Name: a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמועצה השבדית למחקר (90293501, A0290401, A0290402), השביעית תכנית המסגרת של הקהילה האירופית במסגרת הסכם מענק N ° 602,699 (Direkt), קרן NovoNordisk, Brunnberg קרן Gurli ואדוארד, גזע תרפיה, Vleugel קרן וÅke Wiberg קרן.

הערה: דם נשאב מאנשים בריאים על ידי venipuncture מערכת הפתוח באישור בועדת האתיקה הסקירה באופסלה (הרשאה מס &#39;2008/264). 1. זריעת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים אנושיים עיקריים וריד טבור אנדותל (HUVEC) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 בצלוחיות T75 מצופים בג&#39;לטין 1% ב- pH 7.4 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני תרבות מבקבוק T75 המכיל HUVEC (או סוג אחר של תאי האנדותל אנושיים ראשוניים) ולשטוף את התאים עם 2.1 mM EDTA בpH PBS 7.4. ניתוק תאים על ידי הוספת 1 מיליליטר 0.25% טריפסין-EDTA ודוגר במשך 2 - 3 דקות ב -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים על ידי שטיפת הבקבוק עם FBS 9 מיליליטר 10% ב- pH 7.4 PBS ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 15 מיליליטר. ספין למטה התאים ב 735 XG למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה בזהירות בכלי דם בינוני צמיחת תאי אנדותל (EC GMMV) ולספור את התאים בתא &quot;שודד גופות. זרעי 21,000 גאמות / 2 סנטימטר בשקופיות תרבית תאי 1 היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס. HUVEC יהיה מחובר אחרי 1 - 2 ימים של התרבות. צג המורפולוגיה של תאי confluency יומי תחת מיקרוסקופ אור. </li></ol> 2. הכנה של דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל המשטחים המלאכותיים שיהיו במגע עם דם בשכבה כפולה של הפרין המשותק (CHS) על פי הוראות היצרן. חומרים מצופים CHS המוגן מפני אבק יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד 6 חודשים ללא הפסד של פונקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש venipuncture מערכת הפתוח עד זוב דם מתורם בריא זמן קצר (&lt;30 דקות) לפני תחילת ניסוי תא אנדותל דם. זוג מחט מזרק (18 G x 50 מ&quot;מ) לצינורות CHS סיליקון המצופה (קוטר פנימי: 2 מ&quot;מ) לפני האיסוף בזהירות דם בצינור מיליליטר 50 CHS מצופה. דם מוסף עם הפרין unfractionated להגיע לריכוז סופי של 0.75 IU / ml. מערבבים את הדם בעדינות על ידי inverting הצינור 2 - 3 פעמים. </li></ol> דגם 3. דם האנדותל הלשכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק תאי דם (איור 1 א; מבט מלמעלה) בmethacrylate אקריליק polymethyl (PMMA) מורכב משני צילינדרים (גובה 8 מ&quot;מ ורדיוס 9 מ&quot;מ) שמודבקים לשקופית PMMA (25 x 75 מ&quot;מ). התאם את הקצוות של הגלילים כלפי מעלה עם טבעות אטימות מגומי כדי לאטום את חדר הדם נגד שקופיות זכוכית עם תאים בתרבית האנדותל (איור 1). סובב את תאי דם הקשורים לשקופית התרבות עם תאי האנדותל לאחר מכן במצב אנכי (תרשים 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בקצה פיפטה CHS מצופה להעביר 1.5 מיליליטר דם לכל CHS המצופה בלטפל קאמרי שלא להפעיל את הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דם 1 מיליליטר לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 30 μl 0.34 ח&quot;כ 3 EDTA להגיע ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ K EDTA 3 לקביעת ריכוזי חלבון פלזמה הראשונית באמצעותאנזים קשור assay immunosorbent (ELISA). לערבב בזהירות את הדם ולשמור על הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קירות הפלסטיק של שקופיות זכוכית תרבית תאים על פי הוראות יצרן ובזהירות לשטוף את התאים בpH PBS 7.4. הקפד להסיר לאחר מכן הרבה נוזלים ככל האפשר מהשקופיות. אל תתנו לתאים להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף על גבי תאי הדם, תאים מול הדם. אבטח את השקופיות על ידי הצבת מהדק סביב תא התא האנדותל דם. השתמש בשקופית פלסטיק לתמיכה נוספת כדי למנוע שבירה של שקופיות זכוכית תרבית תאים בעת ביצוע המהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את תא התא האנדותל דם על גלגל מסתובב (40 סנטימטרים קוטר) מקום באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. סובב כל תא בגלגל ברמה של 0.5 XG למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לפרק את תא התא האנדותל דם. שטוף את שקופיות תרבית התאים בpH PBS 7.4 ולתקן את התאים בparaformaldehyde 1% קרים כקרח (PFA) ואו 10 דקות. העברת דם מיליליטר 1 מכל תא לmicrocentrifuge צינורות המכילים 30 μl 0.34 EDTA ח&quot;כ 3 כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mM EDTA K 3 ולערבב בעדינות את הצינורות. שמור את הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב4,560 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר את הפלזמה הדם לצינורות microcentrifuge חדשים וחנות ב-70 ° C עד לניתוח נוסף. </li></ol> 4. ניתוח של דם האנדותל אינטראקציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מכתים immunofluorescent עם CD16 אנטי אנושי בעכבר ואחריו עז משניים אנטי העכבר Alexa 488 וphalloidin-TexasRed. בצע כל שלב צביעה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר ולשטוף את השקופיות בpH PBS 7.4 בין כל שלב ושלב. Counterstain הגרעינים עם DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. ניתוח מרכיבי דם קשור לתאי האנדותל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם ניתוח תמונה באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה כגון CellProfiler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantify התגובות בתא הדם עם תרומבין-באנטי-טרומבין (TAT) ELISA לפי הוראות יצרן של דגימות הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים סטטיסטיים מתאימים, לדוגמא., מבחן t מזווג, כדי לנתח את הנתונים. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> אינטראקציות רבות בין הדם ודופן כלי דם הן בדרך כלל נשמרו במצב שקט בשל האופי הלא דביק ואנטי-טרומבוטיים של האנדותל. 7 במצבים פתולוגיים כוללים דלקת, האנדותל מופעל עם עלייה וכתוצאה מכך ביטוי הקולטן הידבקות 8 ו יכולת מופחתת לעכב עצירת דימום. 9 הפעלה של מערכות המפל בדם בתורו מגבירה את thrombogenicity של האנדותל גורמת גיוס פקקת וויקוציטים נוספים. 10 כדי להשיג הבנה טובה יותר של יחסי גומלין עדינים בין תאי האנדותל וכל דם, שיש לנו פיתח רומן בשיטה חוץ גופית שבו תאי אנדותל בתרבית ממוקמים במגע עם דם כל. למיטב ידיעתנו, ההגדרה שלנו היא הראשון שהראתה תאי האנדותל מודגרות עם כל דם אנושי עם שום או נוגד קרישה מעט מאוד לתקופות זמן ארוכות יותר. NT &quot;&gt; הרגישות של מערכת זו מופעלת על ידי venipuncture מערכת הפתוח בשילוב עם שכבת המגן של הפרין משותק על כל המשטחים הונחו במגע עם דם. השימוש במערכת פתוחה ברכש דם מפחיתה את ההפעלה של מערכות המפל במהלך venipuncture תוך התרת השימוש בסכום שנקבע עצמי של נוגדי קרישה. ייתכן, עם זאת, לשמש צינורות דם פונו זמינים מסחרי בהתאם לנקודות הקצה המיועדים של המחקר. הריכוז הסופי של נוגד קרישה הוסיף לצינורות מערכת הסגורים ביותר הזמינים מסחרי עלולים לעכב רגיש , ואחרת קשה ללמוד, אינטראקציות בהתקנה. 6 משטח הפרין מגן נוסף מבטל הפעלה של דם דרך שטח מגע על ידי כל משטחים אחרים מאשר תאי האנדותל. 5 ואכן, דגירה של דם מלא בתוספת כמות קטנה של הפרין unfractionated ב חדר ללא ההגנה של CHS הביא להיווצרות קרישים. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; בועת האוויר בתוך החדר מאפשרת ערבוב של הדם במהלך דגירה עם תאי האנדותל. על מנת להעריך את ההשפעה של גודל בועת האוויר, השתמשנו בשני כרכי דם שונים. במודל זה, מדדנו רמות TAT דומות ללא קשר לגודל בועת אוויר בתאים הודגרו עם HUVEC. TAT היה, לעומת זאת, גדל עם גודל בועת האוויר קטן יותר ברגישות היתר לאלרגיה באופן מלא טופל תאים. זה, בהתאם למאפייני תא אנדותל שתוארו קודם לכן 11, מצביע על השפעה רגולציה על ההפעלה המוגברת של קרישה הניתנת על ידי תאי האנדותל שחסר בחדר CHS אינרטי. בועת האוויר במערכת יוצרת זרימה על מחזור של החדר. גודלה של הבועה ישפיע על הכוחות בתוך מערכת זו מסתובבת. זה מוצג על ידי התוצאות שלנו באיור 2 ד היו בועה קטנה יוצרת ערכי TAT גבוהים המייצגים כוח ירד על כלומר הדם, זרימת הדםבתוך התא הוא נמוך יותר ובכך שהפעיל מערכת המפל מתרחש למידה גבוהה יותר. יש לציין כי במערכת זו אנו יוצרים זרימה מסתובבת שתהיה שונים במהירות על פני החדר עם המהירות הגבוהה ביותר לאורך הקירות, והנמוך ביותר במרכז. זה כמובן לא סביבה אופטימלית בכל קשורה לזרימה ולחץ גזירה לתאי אנדותל, אבל עדיין יש לנו מערכת הפקת תוצאות יציבה ודיר. תנאים יותר אופטימליים יכללו במחזור הזרימה למינרית בהעדר המערבולת. זהו, עם זאת, לא ניתן במודל המיוצג כאן ולידיעתנו על מערכת כזו היא לא זמינה עד כה. אמנם, יש כמה מערכות מייקרו-נוזליות זמין מסחרית שאינן ניתן לשלב עם כל דם נמוך עם שום או רמות של נוגד קרישה נוספה למערכת ובכך נכשל כדי לאפשר הערכה נאותה רגישה של יחסי הגומלין בין כל הרכיבים הנמצאים בדם ותאי האנדותל. יתר על כן, חלה עלייה של פי 2 בגיוס של תאי דם לכיוון TNFα מופעל HUVEC בשילוב עם היווצרות הוכפלה של תאת באופן בלתי תלויה בנפח הדם. זה מוודא את יציבות של מערכת המודל וגם מראה את האפשרות להשתמש האנדותל מופעל בשילוב עם כל דם. עתיד על, תא התא האנדותל דם יכול לשמש כדי לחקור גיוס תאי דם לכיוון תאי האנדותל המופעלים על ידי מגוון רחב של סמנים הביעו על תאים בתנאים ובשלבי הפעלה שונים. יתר על כן, המודל יכול לשמש בשילוב עם סוכנים תרופתיים על מנת לבדוק את ההשפעות על מצבים דלקתיים. לסיכום, אנו מציגים את היתרון הגדול של שילוב מודל קאמרי עם תאי דם וכלי דם אנושיים כדי ליצור אדם שלם במערכת חוץ גופית לבצע חקירות רלוונטיות למחלות כלי דם.

שיטות לניתוח אינטראקציות דם וכלי דם במחלות לב וכלי דם, בדרך כלל כרוכות בניסויי מחקר בבעלי החיים. תוצאות שנוצרו במודלים של בעלי חיים מחקר ניסיוניים עשויות, עם זאת, יש לי משמעות קטנה או לא למחלות בבני אדם. 1,2 ככזה, יש צורך בטוב ואמין במודלים חוץ גופית לחקור אינטראקציות הסלולר בין תא הדם ותאי האנדותל של כלי דם ב מערכת כמו בני-. לפיכך, אנו הקמנו מודל תא תא האנדותל דם. זה מבוסס על מודל שתואר קודם לכן לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין חומרים ביולוגיים וכל הדם אנושי. 3 בניגוד במבחנת הגדרות אחרות שבם בדרך כלל מוגבלת מספר הרכיבים מטוהרים, כלומר, טרומבוציטים, כדוריות דם לבנות או תאי האנדותל זמינים, המודל הנוכחי משלב את כל הרכיבים להציג בכלי דם. ההתקנה של ג אנדותל הדםמודל קאמרי ell נועד לאפשר שימוש בדם אדם טרי נמשך עם נוגד קרישה הוסיפה מעט או ללא. הדם המאוחסן בפרקי זמן ארוכים יותר לרכוש כל כך נקרא נגעי אחסון שבו פירוט של אריתרוציטים עלול להפריע לאינטראקציות עדינות בין הדם ותאי האנדותל. 4 כדי להימנע מהיווצרות קריש דם במהלך הטיפול של דם מלא vivo לשעבר דורש גם מינונים גבוהים של נוגדי קרישה או שכל החומר במגע עם דם צריך להיות לא-הפעלה. כמשטחי הפעלה שאינן נדירים בסביבת המעבדה, חומרים עשויים לחלופין להיות מצוידים בשכבת מגן של הפרין המשותק. שכבת המגן של הפרין המשותק (להלן כפי משטח הפרין Corline (CHS)) שניתן להחיל את רוב חומרי יצירת משטח שבו קשר דם יכול להתרחש מבלי לגרום להפעלה של מפל הקרישה. 5 לכן, על ידי ריהוט החדרים עם CHS, ce אנדותל הדםll קאמרי מודל מאפשר שימוש בריכוזים נמוכים מאוד של נוגדי קרישה בדם. הימנעות התוספת של ריכוזים גבוהים של נוגד קרישה במודל תא אנדותל הדם מאפשרת לחקור אינטראקציות רגישות בתוך כלי דם שעלולים להיות רעול פנים. 6 מודל תא תא האנדותל דם מורכב משני תאים שנוצרו על ידי הצמדת גלילי פלסטיק (גובה: 8 מ&quot;מ; רדיוס: 9 מ&quot;מ) לשקופית מיקרוסקופ פלסטיק. הקצוות פונים כלפי מעלה על הצילינדרים מצוידים בחריצים שמצוידים בטבעות אטימות מגומי המשמשות לאיטום התאים נגד שקופיות תרבית תאים. התאים מלאים באופן חלקי בלבד עם דם כמו האוויר שנשאר בתא שומר דם בתנועה כאשר התאים מסובבים לאחר מכן במצב אנכי (איור 1). על מנת להעריך את התפקוד של המודל, ביצענו ניסויים עם או לחלוטין CHS מצופהתאי תא או טבור אדם וריד האנדותל (HUVEC). שני כרכי דם נפרדים היו assayed והיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין (TAT) מתחמים (סמן עקיף של קרישה) נמדדה עם assay אנזים קשור immunosorbent (ELISA). לאחר מכן, אנו הערכנו את ההשפעה של כמויות דם וגורם נמק גידול (TNFα) מגורה בתאי האנדותל בגיוס לויקוציטים על ידי ניתוח תמונה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> איור 1. הגדרה של מודל תא תא האנדותל דם. (א) למעלה להציג ציור סכמטי של תא הדם שנעשה בPMMA. תאי האנדותל אנושיים יסודיים (ב &#39;) בתרבית על שקופיות קאמריות 1 היטב. כל דם אדם טרי מתווסף לשני תאים בשקופית מיקרוסקופ. מטופלים התאים וכל החומר המשמשים לטיפול בדם עם ציפוי HS מגן. לאחר הסרת קירות לסה&quot;נשקופית תרבות LL, התאים ממוקמות מול הדם והמערכת תהיה סגורה בחוזקה. לאחר מכן תאי תא (C) אנדותל הדם מודגרת תחת סיבוב ב -37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התגובות בתא הדם עשויים להיות מנותחות על ידי ELISA ותאי האנדותל יכולים להיות מנותחים על ידי מיקרוסקופי.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

רוב של כל המחלות הידועות מלווים בהפרעות של מערכת הלב וכלי הדם. מחקרים לתוך המורכבות של מסלולי האינטראקציה מופעלים במהלך פתולוגיות לב וכלי דם, עם זאת, מוגבלים על ידי חוסר שיטות חזקות ורלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. על מנת לבנות מודל אירועים של כלי דם פתולוגיים שפיתחנו assay במבחנה לחקר יחסי הגומלין בין האנדותל וכל דם. Assay מורכב של תאים ראשוניים אדם אנדותל, אשר ממוקמים במגע עם דם כל אדם. השיטה משתמשת בדם האם של עם שום או מעט מאוד נוגד קרישה, המאפשרת מחקר של אינטראקציות עדינות בין מרכיבים מולקולריים ותאיים הנמצאים בכלי דם. חקרנו את הפונקציונליות של assay על ידי השוואת הפעלה של קרישת דם במחזורים שונים הודגרו עם או בלי תאים אנושיים טבור אנדותל הווריד (HUVEC). ואילו גדול יותר נפח דם תרם לעלייה בהיווצרות של אנטי-טרומבין תרומבין מתחמים (TAT), נוכחות של HUVEC הביאו הפעלה מופחתת של קרישה. יתר על כן, אנחנו מוחלים ניתוח תמונה של קובץ מצורף לויקוציטים לHUVEC מגורה עם גורם נמק גידול (TNFα) ומצא את נוכחותו של CD16 + תאים להיות גבוה יותר באופן משמעותי על TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאי unstimulated לאחר מגע דם. לסיכום, assay ניתן להחיל ללמוד פתולוגיות כלי דם, שבו אינטראקציות בין האנדותל ותא הדם מוטרדות.

נחיצותו של CHS ציפוי על מנת למדוד את תגובות בכל דם ספציפיים לאלה שהושרו על ידי תאי האנדותל, כל החומרים המשמשים לתא התא האנדותל דם חייבים להיות מרוהטים עם ציפוי CHS לפני השימוש. איור 2 א (משמאל) מראה תא ללא ציפוי אחרי 30 דקות של קשר דם עם מתנת קריש נראית בבירור. טיפול בתא עם CHS (איור 2 א, מימין) ומצד שני מגן על הדם מהפעלה לא מבוקרת, על מנת להבטיח כי התוצאות הן בשל אינטראקציות תא-דם האנדותל. האפקט של נפח הדם בלשכה הפעלה של קרישה היא סבירה יותר בדם קופא על שמריו כהסתברות של אינטראקציה בין גורמי קרישה מופעלים גדלה. במודל תא תא האנדותל דם, דם נשמר בתנועה בשל הזרימה של בועת אוויר בתוך החדר. בoבצו לקבוע את ההשפעה של שינויים בנפח הדם, וכך גם גודל בועת אוויר, חדר CHS מצופה היה קשור לשקופית זכוכית מצופה CHS שנבדקה עם 1.5 מיליליטר או 1.75 מיליליטר דם כל למשך 30 דקות. נפח דם ללא כל תנועה על ידי בועות האוויר הוא גדולים פי 2.5 כאשר 1.75 מיליליטר של דם נוסף לחדר לעומת כאשר 1.5 מיליליטר של דם משמש (איור 2). TAT-הערכים הנמדדים הציעו מוגברים TAT-היווצרות עם עליית נפח דם (איור 2 ד). כאשר HUVEC (איור 2 ג) הודגרו עם או 1.5 או 1.75 מיליליטר של דם מלא, אין הבדל צוין בין שתי הקבוצות, מצביע על כך שתאי האנדותל עשויים לווסת את ההפעלה של קרישה (איור 2 ד). האפקט של TNFα על גיוס תא דם וההפעלה של קרישה על מנת לחקור את ההשפעה של TNFα על גיוס לויקוציטים, HUVEC היה תענוגאד עם 20 ng / ml TNFα 4 שעות לפני מגע דם. קשר דם - גם עם 1.5 מיליליטר או 1.75 מיליליטר דם - היה נמשך 30 דקות לאחר ששקופיות התרבות היו מוכתמות עבור CD16 (איור 2F), צילם ומספר CD16 + התאים היה לכמת. הגיוס של CD16 + תאים גדל באופן משמעותי עם טיפול TNFα (2E איור) 100-256 CD16 + תאים / מ&quot;מ 2 (p &lt;0.0001) עם 1.5 מיליליטר דם ו172-378 (P &lt;0.0001) עם 1.75 מיליליטר דם. ההיווצרות של קומפלקסי TAT נמדדה בדגימות הפלזמה המקבילה של הדם הודגרו עם תאים או טופל TNFα או מטופלים (איור 2G). תאי TNFα מגורה מושרה הכפלה משוערת של מתחמי TAT בהשוואה לתאים שלא טופלו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> איוריור 2: פונקציונליות של מודל תא תא האנדותל דם. צ&#39;יימברס () עם או בלי CHS הודגרו עם כל דם. ללא CHS, קריש נוצר לאחר 30 דקות. מדידה של תרומבין-באנטי-טרומבין מתחמים (TAT), סמן עקיף של קרישה, בדם מודגרות ללא CHS הייתה&gt; 6,000 מיקרוגרם / מיליליטר. (ב) נפח דם לא המשיך לנוע על ידי בועות האוויר מסתובבות ישתנה עם כמויות דם שונות. עם התוספת של 1.5 מיליליטר של דם, נפח זה יהיה 0.3 מיליליטר, ואילו זה יגדל ל 0.74 מיליליטר בתוספת של 1.75 מיליליטר. (ג) HUVEC הדמיה עם מורפולוגיה תכנית מיקרוסקופ לעומת שלב טיפוסי תא האנדותל של monolayer ומחוברות לפני קשר דם. (ד) ערכי TAT לתאים לחלוטין CHS מצופים מראים הבדל קטן כאשר כמויות דם שונות מתווספות. התוספת של 1.5 מיליליטר דם הביאה 35 ± 11 מיקרוגרם / מיליליטר (n = 7) בהשוואה לרמה של 1.75 מיליליטר, אשר הביא 8577; 70 מיקרוגרם / מיליליטר TAT (n = 8). הבדל זה הוא כבר לא נוכח בעת HUVEC מודגרת עם אותו נפח הדם; 66 ± 55 מיקרוגרם / מיליליטר עבור 1.5 מיליליטר (n = 5) ו -66 ± 29 מיקרוגרם / מיליליטר עבור 1.75 מיליליטר (n = 7). כימות (ה) למספר CD16 + התאים נוכחי משני unstimulated או TNFα מגורה HUVECs לאחר קשר דם. מספר CD16 + התאים גדל באופן משמעותי עם TNFα מגורה תאים מודגרות גם עם 1.5 מיליליטר (basal: 100 ± 40 תאים / מ&quot;מ; TNFα: 256 ± 121 תאים / מ&quot;מ) או 1.75 מיליליטר (basal: 172 ± 67 תאים / מ&quot;מ; TNFα: 378 ± 185 תאים / מ&quot;מ) של דם מלא (, CD16 (ירוק) ו DAPI (כחול) F) נציג תמונות של unstimulated וTNFα מגורה HUVEC מוכתם עבור phalloidin (אדום).. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר (G) ההיווצרות של קומפלקסי תאת הוכפלה על ידי TNFα מגורה תאים בהשוואה לתאים שלא טופלו הודגרו עם דם (1.5 מיליליטר:. 2.1 ± 0.1 פעמים יותר TAT, n = 3; 1.75 מיליליטר: פי 1.7 ± 1.0 יותר TAT, n = 4). כל הערכים מוצגים כ± הממוצע סטיית תקן; ערכי p חושבו על ידי בדיקות t מזווגים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.4K Views.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Video: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Bioengineering

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

התמיינות וגירוי מכני של תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

מחבר זרקור: חקר תאי אנדותל שמקורם ב-hiPSC בתרבית תחת גירוי מכני בתיווך פלואיד 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Developmental Biology

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Medicine

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

רומן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת