging (MRI).

This protocol illustrates a safe and efficient procedure to modify CD133+ hematopoietic stem cells. The presented non-viral, magnetic polyplex-based approach may provide a basis for the optimization of therapeutic stem cell effects as well as for monitoring the administered cell product via magnetic resonance imaging.

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

פרופיל תאימות ביולוגית על Biomaterials עבור התחדשות העצם

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

הקמת הגיאומטריה של האדם תא גזע עובריים המושבות על מצעים תואמי כדי לשלוט במכניקה ברמת רקמות

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...