מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה השבדית למחקר (90293501, A0290401, A0290402), השביעית תכנית המסגרת של הקהילה האירופית במסגרת הסכם מענק N ° 602,699 (Direkt), קרן NovoNordisk, Brunnberg קרן Gurli ואדוארד, גזע תרפיה, Vleugel קרן וÅke Wiberg קרן.

הערה: דם נשאב מאנשים בריאים על ידי venipuncture מערכת הפתוח באישור בועדת האתיקה הסקירה באופסלה (הרשאה מס &#39;2008/264). 1. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים אנושיים עיקריים וריד טבור אנדותל (HUVEC) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בצלוחיות T75 מצופים בג&#39;לטין 1% ב- pH 7.4 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מבקבוק T75 המכיל HUVEC (או סוג אחר של תאי האנדותל אנושיים ראשוניים) ולשטוף את התאים עם 2.1 mM EDTA בpH PBS 7.4. ניתוק תאים על ידי הוספת 1 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA ודוגר במשך 2 - 3 דקות ב -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי שטיפת הבקבוק עם FBS 9 מיליליטר 10% ב- pH 7.4 PBS ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 15 מיליליטר. ספין למטה התאים ב 735 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה בזהירות בכלי דם בינוני צמיחת תאי אנדותל (EC GMMV) ולספור את התאים בתא &quot;שודד גופות. זרעי 21,000 גאמות / 2 סנטימטר בשקופיות תרבית תאי 1 היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. HUVEC יהיה מחובר אחרי 1 - 2 ימים של התרבות. צג המורפולוגיה של תאי confluency יומי תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 2. הכנה של דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל המשטחים המלאכותיים שיהיו במגע עם דם בשכבה כפולה של הפרין המשותק (CHS) על פי הוראות היצרן. חומרים מצופים CHS המוגן מפני אבק יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד 6 חודשים ללא הפסד של פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש venipuncture מערכת הפתוח עד זוב דם מתורם בריא זמן קצר (&lt;30 דקות) לפני תחילת ניסוי תא אנדותל דם. זוג מחט מזרק (18 G x 50 מ&quot;מ) לצינורות CHS סיליקון המצופה (קוטר פנימי: 2 מ&quot;מ) לפני האיסוף בזהירות דם בצינור מיליליטר 50 CHS מצופה. דם מוסף עם הפרין unfractionated להגיע לריכוז סופי של 0.75 IU / ml. מערבבים את הדם בעדינות על ידי inverting הצינור 2 - 3 פעמים. </li></ol> דגם 3. דם האנדותל הלשכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק תאי דם (איור 1 א; מבט מלמעלה) בmethacrylate אקריליק polymethyl (PMMA) מורכב משני צילינדרים (גובה 8 מ&quot;מ ורדיוס 9 מ&quot;מ) שמודבקים לשקופית PMMA (25 x 75 מ&quot;מ). התאם את הקצוות של הגלילים כלפי מעלה עם טבעות אטימות מגומי כדי לאטום את חדר הדם נגד שקופיות זכוכית עם תאים בתרבית האנדותל (איור 1). סובב את תאי דם הקשורים לשקופית התרבות עם תאי האנדותל לאחר מכן במצב אנכי (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה CHS מצופה להעביר 1.5 מיליליטר דם לכל CHS המצופה בלטפל קאמרי שלא להפעיל את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דם 1 מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 30 μl 0.34 ח&quot;כ 3 EDTA להגיע ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ K EDTA 3 לקביעת ריכוזי חלבון פלזמה הראשונית באמצעותאנזים קשור assay immunosorbent (ELISA). לערבב בזהירות את הדם ולשמור על הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קירות הפלסטיק של שקופיות זכוכית תרבית תאים על פי הוראות יצרן ובזהירות לשטוף את התאים בpH PBS 7.4. הקפד להסיר לאחר מכן הרבה נוזלים ככל האפשר מהשקופיות. אל תתנו לתאים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על גבי תאי הדם, תאים מול הדם. אבטח את השקופיות על ידי הצבת מהדק סביב תא התא האנדותל דם. השתמש בשקופית פלסטיק לתמיכה נוספת כדי למנוע שבירה של שקופיות זכוכית תרבית תאים בעת ביצוע המהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את תא התא האנדותל דם על גלגל מסתובב (40 סנטימטרים קוטר) מקום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. סובב כל תא בגלגל ברמה של 0.5 XG למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לפרק את תא התא האנדותל דם. שטוף את שקופיות תרבית התאים בpH PBS 7.4 ולתקן את התאים בparaformaldehyde 1% קרים כקרח (PFA) ואו 10 דקות. העברת דם מיליליטר 1 מכל תא לmicrocentrifuge צינורות המכילים 30 μl 0.34 EDTA ח&quot;כ 3 כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mM EDTA K 3 ולערבב בעדינות את הצינורות. שמור את הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב4,560 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר את הפלזמה הדם לצינורות microcentrifuge חדשים וחנות ב-70 ° C עד לניתוח נוסף. </li></ol> 4. ניתוח של דם האנדותל אינטראקציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים immunofluorescent עם CD16 אנטי אנושי בעכבר ואחריו עז משניים אנטי העכבר Alexa 488 וphalloidin-TexasRed. בצע כל שלב צביעה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף את השקופיות בpH PBS 7.4 בין כל שלב ושלב. Counterstain הגרעינים עם DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. ניתוח מרכיבי דם קשור לתאי האנדותל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה כגון CellProfiler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantify התגובות בתא הדם עם תרומבין-באנטי-טרומבין (TAT) ELISA לפי הוראות יצרן של דגימות הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים סטטיסטיים מתאימים, לדוגמא., מבחן t מזווג, כדי לנתח את הנתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> אינטראקציות רבות בין הדם ודופן כלי דם הן בדרך כלל נשמרו במצב שקט בשל האופי הלא דביק ואנטי-טרומבוטיים של האנדותל. 7 במצבים פתולוגיים כוללים דלקת, האנדותל מופעל עם עלייה וכתוצאה מכך ביטוי הקולטן הידבקות 8 ו יכולת מופחתת לעכב עצירת דימום. 9 הפעלה של מערכות המפל בדם בתורו מגבירה את thrombogenicity של האנדותל גורמת גיוס פקקת וויקוציטים נוספים. 10 כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי גומלין עדינים בין תאי האנדותל וכל דם, שיש לנו פיתח רומן בשיטה חוץ גופית שבו תאי אנדותל בתרבית ממוקמים במגע עם דם כל. למיטב ידיעתנו, ההגדרה שלנו היא הראשון שהראתה תאי האנדותל מודגרות עם כל דם אנושי עם שום או נוגד קרישה מעט מאוד לתקופות זמן ארוכות יותר. NT &quot;&gt; הרגישות של מערכת זו מופעלת על ידי venipuncture מערכת הפתוח בשילוב עם שכבת המגן של הפרין משותק על כל המשטחים הונחו במגע עם דם. השימוש במערכת פתוחה ברכש דם מפחיתה את ההפעלה של מערכות המפל במהלך venipuncture תוך התרת השימוש בסכום שנקבע עצמי של נוגדי קרישה. ייתכן, עם זאת, לשמש צינורות דם פונו זמינים מסחרי בהתאם לנקודות הקצה המיועדים של המחקר. הריכוז הסופי של נוגד קרישה הוסיף לצינורות מערכת הסגורים ביותר הזמינים מסחרי עלולים לעכב רגיש , ואחרת קשה ללמוד, אינטראקציות בהתקנה. 6 משטח הפרין מגן נוסף מבטל הפעלה של דם דרך שטח מגע על ידי כל משטחים אחרים מאשר תאי האנדותל. 5 ואכן, דגירה של דם מלא בתוספת כמות קטנה של הפרין unfractionated ב חדר ללא ההגנה של CHS הביא להיווצרות קרישים. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; בועת האוויר בתוך החדר מאפשרת ערבוב של הדם במהלך דגירה עם תאי האנדותל. על מנת להעריך את ההשפעה של גודל בועת האוויר, השתמשנו בשני כרכי דם שונים. במודל זה, מדדנו רמות TAT דומות ללא קשר לגודל בועת אוויר בתאים הודגרו עם HUVEC. TAT היה, לעומת זאת, גדל עם גודל בועת האוויר קטן יותר ברגישות היתר לאלרגיה באופן מלא טופל תאים. זה, בהתאם למאפייני תא אנדותל שתוארו קודם לכן 11, מצביע על השפעה רגולציה על ההפעלה המוגברת של קרישה הניתנת על ידי תאי האנדותל שחסר בחדר CHS אינרטי. בועת האוויר במערכת יוצרת זרימה על מחזור של החדר. גודלה של הבועה ישפיע על הכוחות בתוך מערכת זו מסתובבת. זה מוצג על ידי התוצאות שלנו באיור 2 ד היו בועה קטנה יוצרת ערכי TAT גבוהים המייצגים כוח ירד על כלומר הדם, זרימת הדםבתוך התא הוא נמוך יותר ובכך שהפעיל מערכת המפל מתרחש למידה גבוהה יותר. יש לציין כי במערכת זו אנו יוצרים זרימה מסתובבת שתהיה שונים במהירות על פני החדר עם המהירות הגבוהה ביותר לאורך הקירות, והנמוך ביותר במרכז. זה כמובן לא סביבה אופטימלית בכל קשורה לזרימה ולחץ גזירה לתאי אנדותל, אבל עדיין יש לנו מערכת הפקת תוצאות יציבה ודיר. תנאים יותר אופטימליים יכללו במחזור הזרימה למינרית בהעדר המערבולת. זהו, עם זאת, לא ניתן במודל המיוצג כאן ולידיעתנו על מערכת כזו היא לא זמינה עד כה. אמנם, יש כמה מערכות מייקרו-נוזליות זמין מסחרית שאינן ניתן לשלב עם כל דם נמוך עם שום או רמות של נוגד קרישה נוספה למערכת ובכך נכשל כדי לאפשר הערכה נאותה רגישה של יחסי הגומלין בין כל הרכיבים הנמצאים בדם ותאי האנדותל. יתר על כן, חלה עלייה של פי 2 בגיוס של תאי דם לכיוון TNFα מופעל HUVEC בשילוב עם היווצרות הוכפלה של תאת באופן בלתי תלויה בנפח הדם. זה מוודא את יציבות של מערכת המודל וגם מראה את האפשרות להשתמש האנדותל מופעל בשילוב עם כל דם. עתיד על, תא התא האנדותל דם יכול לשמש כדי לחקור גיוס תאי דם לכיוון תאי האנדותל המופעלים על ידי מגוון רחב של סמנים הביעו על תאים בתנאים ובשלבי הפעלה שונים. יתר על כן, המודל יכול לשמש בשילוב עם סוכנים תרופתיים על מנת לבדוק את ההשפעות על מצבים דלקתיים. לסיכום, אנו מציגים את היתרון הגדול של שילוב מודל קאמרי עם תאי דם וכלי דם אנושיים כדי ליצור אדם שלם במערכת חוץ גופית לבצע חקירות רלוונטיות למחלות כלי דם.

שיטות לניתוח אינטראקציות דם וכלי דם במחלות לב וכלי דם, בדרך כלל כרוכות בניסויי מחקר בבעלי החיים. תוצאות שנוצרו במודלים של בעלי חיים מחקר ניסיוניים עשויות, עם זאת, יש לי משמעות קטנה או לא למחלות בבני אדם. 1,2 ככזה, יש צורך בטוב ואמין במודלים חוץ גופית לחקור אינטראקציות הסלולר בין תא הדם ותאי האנדותל של כלי דם ב מערכת כמו בני-. לפיכך, אנו הקמנו מודל תא תא האנדותל דם. זה מבוסס על מודל שתואר קודם לכן לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין חומרים ביולוגיים וכל הדם אנושי. 3 בניגוד במבחנת הגדרות אחרות שבם בדרך כלל מוגבלת מספר הרכיבים מטוהרים, כלומר, טרומבוציטים, כדוריות דם לבנות או תאי האנדותל זמינים, המודל הנוכחי משלב את כל הרכיבים להציג בכלי דם. ההתקנה של ג אנדותל הדםמודל קאמרי ell נועד לאפשר שימוש בדם אדם טרי נמשך עם נוגד קרישה הוסיפה מעט או ללא. הדם המאוחסן בפרקי זמן ארוכים יותר לרכוש כל כך נקרא נגעי אחסון שבו פירוט של אריתרוציטים עלול להפריע לאינטראקציות עדינות בין הדם ותאי האנדותל. 4 כדי להימנע מהיווצרות קריש דם במהלך הטיפול של דם מלא vivo לשעבר דורש גם מינונים גבוהים של נוגדי קרישה או שכל החומר במגע עם דם צריך להיות לא-הפעלה. כמשטחי הפעלה שאינן נדירים בסביבת המעבדה, חומרים עשויים לחלופין להיות מצוידים בשכבת מגן של הפרין המשותק. שכבת המגן של הפרין המשותק (להלן כפי משטח הפרין Corline (CHS)) שניתן להחיל את רוב חומרי יצירת משטח שבו קשר דם יכול להתרחש מבלי לגרום להפעלה של מפל הקרישה. 5 לכן, על ידי ריהוט החדרים עם CHS, ce אנדותל הדםll קאמרי מודל מאפשר שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של נוגדי קרישה בדם. הימנעות התוספת של ריכוזים גבוהים של נוגד קרישה במודל תא אנדותל הדם מאפשרת לחקור אינטראקציות רגישות בתוך כלי דם שעלולים להיות רעול פנים. 6 מודל תא תא האנדותל דם מורכב משני תאים שנוצרו על ידי הצמדת גלילי פלסטיק (גובה: 8 מ&quot;מ; רדיוס: 9 מ&quot;מ) לשקופית מיקרוסקופ פלסטיק. הקצוות פונים כלפי מעלה על הצילינדרים מצוידים בחריצים שמצוידים בטבעות אטימות מגומי המשמשות לאיטום התאים נגד שקופיות תרבית תאים. התאים מלאים באופן חלקי בלבד עם דם כמו האוויר שנשאר בתא שומר דם בתנועה כאשר התאים מסובבים לאחר מכן במצב אנכי (איור 1). על מנת להעריך את התפקוד של המודל, ביצענו ניסויים עם או לחלוטין CHS מצופהתאי תא או טבור אדם וריד האנדותל (HUVEC). שני כרכי דם נפרדים היו assayed והיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין (TAT) מתחמים (סמן עקיף של קרישה) נמדדה עם assay אנזים קשור immunosorbent (ELISA). לאחר מכן, אנו הערכנו את ההשפעה של כמויות דם וגורם נמק גידול (TNFα) מגורה בתאי האנדותל בגיוס לויקוציטים על ידי ניתוח תמונה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> איור 1. הגדרה של מודל תא תא האנדותל דם. (א) למעלה להציג ציור סכמטי של תא הדם שנעשה בPMMA. תאי האנדותל אנושיים יסודיים (ב &#39;) בתרבית על שקופיות קאמריות 1 היטב. כל דם אדם טרי מתווסף לשני תאים בשקופית מיקרוסקופ. מטופלים התאים וכל החומר המשמשים לטיפול בדם עם ציפוי HS מגן. לאחר הסרת קירות לסה&quot;נשקופית תרבות LL, התאים ממוקמות מול הדם והמערכת תהיה סגורה בחוזקה. לאחר מכן תאי תא (C) אנדותל הדם מודגרת תחת סיבוב ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התגובות בתא הדם עשויים להיות מנותחות על ידי ELISA ותאי האנדותל יכולים להיות מנותחים על ידי מיקרוסקופי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

רוב של כל המחלות הידועות מלווים בהפרעות של מערכת הלב וכלי הדם. מחקרים לתוך המורכבות של מסלולי האינטראקציה מופעלים במהלך פתולוגיות לב וכלי דם, עם זאת, מוגבלים על ידי חוסר שיטות חזקות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. על מנת לבנות מודל אירועים של כלי דם פתולוגיים שפיתחנו assay במבחנה לחקר יחסי הגומלין בין האנדותל וכל דם. Assay מורכב של תאים ראשוניים אדם אנדותל, אשר ממוקמים במגע עם דם כל אדם. השיטה משתמשת בדם האם של עם שום או מעט מאוד נוגד קרישה, המאפשרת מחקר של אינטראקציות עדינות בין מרכיבים מולקולריים ותאיים הנמצאים בכלי דם. חקרנו את הפונקציונליות של assay על ידי השוואת הפעלה של קרישת דם במחזורים שונים הודגרו עם או בלי תאים אנושיים טבור אנדותל הווריד (HUVEC). ואילו גדול יותר נפח דם תרם לעלייה בהיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין מתחמים (TAT), נוכחות של HUVEC הביאו הפעלה מופחתת של קרישה. יתר על כן, אנחנו מוחלים ניתוח תמונה של קובץ מצורף לויקוציטים לHUVEC מגורה עם גורם נמק גידול (TNFα) ומצא את נוכחותו של CD16 + תאים להיות גבוה יותר באופן משמעותי על TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאי unstimulated לאחר מגע דם. לסיכום, assay ניתן להחיל ללמוד פתולוגיות כלי דם, שבו אינטראקציות בין האנדותל ותא הדם מוטרדות.

נחיצותו של CHS ציפוי על מנת למדוד את תגובות בכל דם ספציפיים לאלה שהושרו על ידי תאי האנדותל, כל החומרים המשמשים לתא התא האנדותל דם חייבים להיות מרוהטים עם ציפוי CHS לפני השימוש. איור 2 א (משמאל) מראה תא ללא ציפוי אחרי 30 דקות של קשר דם עם מתנת קריש נראית בבירור. טיפול בתא עם CHS (איור 2 א, מימין) ומצד שני מגן על הדם מהפעלה לא מבוקרת, על מנת להבטיח כי התוצאות הן בשל אינטראקציות תא-דם האנדותל. האפקט של נפח הדם בלשכה הפעלה של קרישה היא סבירה יותר בדם קופא על שמריו כהסתברות של אינטראקציה בין גורמי קרישה מופעלים גדלה. במודל תא תא האנדותל דם, דם נשמר בתנועה בשל הזרימה של בועת אוויר בתוך החדר. בoבצו לקבוע את ההשפעה של שינויים בנפח הדם, וכך גם גודל בועת אוויר, חדר CHS מצופה היה קשור לשקופית זכוכית מצופה CHS שנבדקה עם 1.5 מיליליטר או 1.75 מיליליטר דם כל למשך 30 דקות. נפח דם ללא כל תנועה על ידי בועות האוויר הוא גדולים פי 2.5 כאשר 1.75 מיליליטר של דם נוסף לחדר לעומת כאשר 1.5 מיליליטר של דם משמש (איור 2). TAT-הערכים הנמדדים הציעו מוגברים TAT-היווצרות עם עליית נפח דם (איור 2 ד). כאשר HUVEC (איור 2 ג) הודגרו עם או 1.5 או 1.75 מיליליטר של דם מלא, אין הבדל צוין בין שתי הקבוצות, מצביע על כך שתאי האנדותל עשויים לווסת את ההפעלה של קרישה (איור 2 ד). האפקט של TNFα על גיוס תא דם וההפעלה של קרישה על מנת לחקור את ההשפעה של TNFα על גיוס לויקוציטים, HUVEC היה תענוגאד עם 20 ng / ml TNFα 4 שעות לפני מגע דם. קשר דם - גם עם 1.5 מיליליטר או 1.75 מיליליטר דם - היה נמשך 30 דקות לאחר ששקופיות התרבות היו מוכתמות עבור CD16 (איור 2F), צילם ומספר CD16 + התאים היה לכמת. הגיוס של CD16 + תאים גדל באופן משמעותי עם טיפול TNFα (2E איור) 100-256 CD16 + תאים / מ&quot;מ 2 (p &lt;0.0001) עם 1.5 מיליליטר דם ו172-378 (P &lt;0.0001) עם 1.75 מיליליטר דם. ההיווצרות של קומפלקסי TAT נמדדה בדגימות הפלזמה המקבילה של הדם הודגרו עם תאים או טופל TNFα או מטופלים (איור 2G). תאי TNFα מגורה מושרה הכפלה משוערת של מתחמי TAT בהשוואה לתאים שלא טופלו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> איוריור 2: פונקציונליות של מודל תא תא האנדותל דם. צ&#39;יימברס () עם או בלי CHS הודגרו עם כל דם. ללא CHS, קריש נוצר לאחר 30 דקות. מדידה של תרומבין-באנטי-טרומבין מתחמים (TAT), סמן עקיף של קרישה, בדם מודגרות ללא CHS הייתה&gt; 6,000 מיקרוגרם / מיליליטר. (ב) נפח דם לא המשיך לנוע על ידי בועות האוויר מסתובבות ישתנה עם כמויות דם שונות. עם התוספת של 1.5 מיליליטר של דם, נפח זה יהיה 0.3 מיליליטר, ואילו זה יגדל ל 0.74 מיליליטר בתוספת של 1.75 מיליליטר. (ג) HUVEC הדמיה עם מורפולוגיה תכנית מיקרוסקופ לעומת שלב טיפוסי תא האנדותל של monolayer ומחוברות לפני קשר דם. (ד) ערכי TAT לתאים לחלוטין CHS מצופים מראים הבדל קטן כאשר כמויות דם שונות מתווספות. התוספת של 1.5 מיליליטר דם הביאה 35 ± 11 מיקרוגרם / מיליליטר (n = 7) בהשוואה לרמה של 1.75 מיליליטר, אשר הביא 8577; 70 מיקרוגרם / מיליליטר TAT (n = 8). הבדל זה הוא כבר לא נוכח בעת HUVEC מודגרת עם אותו נפח הדם; 66 ± 55 מיקרוגרם / מיליליטר עבור 1.5 מיליליטר (n = 5) ו -66 ± 29 מיקרוגרם / מיליליטר עבור 1.75 מיליליטר (n = 7). כימות (ה) למספר CD16 + התאים נוכחי משני unstimulated או TNFα מגורה HUVECs לאחר קשר דם. מספר CD16 + התאים גדל באופן משמעותי עם TNFα מגורה תאים מודגרות גם עם 1.5 מיליליטר (basal: 100 ± 40 תאים / מ&quot;מ; TNFα: 256 ± 121 תאים / מ&quot;מ) או 1.75 מיליליטר (basal: 172 ± 67 תאים / מ&quot;מ; TNFα: 378 ± 185 תאים / מ&quot;מ) של דם מלא (, CD16 (ירוק) ו DAPI (כחול) F) נציג תמונות של unstimulated וTNFα מגורה HUVEC מוכתם עבור phalloidin (אדום).. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר (G) ההיווצרות של קומפלקסי תאת הוכפלה על ידי TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאים שלא טופלו הודגרו עם דם (1.5 מיליליטר:. 2.1 ± 0.1 פעמים יותר TAT, n = 3; 1.75 מיליליטר: פי 1.7 ± 1.0 יותר TAT, n = 4). כל הערכים מוצגים כ± הממוצע סטיית תקן; ערכי p חושבו על ידי בדיקות t מזווגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Views.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Video: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes<em&gt; במבחנה</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

רומן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

Keratitis חוזר herpetic סטרומה בעכברים, מודל ללימוד HSK אנוש

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

פיתוח זיהוי של subpopulation רומן של אדם נויטרופילים הנגזר הענק Phagocytes

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים